SICUREZZA E QUALITÀ DEL RISO ITALIANO PER UNA PRODUZIONE PIÙ COMPETITIVA (SIQURISO)

1 Regione Lombardia Programma regionale di ricerca in campo agricolo SICUREZZA E QUALITÀ DEL RISO ITALIANO PER UNA PRODUZIONE PIÙ COMPETITIVA (SIQURISO) Coordinatore: Prof. Mirella Sari Gorla, Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Università degli Studi di Milano (UNIMI-DSBB) Partners: Prof. Carlo Soave, Dipartimento di Biologia, Università degli Studi di Milano (Unità di Ricerca UNIMI-BIO1) Prof. Lucia Colombo, Dipartimento di Biologia, Università degli Studi di Milano (Unità di Ricerca UNIMI-BIO2) Prof. Gianattilio Sacchi, Dipartimento di Produzione Vegetale, Università degli Studi di Milano (Unità di Ricerca UNIMI- DIPROVE) Dott. Marco Romani, Ente Nazionale Risi, Centro Ricerche sul Riso (Unità di Ricerca ENR) Dott. Roberto Tortolina, Riso Gallo SpA Dott.ssa Michela Martinotti, Lugano Leonardo SRL (Unità di Ricerca Lugano) RELAZIONE FINALE SULL ATTIVITA SVOLTA L obbiettivo generale perseguito nel presente progetto era il miglioramento del riso prodotto in Italia, sia sotto l aspetto della sicurezza alimentare e sia per caratteristiche qualitative. In particolare, ci si è proposti di individuare caratteristiche qualitative legate all assorbimento, traslocazione e stoccaggio di Cadmio e Ferro nelle principali varietà di riso coltivate in Italia, oltre che nel germoplasma disponibile sia italiano e sia di altri paesi; di identificare i meccanismi fisiologici e i fattori genetici alla base dei caratteri che conferiscono alla pianta la capacità di escludere Cd dalla granella senza interferire con il contenuto in Fe; di introdurre nuovi fattori di qualità in varietà italiane di riso e adattare varietà asiatiche di interesse alle condizioni ambientali italiane. Di seguito si riportano i risultati raggiunti in relazione a ciascuna delle attività previste. A. Studio della variabilità A.1. Esplorazione della variabilità esistente nel germoplasma di riso per il carattere ripartizione di Cd e Fe fra radice e germoglio A.1.1.Prove varietali in ambiente controllato e confronto tra agrotecniche Nel corso del progetto l UR UNIMI-DIPROVE ha condotto uno screening tra le varietà di riso più comunemente allevate in Lombardia, e più in generale negli areali italiani, per il carattere capacità di accumulo del Cd in granella. A tale scopo, con prove ripetute nei tre anni, sono state analizzate complessivamente 17 varietà (14 appartenenti alla sottospecie japonica e 3 alla

2 sottospecie indica). Le piante sono state allevate, sino a maturità, in vasi contenenti un suolo di risaia subacido a medio impasto (Tabella 1, suolo A) prelevato in provincia di Milano in una zona rivelatasi negli ultimi anni a rischio per i livelli raggiunti dal Cd nella granella. Le prove varietali sono state condotte in serra (Figura 1), secondo uno schema a blocchi randomizzati, allevando ogni anno ciascuna varietà in almeno 4 vasi (25 piante per vaso) in condizioni di sommersione del terreno. Il contenuto in Cd totale del suolo (circa 2,0 mg kg -1 ) ed in particolare l ammontare della frazione biodisponibile (EDTA estraibile circa 1,2 mg kg -1 ) è risultato nettamente al di sopra dei valori medi riscontrabili nei terreni agrari. Figura 1. Prove varietali in serra. A maturazione delle pannocchie (umidità inferiore al 12%), le cariossidi liberate dalle glumelle erano macinate e le farine mineralizzate in forno a micro-onde. La crescita in serra non determina effetti significativi sui principali caratteri produttivi (indice di accestimento, culmi fertili, peso dei mille) delle diverse varietà. Tuttavia, per tutte le varietà si è assistito ad un prolungamento del periodo semina-maturazione pari a 5-7 giorni. Nell ambito dei 17 genotipi allevati in condizioni di sommersione si è riscontrata una spiccata variabilità nel contenuto in Cd della granella prodotta. Le cultivar possono essere suddivise, relativamente al loro livello di accumulo, in gruppi. Al primo gruppo, caratterizzato da accumuli di Cd elevati (>3,0-2,0 mg kg -1 ) appartengono le cultivar Loto, Gladio e Nembo; al secondo gruppo di capacità di accumulo media (<2,0-1 mg kg -1 ) appartengono Flipper, Vialone nano e Ariete; al terzo gruppo di capacità medio bassa (<1-0,6 mg kg -1 ) appartengono S. Andrea, Thai bonnet e Saturno; al quarto gruppo con capacità di esclusione medio-alta (< 0,6-0,2 mg kg -1 ) appartengono Carnaroli, Arborio, Lido e Volano; al gruppo a più alta capacità di esclusione (< 0,2 mg kg -1 ) appartengono Baldo, Roma, Selenio e Balilla (Figura 2).

3 Tabella 1. Caratteristiche chimico-fisiche dei suoli utilizzati. Figura 2. Quadro sintetico delle capacità relative di esclusione del Cd dalla granella delle cultivar di riso analizzate dopo crescita su suolo A sommerso. Lettere diverse indicano differenze significative fra i gruppi (p < 0,05) Nel corso del secondo anno lo screening varietale è stato condotto su un numero inferiore di varietà (Loto, Nembo, Gladio, Lido, Baldo, Roma, Carnaroli e Volano) anche utilizzando un suolo di risaia fornito dall Ente Nazionale Risi (suolo B, Tabella 1) caratterizzato da un contenuto

4 in Cd (0,61 mg kg -1 ) nettamente inferiore a quello del suolo A e, soprattutto, con una frazione biodisponibile molto più bassa (EDTA estraibile 0,27 mg kg -1 ). Anche in questo caso le piante erano cresciute in condizioni di suolo sommerso. I livelli di Cd nella granella di tutte le varietà sono risultati drasticamente inferiori rispetto alla prova su suolo più contaminato. La suddivisione in classi di capacità di esclusione risultava confermata, anche se in nessun caso è stato superato il limite di 0,2 mg kg -1 ; tuttavia, le diverse varietà si sono raggruppate esattamente come nel caso della crescita sul suolo a contaminazione maggiore. La crescita delle piante in ambiente controllato sul suolo A mantenuto in condizioni di asciutta (60-70% della capacità idrica massima) determina in tutte le cultivar aumenti significativi della concentrazione del Cd in granella rispetto ai valori misurati applicando la sommersione. Gli incrementi sono molto più evidenti (+500-800%) nelle varietà che in sommersione mantengono relativamente bassi i livelli del metallo, mentre sono più contenuti (+30-50%), se non addirittura inesistenti (Nembo), per le varietà che in sommersione manifestano gli accumuli più consistenti. Ne deriva che in asciutta i raggruppamenti delineati in sommersione risultano meno definiti, pur rimanendo Gladio, Loto e Nembo le cultivar a maggior accumulo e Lido, Baldo, Carnaroli e Roma quelle a minor accumulo. Anche nel caso del suolo B l asciutta induce un maggior accumulo di Cd in granella, al punto che anche su questo suolo alcune varietà (Loto, Nembo e Gladio) superano il limite massimo consentito per la concentrazione del Cd nella granella. In entrambe le condizioni colturali, con l eccezione delle cultivar della sottospecie indica, è riscontrabile l esistenza di una correlazione lineare negativa (r = -0,78) tra la durata del periodo semina-maturazione e il contenuto di Cd nella cariosside. In particolare le varietà più precoci che raggiungono la maturità dopo meno di 140 giorni dalla semina mostrano livelli di metallo in granella nettamente superiori rispetto alle varietà meno precoci. La stessa correlazione, anche se meno stretta (r = -0,67), è rilevabile anche nel caso della crescita in asciutta. Dai confronti tra i contenuti di Cd in granella e quelli dei metalli microelementi essenziali (Zn, Fe e Mn) è stato possibile dimostrare l esistenza di una elevata correlazione tra Cd e Zn sia in sommersione (r = 0,98) ) sia in asciutta (r = 0,93), tra Cd e Mn sia in sommersione (r = 0,93) sia in asciutta (r = 0,94), ed una mancanza di correlazione tra Cd e Fe in entrambe le condizioni di allevamento. Per quanto riguarda invece i macronutrienti (N, S, P e K), non è riscontrabile alcuna associazione tra i loro livelli e quelli raggiunti dal Cd. I contenuti in Cd delle foglie bandiera e delle glumette delle singole varietà, indipendentemente dalla condizione idrica del suolo, sono strettamente correlati ai valori che il metallo raggiunge nella granella. In altri termini, nelle varietà a maggior accumulo le concentrazioni di Cd nella foglia bandiera e nelle glumette sono più elevate che nelle varietà a basso accumulo. La medesima osservazione vale per Zn e Mn. Nelle prime fasi dello sviluppo delle piante di riso (sin allo stadio di sesta foglia) cresciute su suolo, la concentrazione che il Cd raggiunge nel germoglio delle diverse varietà non sembra del tutto indicativa dell entità del successivo accumulo in granella. Solo nelle ultime fasi dello sviluppo, e in modo evidente solo nella foglia bandiera, la concentrazione del metallo negli organi vegetativi risulta maggiore nelle cultivar a più elevato accumulo in cariosside. Allevando plantule (sino allo stadio di IV foglia) in soluzioni idroponiche addizionate con Cd (0,01, 0,1 o 1 M) si giunge invece ad una conclusione diversa. Infatti le concentrazioni raggiunte dal Cd nelle radici e nelle foglie delle varietà ad alto accumulo in granella risultano più elevate.

5 Per un numero limitato di genotipi è stata valuta la dinamica della concentrazione del Cd durante tutte le fasi della maturazione. Già nella primissima fase di endosperma latteo, quando l attività di sink della cariosside è ancora limitata, nelle varietà classificate a bassa capacità di esclusione del Cd la concentrazione del metallo è significativamente superiore a quella riscontrabile nello stesso stadio nelle varietà ad elevata capacità di esclusione. Le differenze si mantengano costanti nelle fasi successive di endosperma ceroso, tardo-ceroso e amilaceo. Tale comportamento suggerisce che le differenze, poi verificate a livello di cariosside matura, potrebbero dipendere non tanto da una diversa attività dei processi che stabiliscono l entità di riallocazione del metallo dalla foglia bandiera alla pannocchia, ma piuttosto dalla quantità di metallo che raggiunge la pannocchia dal suolo attraverso il flusso xilematico sino a quando, nelle fasi avanzate della maturazione, la continuità strutturale con il germoglio cessa di esistere. In sintesi l osservazione depone a favore dell ipotesi che la capacità di un genotipo di escludere il Cd dalla granella sia di fatto quantitativamente e causalmente correlabile alla sua generica capacità di escludere il Cd dal germoglio. Tale situazione ha due conseguenze: a) la possibilità di valutare il rischio di accumulo in granella determinando anche in fasi vegetative relativamente precoci l attività di assorbimento del metallo nelle radici e i suoi livelli nel germoglio; b) l utilità di concentrare sui processi di assorbimento radicale, ritenzione radicale e di caricamento dello xilema la ricerca di determinanti biochimici e molecolari da utilizzare come marker capaci di evidenziare il rischio di accumulo di Cd nella granella. Il maggior accumulo di Cd nella granella delle piante conseguente alla crescita in condizioni di asciutta merita alcune considerazioni. Pur risultando evidente come condizioni di aerobiosi aumentino drasticamente la frazione di Cd biodisponibile a parità di livello totale del metallo nel suolo (misurazioni effettuate sia dalla UR UNIMI-DIPROVE nei vasi utilizzati per la sperimentazione, sia dalla UR ENR in condizioni di campo), ciò non può considerarsi esaustivo nel giustificare l incremento dei contenuti di metallo nelle piante. Infatti, almeno nei casi delle prove in vaso condotte in ambiente controllato, la quota biodisponibile del metallo raddoppia mentre gli accumuli nella maggior parte delle cultivar triplicano se non quadruplicano. Al contrario, in alcune varietà il diverso regime idrico modifica solo leggermente tali accumuli; ad esempio nel caso della cultivar Nembo (bassa capacità di esclusione) le due condizioni addirittura non modificano le concentrazioni totali di Cd in granella. Tutto ciò sta ad indicare che gli effetti chimico-fisici della asciutta sulla biodisponibilità di Cd nel suolo sono probabilmente solo uno degli aspetti che causano il maggior accumulo del metallo nelle piante. Prove condotte allevando piante di Loto e Roma per due mesi in cilindri di plexiglass trasparente riempiti con suolo contaminato, confermano che il regime di asciutta modifica sostanzialmente l architettura radicale dei due genotipi rispetto alla sommersione. In particolare, in asciutta le radici risultano molto più allungate e ramificate (maggior numero di radici secondarie). Senza ipotizzare un aumento del bypass apoplastico nel caso di una maggior proliferazione di radici secondarie (vedi punto successivo), occorre tener presente che l assorbimento di micronutrienti, e di elementi non essenziali chimicamente analoghi, avviene preferenzialmente in queste zone della radice. Quindi, in conclusione, la condizione di asciutta sembra favorire una morfologia radicale favorevole all acquisizione del Cd. Analisi più approfondite, anche a livello istologico, della radice potranno confermare queste osservazioni. Comunque, poiché lo sviluppo dell apparato radicale è geneticamente controllato e condizionato da fattori ambientali (es: caratteristiche del suolo), cultivar differenti possano modificare diversamente i loro apparati radicali in condizioni di asciutta; tale comportamento consente quindi l individuazione di varietà di riso a minor rischio di accumulo di Cd quando allevate con questa tecnica colturale.

interrato sommerso interrato sommerso interrato sommerso interrato sommerso interrato sommerso interrato sommerso interrato sommerso interrato sommerso 6 A1.2. Prove di valutazione in campo della variabilità inter-varietale di accumulo di Cd in diverse parti della pianta Allo scopo di confrontare 9 cultivar di interesse merceologico ed agronomico per differente capacità di accumulare il Cadmio nelle diverse parti della pianta, l UR ENR ha allestito nel 2006 una prova sperimentale in campo. L esperimento è stato condotto a Rosate (MI), in un appezzamento noto per l elevato contenuto del metallo riscontrato nel riso raccolto nelle annate precedenti (dal 2003 al 2005). Le varietà prese in considerazione sono state: Carnaroli, Volano, Baldo, Selenio, Lido, Loto, Gladio, Saturno e Roma. Il disegno sperimentale ha incluso la valutazione dei genotipi sia in condizioni di semina in acqua e sommersione continua e sia in condizioni in semina interrata con irrigazione turnata, sulla base dei precedenti risultati ottenuti nel progetto RISOLOMB della Regione Lombardia e che avevano evidenziato un notevole effetto di riduzione di accumulo di Cadmio nel riso in condizioni di semina in acqua e sommersione continua (con potenziali redox del suolo negativi). Radici, paglia e riso integrale sono stati analizzati, dopo la raccolta a maturazione avvenuta, per il loro contenuto in Cd, in collaborazione con l Università Cattolica del Sacro Cuore, Istituto di Chimica Agraria ed Ambientale, sezione di Cremona.. 1.00 0.80 media 2005 media 2006 0.60 0.40 0.20 0.00 Carnaroli Volano Baldo Selenio Lido Loto Gladio Saturno Figura 3. Contenuto in cadmio (mg kg -1 ) nel riso semigreggio conseguite nella sperimentazione 2006 a confronto con una prova preliminare effttuata nel 2005

7 I risultati hanno mostrato differenze significative riguardo il sistema di semina e coltivazione del riso ed il il genotipo (Figura 3). L effetto della sommersione è stato molto forte, come nelle annate precedenti di sperimentazione, determinando un valore massimo di contenuto di Cd nel riso semigreggio di 0.07 mg kg -1, a confronto con la concentrazione più alta riscontrata in semina interrata di 0.53 mg kg -1. La gestione dell acqua ha influenzato anche il livello del metallo nella paglia e nelle radici. Nei tessuti aerei sono stati evidenziati valori compresi nel range 0.18-0.90 mg kg -1 in sommersione, mentre in asciutta si sono superati anche valori di 3 mg kg -1. Nelle radici, invece, il range dei valori determinati è stato di 1.49-2.98 mg kg -1 in sommersione e di 4.33 7.01 mg kg -1 in semina interrata. Considerando le varietà, con la conduzione della risaia in semina interrata ed irrigazione turnata, Gladio e Lido hanno mostrato rispettivamente la concentrazione più alta (0.53 mg kg -1 ) e più bassa (0.17 mg kg -1 ) nella granella, risultando significativamente diversi. Nella tradizionale sommersione, la varietà Carnaroli ha evidenziato il maggiore accumulo di metallo (0.07 mg kg -1 ). I risultati di questo studio, completato nell anno successivo, confermano la forte dipendenza dell accumulo di Cadmio nel riso dalle condizioni di ossido-riduzione del suolo e rivelano l influenza del genotipo sulla capacità di accumulo del metallo. A.2. Analisi della variabilità esistente nel germoplasma di riso per il carattere contenuto in GABA e antiossidanti Da alcuni anni c è grande interesse relativo alla qualità nutrizionale degli alimenti, da cui deriva l interesse del progetto all analisi dei nutrienti piu importanti sotto questo aspetto, quali amminoacidi, vitamine, e antiossidanti, nelle varietà italiane più utilizzate dagli agricoltori lombardi e in alcune varietà prodotte direttamente dalla Ditta Lugano. In particolare, risultati interessanti ottenuti grazie al progetto SIQURISO, sono stati la caratterizzazione e relativo sviluppo di varietà di riso ad alto valore nutrizionale, distinguibili da quelle in commercio per maggior contenuto polifenolico totale e quindi con una maggior capacità antiossidante intrinseca unitamente a varietà di riso ad elevato apporto aminoacidico rispetto alle varietà convenzionalmente commercializzate, entrambe utilizzabili tal quali, ossia nella preparazione di classici risotti, ma anche come estratti naturali per la preparazione di prodotti dietetici ed alimentari in genere, come ad esempio farine e prodotti da forno. Tra le varietà analizzate ci sono i mutanti ottenuti tramite mutagenesi traspositiva (vedi sezione B1) di varietà aromatiche tipo Basmati, nonché di cultivar italiane, e genotipi di riso a pericarpo nero, waxy e vitrei, provenienti dalla winter nursery in Uruguay, precisamente: 1) Centauro; 2) Pig Nero waxy; 3) Pig Nero vitreo; 4) P21/36 waxy; 5) P21/36 vitreo; 6) P21/5 waxy; 7) P21/3 waxy; 8) P21/42; 9) P/21/5; 10) P21/39. L analisi in spettrometria di massa condotta ha consentito di evidenziare somiglianze e differenze fra estratti di cariossidi di riso appartenenti a 10 diverse varietà. L analisi è stata basata sulle molecole estraibili in metanolo e ionizzabili attraverso sorgente ESI in modalità sia positiva che negativa. Tali modalità consentono di evidenziare una notevole varietà di molecole polari e mediamente polari, fra le quali acidi organici e loro derivati, aminoacidi, zuccheri, flavonoidi, molecole azotate, ecc... Inoltre, nonostante la frazione di molecole putativamente riconosciute sia relativamente bassa, tutte le molecole evidenziate sono

8 univocamente identificate attraverso il loro rapporto m/z (= massa/carica) ed il loro tempo di ritenzione, cosicché il confronto dei profili metabolici può essere condotto sulla totalità delle molecole analizzate. Le comparazioni condotte indicano che la linea di controllo Centauro si differenzia dalle altre 9 linee per un maggior contenuto di ferulati, sinapato, derivato dell acido clorogenico e del flavonoide esperidina, oltre ad un certo numero di molecole non chimicamente caratterizzate, fra cui diverse ad altro tempo di ritenzione (ridotta polarità). Le altre linee sono sostanzialmente caratterizzate da un maggior contenuto di saccarosio. Inoltre, le linee Pig Nero waxy, Pig Nero Vitreo e, in minor misura, la linea P21/36 vitreo, sono caratterizzate da una maggior abbondanza di aminoacidi, in particolare fenilalanina, leucina e isoleucina, prolina, treonina, tirosina ed asparagina. Una descrizione dettagliata delle analisi fatte è allegata a questa relazione. B. Produzione di nuove varianti genetiche B.1. Mutagenesi di varietà Italiane e Asiatiche di riso attraverso mutagenesi classica e strategie innovative (EMS e TOS17). Mutagenesi chimica: trattamento EMS Per questo trattamento sono state scelte le varietà di riso tra le piu coltivate nella pianura padana. Gli esperimenti di mutagenesi indotta sono stati condotti utilizzando EMS (Ethane Methyl Sulphonate) (UR UNIMI-DSBB). E stato trattato (mutagenizzato) un numero di semi sufficiente per l identificazione di mutanti di interesse a seguito di semina in campo delle varietà Volano e Selenio. Le varietà e la percentuale di EMS (0,75%) utilizzati per il trattamento sono stati scelti in base ai risultati di un trattamento pilota che, condotto nel corso del primo anno, aveva utilizzato le seguenti varietà di riso e percentuali di EMS: Roma (EMS 0.5%): germinabilità 71% Roma (EMS 0.75%): germinabilità 56% Selenio (EMS 0.5%): germinabilità 59% Selenio (EMS 0.75%): germinabilità 34% Arborio (EMS 0.5%): germinabilità 73% Arborio (EMS 0.75%): germinabilità 61% Volano (EMS 0.5%): germinabilità 68% Volano (EMS 0.75%): germinabilità 60%. A seguito del trattamento finale, la germinabilità dei semi è stata nuovamente saggiata, ed è risultata comparabile a quella del trattamento pilota, essendo: Volano: 59% Selenio: 38%. Si è quindi proceduto alla semina della seconda generazione delle popolazioni mutagenizzate (Volano) ottenute durante il primo anno del progetto. Inoltre per aumentare le dimensioni delle popolazioni si è proceduto all ottenimento di nuove popolazioni mutagenizzate con EMS che sono state seminate nel corso della primavera 2008. L insieme di queste due popolazioni M1 (popolazioni mutagenizzate nel 2008) + M2 (popolazioni di seconda generazione derivate da popolazioni mutagenizzte nel 2007) forniscono

9 un importante contributo nell aumentare la variabilità delle cultivar italiane, offrendo consistenti probabilità di selezionare linee con caratteristiche aggiuntive, interessanti sotto l aspetto agronomico, rispetto alle cultivar classiche. Gli albini rilevati sono fenotipicamente individuabili con facilità in base alle striature marcatamente bianche sulle lamine fogliari, che in alcuni casi si presentavano completamente bianche. Questi possono essere definiti i prodotti di scarto del trattamento, ma sono indicativi dell efficacia del trattamento stesso. I caratteri visionati dalla UR Lugano nei campi destinati allo screening delle varietà mutagenizzate chimicamente, sono: taglia della pianta, di forte interesse in quanto varietà a taglia bassa, sono più resistenti all allettamento; precocità di ciclo, vantaggiosa in quanto varietà a ciclo semina-fioritura ridotto (equiparabile a 130 giorni) consentono di ritardare la semina, così conducendo la lotta al riso crodo. Mutagenesi traspositiva Con lo scopo di ottenere mutanti stabili, l UR UNIMI-BIO2 ha applicato il protocollo di mutagenesi traspositiva basato sull uso del trasposone Tos17 (trasposone endogeno), naturalmente presente nel genoma di riso, attivato tramite coltura in vitro ed inattivo durante il normale ciclo vitale della pianta. Tale mutagenesi è stata realizzata sia su varietà italiane che su varietà asiatiche, al fine di produrre mutanti di riso che presentino delle mutazioni migliorative a livello di resistenza alle malattie, produttività e precocità di sviluppo. Sono stati sperimentati diversi protocolli per verificare la metodologia più efficiente per indurre mutagenesi traspositiva. Mediante analisi Southern blot, sono state analizzate varietà italiane (fornite dall UR ENR) per evidenziare il numero di Tos 17 presenti nel genoma. Questa analisi, condotta al fine di individuare le linee di riso piu suscettibili alla mutagenesi traspositiva, ha permesso di evidenziare che le varietà italiane Creso, Thaibonnet, Scirocco, Gladio, Aromatico 415, Prezioso, Centauro, e SL contengono tutte da 2 a 4 copie di Tos17 nel loro genoma. L attività del Tos17 è risultata variabile a secondo delle linee analizzate. In collaborazione con l UR Lugano e sulla base degli esperimenti appena descritti, nel corso del secondo anno è stato aumentato il numero delle varietà studiate. In particolare, l analisi è stata condotta anche su popolazioni della varietà italiana Creso, della varietà pachistana Basmati e di una varietà giapponese ad embrione gigante, mutagenizzate mediante attivazione di Tos17, attraverso il passaggio in coltura in vitro di calli, della durata di sei mesi. In seguito ad analisi Southern Blot, utilizzando DNA estratto da queste ultime varietà, solo la varietà Giapponese, ha presentato evidente attivazione di Tos17, mentre Creso e Basmati, seppur non evidenziando alcuna attivazione, hanno mostrato una grande variabilità fenotipica in campo, in particolare per efficienza germinativa ed altezza della pianta. La causa di questa variabilità è da attribuirsi principalmente all attivazione di altri tipi di retrotrasposoni e a mutazioni somaclonali, che avvengono di frequente nelle colture di calli in vitro. Le piante migliori sono state selezionate e seminate per analizzarne l M2 Particolare attenzione è stata rivolta all epoca di fioritura della nota e commercialmente interessante varietà pachistana Basmati, notoriamente non adatta al nostro clima temperato. A questo proposito, è tuttora in corso la selezione di genotipi di questa varietà più precoci e soprattutto a taglia più bassa, dato che quasi tutte le piante ottenute da mutagenesi traspositiva di questa varietà, hanno presentato taglia medio-alta.

10 I risultati ottenuti per mutagenesi traspositiva su una linea pachistana Basmati, sono incoraggianti in quanto ne sono derivate linee in grado di fiorire, seppur tardivamente, nei nostri areali a clima temperato, che verranno riseminate, per verificarne la stabilità quanto a caratteri agronomici ed epoca di fiortitura. Anche in questo caso, come accade con la mutagenesi chimica, sono stati rilevati genotipi a differente altezza e precocità di ciclo colturale; differenza invece, non altrettanto marcata, per quanto riguarda la resistenza alle malattie, specificatamente a Pyricularia Sempre da attivazione di Tos17, sono state isolate da varietà di riso italiano Samba (tipo S. Andrea a taglia bassa) ed Ulisse (tipo Arborio) fornite dalla UR Lugano, piante che fioriscono in camera di crescita in un lasso di tempo pari a due mesi anziché quattro, che verranno seminate e saggiate in questa stagione di campo. B.2. Caratterizzazione dei mutanti e identificazione dei geni tagged La caratterizzazione delle varietà mutagenizzate seguendo i diversi protocolli sono state fatte essenzialmente in campo mediante analisi del fenotipo (UR LUGANO, UNIMI-BIO2). La variabilità nelle popolazioni ottenute da mutagenesi, riguardano esclusivamente la taglia delle piante di riso che è facilmente riscontrabile tramite screening fenotipico in campo, oltre a differenze in precocità di ciclo. Nonostante la forte variabilità derivata dal trattamento mutageno, non sono stati rilevati, genotipi interessanti, tali da giustificarne l inserimento in programmi di breeding tradizionale. Le linee mutagenizzate quali, Gladio, Galileo e Creso, sono state reimpiegate quindi per trattamenti chimici a base di Glifosate e Glufosinate Ammonio, per determinare l eventuale presenza, all interno della popolazione trattata, di genotipi resistenti a tali principi attivi, gli stessi utilizzati a loro volta per ottenere la nota varietà Libero, utilizzabile in combinato a prodotti antagonisti al famigerato riso crodo C. Analisi fisiologiche e genetiche dei processi interessati C.1. Analisi dei processi fisiologici e biochimici interessati all accumulo di Cd e Fe in granella. Gli studi dei processi biochimici e fisiologici coinvolti nell accumulo di Cd in granella sono stati condotti utilizzando le varietà Loto, modello del gruppo di genotipi a bassa capacità di esclusione, e Roma, modello del gruppo ad alta capacità di esclusione (UNIMI-DIPROVE). Una prima serie di prove è stata effettuata crescendo le piante in soluzione idroponica addizionata con concentrazioni crescenti di Cd (0-0,01-0,1-1 M) che comprendono quelle misurate nell acqua di saturazione dei suoli di risaia adottati nelle prove di screening. Dopo 26 gg di crescita, di cui 10 in presenza di Cd, nelle radici e nei germogli di Loto il metallo raggiungeva una concentrazione significativamente maggiore di quella riscontrabile in Roma. In entrambe le varietà il Cd determinava effetti marginali sulla attività fotosintetica (inibizione del 15%) solo nel caso della concentrazione massima. Quindi nelle condizioni sperimentali adottate, il Cd si accumula nelle piante in concentrazioni subtossiche, almeno nei confronti della fotosintesi. Prove analoghe condotte con plantule delle varietà Nembo (bassa capacità di esclusione) e Baldo (alta

11 capacità d esclusione) hanno confermato la mancanza di effetto del Cd, nelle concentrazioni utilizzate, sulla fotosintesi. Utilizzando 109 Cd come tracciante radioattivo del metallo è stato possibile stabilire che le radici di Loto hanno una capacità di assorbire il metallo superiore a quelle di Roma (Figura 4). A B K m ( M) Vmax (nmoli h -1 g -1 fw) Loto 0.9 ± 0.02 14.7 ± 0.7 Roma 1.2 ± 0.01 7.5 ± 0.8 Figura 4. (A) Cinetiche di assorbimento di 109 Cd in radici di plantule di Loto e Roma e (B) relativi parametri cinetici determinati con funzione dei doppi reciproci (R 2 = 0,93 e R 2 = 0,98 rispettivamente per Loto e Roma). Per tutte le varietà, comunque, circa il 90% del metallo assorbito rimane nella radice. La differenza più evidente tra le tre varietà consiste nella percentuale di metallo nella radice legato ai complessi di fitochelatine (PC, peptidi non proteici ricchi in cisterna che chelano con estrema affinità il Cd) a basso peso molecolare. Infatti se nel caso di Roma il Cd legato alle fitochelatine è ripartito al 50% tra le frazioni ad alto e a basso peso molecolare, nel caso di Loto poco meno dell 80% del metallo risulta complessato alla frazione più leggera. Sempre sulle due varietà modello sono state condotte prove a verifica dell esistenza di un effetto del metabolismo dello zolfo sulla distribuzione del Cd negli organi della pianta. Il presupposto di questa attività risiede nel comprovato ruolo che alcuni metaboliti solforati (glutatione, bisglutatione e fitochelatine) svolgono nella chelazione del Cd e nel suo successivo accumulo nei tessuti vegetali. Una diversa disponibilità di S-SO 4 2- (0-0,02-0,2 mm) nella soluzione di crescita durante 10 gg di trattamento con Cd (0-0,01-0,1-1 M) determinava, in effetti, una diversa capacità di accumulo del metallo nel germoglio, ma la ragione di ciò è risultata attribuibile ad un effetto generalizzato del diverso stato nutrizionale sulla crescita della piante, piuttosto che a valori sostanzialmente diversi dei livelli dei metaboliti solforilati nei tessuti. B Cd

12 A HMWC nmol g -1 dw Loto 62 26% Roma 32.1 45% LMWC nmol g -1 dw 165 74% 40.0 55% Figura 5. (A) Gel filtrazione della frazione anionica delle radici di plantule di Loto e Roma e (B) Cd nei complessi di fitochelatine a alto (HMWC) e a basso peso molecolare (LMWC). Un risultato interessante è stato conseguito a proposito del sistema delle fitochelatine nelle radici delle piante di riso esposte a Cd (Figura 5). Tali peptidi non proteici sono sintetizzati a partire da glutatione in reazioni successive catalizzate dell enzima fitochelatina sintetasi (PCS), la cui attività è indotta dalla presenza di Cd cellulare. In riso le caratteristiche dell induzione della PCS sono state descritte solo nel caso di piante esposte per tempi relativamente brevi (24-72 ore) a concentrazioni piuttosto elevate di Cd (5-10 M). Nel caso di condizioni più simili a quelle riscontrate in campo, come quelle adottate in questa ricerca (10 gg di Cd 0-0,01-0,1-1 M) le dinamiche di induzione dell enzima non erano note e quindi sono state indagate. I risultati ottenuti, confrontando le concentrazioni raggiunte dai tioli totali non proteici (NPT, il 90% dei quali sono PC) nelle radici delle piante esposte alle tre concentrazioni del metallo, hanno evidenziato che sino a concentrazioni di Cd inferiori o uguali a 0,1 M la sintesi di PC è scarsamente indotta; solo nell intervallo di concentrazione 0,1-1 M di Cd si assisteva ad un drastico incremento (più di 4 volte) di accumulo di PC. Contemporaneamente, solo nel caso della concentrazione maggiore di Cd era possibile registrare nelle radici una caduta significativa dei livelli di GSH, il metabolita precursore delle PC. L induzione di sintesi, e quindi l accumulo delle PC nelle cellule della radice, determinava un contemporaneo incremento della capacità di ritenere in radice il Cd. La ritenzione infatti passava dal 75% del Cd totale assorbito al 95%. I comportamenti descritti erano riscontrabili in modo del tutto simile nelle due varietà di riso analizzate. Poiché le PC sono una famiglia di peptidi costituiti da unità monomeriche di γ- glutammilcisteina ripetute da 2 a 11 volte, non è possibile escludere che nelle due varietà, a parità di concentrazione totale di PC siano presenti nelle radici forme di PC con dimensione e traslocabilità potenziale differente. La presenza di PC è stata riscontrata anche nei germogli delle due varietà esposte al Cd e anche in questo caso l accumulo di PC è risultato concomitante ad una contrazione delle concentrazioni cellulari di GSH.

13 Tecniche di estrazione sequenziale esaustiva condotte sulle radici e sui germogli di Loto e Roma cresciute in idroponica in presenza di Cd, hanno permesso di dimostrare che in entrambe le varietà la maggiore quota del metallo è legata alla frazione apoplastica, ma anche che una buona percentuale è comunque presente nella frazione anionica che comprende le PC. Nel germoglio la ripartizione relativa del Cd sembra spostarsi a favore della forma anionica suggerendo che il metallo sia traslocato lungo lo xilema anche in forma cationica salificata. Lo spostamento percentuale a favore della forma anionica è risultato più evidente in Loto che in Roma. Una volta assorbito, ed in parte chelato dalle fitochelatine, l eccesso di Cd libero presente nelle radici può raggiungere la stele e quindi lo xilema, muovendosi per via simplastica, per lasciare le cellule corticali muovendo verso le parenchimatiche e, quindi, da queste, verso i vasi. Il caricamento dei vasi dalle cellule parenchimatiche avviene utilizzando trasportatori specifici di membrana conosciuti come Heavy Metal ATPase (HMA). E noto tuttavia che alcune discontinuità nell endodermide, quindi nella banda del Caspari, possono costituire una via di trasferimento incontrollato di soluti dalla soluzione circolante allo xilema. Queste discontinuità sono normalmente presenti nei punti di interruzione del periciclo in corrispondenza delle zone di differenziamento e di crescita delle radici secondarie. E possibile ipotizzare che un apparato radicale particolarmente abbondante in radici secondarie possa caratterizzarsi per un maggior numero di discontinuità dell endodermide (bypass apoplastico) e ciò possa contribuire in modo significativo al flusso totale di singoli soluti dal suolo allo xilema. Per verificare la possibilità dell esistenza di bypass apoplastici di diversa entità nelle radici di Loto e Roma è stato utilizzato il tracciante fluorescente 8-idrossi-1,3,6-pirentrisulfonato (PTS). Tale molecola non è in grado di attraversare le membrane biologiche, quindi, quando fornita alla radici la sua eventuale presenza nel germoglio permette una valutazione del bypass apoplastico nei tessuti vegetali. Dopo 24 h di trattamento delle radici la concentrazione di PTS riscontrata nei germogli delle plantule di Loto e Roma risultava del tutto simile. Tenuto conto che nello stesso periodo l entità del flusso traspirazionale in Loto è sensibilmente inferiore (-80%) rispetto a quella rilevabile in Roma, quando le plantule sono esposte a Cd 0,1 M, è possibile concludere che nella prima cultivar l entità del bypass apoplastico è potenzialmente superiore che nella seconda. Ricorrendo all uso della camera a pressione è stato possibile valutare la concentrazione del Cd nel fluido xilematico delle plantule di Loto e Roma. Questa tecnica permette di raccogliere il fluido presente nei vasi xilematici applicando alle radici, immerse in una soluzione posta all interno di una camera a tenuta, una pressione idrostatica positiva (circa +0,25- +0,3 MPa). In queste condizioni le prime gocce di fluido che fuoriescono dal mesocotile delle plantule sono considerate rappresentative della soluzione xilematica. Nel fluido xilematico di plantule di Loto di 21 gg trattate per 10 gg con Cd 0,1 M si rileva una concentrazione del metallo (valutato con tecniche ICP-MS ad alta sensibilità) più di 7 volte superiore a quella presente nel fluido raccolto dalle plantule di Roma (15,9 M e 2,0 M rispettivamente) mantenute nella stesa condizione. Nel caso dello Zn la concentrazione per Loto è più di 3 volte superiore a quella di Roma (18,8 M e 5,5 M, rispettivamente). Calcolando l apporto potenziale di Cd e Zn al germoglio delle due plantule [concentrazione del metallo ( M) x entità di traspirazione (ml H 2 O traspirata h -1 dm - 2 )], in Loto l apporto di Cd al germoglio nel tempo è significativamente superiore (circa 4,5 volte) a quello riscontabile in Roma. Nel caso dello Zn la differenza si riduce a poco meno del doppio.

14 C.2. Identificazione dei geni putativamente responsabili della capacità di escludere metalli pesanti dalla granella: analisi dei fattori genetici che controllano l assorbimento, la traslocazione, lo stoccaggio del Cadmio e del Ferro nella parte aerea della pianta e nella granella C2.1. Identificazione ed analisi trascrizionale dei fattori genetici coinvolti nell accumulo del cadmio Nel corso del primo anno del progetto l UR UNIMI-DIPROVE, allo scopo di analizzare il ruolo di alcuni geni coinvolti nell assunzione dello ione solfato e nel sequestro del Cd in radice, ha impostato una attività rivolta al clonaggio ed alla caratterizzazione di questi geni nelle varietà di maggiore interesse. Tale attività ha consentito il clonaggio di un trasportatore del solfato ad alta affinità (OsST1;1) espresso nelle radici della cultivar Volano. Coerentemente con risultati fisiologici raccolti, che sembrano escludere un ruolo determinante del metabolismo dello zolfo nella ritenzione radicale del Cd quando le piante sono esposte a basse concentrazioni del metallo, l espressione di OsST1;1, normalmente stimolata in caso di necessità particolari di zolfo, non è risultata in alcun modo indotta nell intervallo di concentrazioni di Cd 0,01-1 M (Figura 6). Alla luce di queste osservazioni si è ritenuto di non procedere ad ulteriori approfondimenti sul ruolo potenziale del metabolismo dello zolfo nella regolazione dei flussi complessivi di Cd nelle piante. Una approfondita ricerca bibliografica condotta dalle UR UNIMI-DIPROVE e UNIMI-DSBB, ha consentito di identificare altri geni candidati al controllo dei processi di assorbimento, traslocazione e accumulo del Cd nelle piante. Oltre ai geni codificanti per diverse isoforme dell enzima fitochelatina sintasi, sono stati presi in considerazione elementi appartenenti alle diverse famiglie coinvolte nell'approvvigionamento e omeostasi dei metalli micronutrienti quali ZIP (Zinc-regulated transporter, Iron-regulated transporter-like Protein), NRAMP (Natural Resistance Associated Macrophage Protein), HMA (Heavy-Metal-transporting P 1B -type ATPase) e CDF (Cation Diffusion Facilitator). In particolare sono state reperite informazioni di sequenza in diverse specie vegetali, sfruttando le banche dati e piattaforme informatiche a disposizione, tra cui le banche dati TAIR (The Arabidopsis Information Research, per le ricerche su Arabidopsis), TIGR (The Institute for Genomic Research, per Arabidopsis e riso), PlantsT (Functional Genomics of Plant Transporters), ARAMEMNON (Plant Membrane Protein Database), GenBank. Le sequenze di maggior interesse sono state dedotte attraverso l allineamento di informazioni provenienti da banche BAC, full length cdna and EST. L analisi bioinformatica delle sequenze di riso ha permesso il disegno di coppie di primers specifiche per l amplificazione ed il successivo clonaggio dei cdna di interesse. Le amplificazioni sono state condotte per RT- PCR utilizzando come templato il prodotto della retrotrascrizione dell mrna totale di riso estratto da foglie e radici della cultivar Roma (assunta come modello di riferimento) allevata in assenza ed in presenza di Cd. In particolare questa attività ha condotto al clonaggio di differenti cdna parziali appartenenti alle famiglie geniche P 1B -type ATPase (7 membri), ZIP (11 membri); NRAMP (6 membri); CAX (4 membri); Phytochelatin synthase (2 membri); ABC (ATP Binding Cassette, 12 membri). Poiché per i trasportatori appartenenti alla famiglia P 1B -type ATPase esistono scarse informazioni di tipo funzionale, si è scelto di procedere al clonaggio delle loro sequenze codificanti complete e alla loro caratterizzazione funzionale in esperimenti di espressione eterologa in Saccharomyces

15 cerevisiae. Tra questi, due membri della famiglia, HMA2 e HMA4, sono stati clonati full length e sono stati sottoposti ad una prima caratterizzazione funzionale. L analisi di espressione genica è stata condotta in radici di piante di riso ed ha riguardato un membro della famiglia Phytochelatin synthase (PCS1), i cui livelli di trascritto aumentavano in seguito all esposizione a Cd 2+ (Figura 6), nonché un membro della famiglia P 1B -type ATPase (HMA4), il cui trascritto era indotto dalla presenza di eccessi di Zn 2+, Cu 2+ e Cd 2+ (Figura 7). Figura 6. Livelli dei trascritti di OsSt1 e di PCS in radici di piante esposte a concentrazioni crescenti di Cd. Nell ultima fase del progetto sono stati confrontati i caratteri d induzione di HMA4 e HMA2 in radici di plantule di Loto e Roma cresciute in presenza di Cd 0,1 M. I risultati preliminari sinora ottenuti indicano che in Loto, in seguito all esposizione a Cd, i livelli di trascritto di entrambi i geni aumentano in modo più evidente che in Roma. Anche se sono necessarie ulteriori verifiche, l osservazione è coerente con una capacità di traslocazione del metallo superiore in Loto rispetto a Roma. Figura 7. Effetto delle crescita in presenza di Cd sul livello di trascritto di HMA4 in radici di riso

16 Nell ambito di una collaborazione con il gruppo della Dott.ssa Elisabetta Lupotto (CRA-RIS Vercelli) e del Dott. Pietro Piffanelli (Genomica del riso - Parco Tecnologico Padano, Lodi) è stata impostata una attività di eco-tilling sfruttando una collezione di 96 varietà di riso appartenenti alle sottospecie japonica ed indica. Tale approccio ha portato all individuazione di 9 varianti alleliche afferenti al locus Os06g01260, codificante per l enzima fitochelatina sintasi 2 (PCS2); alcune di queste varianti sono state parzialmente caratterizzate per i loro effetti sulla capacità di sintesi delle fitochelatine in relazione alla quantità di Cd ritenuta nelle radici. La medesima popolazione potrà essere impiegata per ricercare eventuali polimorfismi allelici in altri loci di interesse. Ad opera dell UR UNIMI-DSBB, stata dapprima intrapresa l analisi trascrizionale di alcuni geni ZIP (OsZIP1, OsZIP3 e OsZIP4) in radici e foglie di 5 varietà di riso caratterizzate da una diversa capacità di accumulo di Cadmio in tessuti aerei. Precisamente Gladio, Loto e Nembo (ad alto accumulo), Roma e Volano (a basso accumulo). Tutto il materiale è stato allevato in idroponica (soluzione Hoagland) in camera di crescita per tre settimane. Dopo tale periodo, un campione di 10 piante/varietà è stato sottoposto a trattamento con CdCl 2 (concentrazione finale 0.1µM) per 10 giorni (trattato), e un analogo campione è stato mantenuto in assenza del metallo (controllo). L analisi di espressione è stata condotta tramite Real Time RT-PCR. A tal fine, sono stati disegnati, sulla base delle sequenze cdna disponibili nella banca dati NCBI, primers altamente specifici per ciascun gene. La procedura sopra descritta è stata seguita anche per tutte le analisi condotte nel corso dello svolgimento del progetto; per ogni gene in studio sono state prodotte in totale almeno 4 repliche biologiche, ciascuna con 2 repliche tecniche. L espressione dei geni selezionati è stata inizialmente rilevata sul campione di controllo. In queste condizioni OsZIP1 è risultato espresso nelle radici e non nelle foglie, mentre OsZIP3 e OsZIP4 hanno mostrato un comportamento opposto. L espressione in risposta al Cadmio è stata dapprima analizzata, per ciascuno dei tre geni, nel tessuto in cui questi mostrano espressione in condizioni di controllo: il tasso di espressione dei tre geni risulta sempre influenzato dal Cadmio, anche se con modalità diverse per ogni combinazione gene-varietà. L analisi trascrizionale per questi geni è stata ripetuta su altre tre repliche biologiche anche nel secondo anno, quando sono state condotte anche le analisi di trascrizione su due geni NRAMP (NRAMP1 e NRAMP2), su quattro repliche biologiche. Nel campione di controllo, l espressione di base di entrambi i geni è bassa in tutti i genotipi, ma con differenze tra i tessuti: NRAMP1 è espresso maggiormente nelle radici, NRAMP2 nelle foglie. Il trattamento con cadmio non cambia il quadro in modo significativo, se si eccettua una generale repressione per il gene NRAMP1 nelle foglie (tasso di espressione circa 50% rispetto al controllo in tutte le cultivar). In base ai risultati di questa prima parte del lavoro non è stato possibile rilevare una chiara correlazione tra l espressione dei geni ZIP o NRAMP esaminati, sia nelle piante di controllo e sia in quelle trattate con Cadmio, e le caratteristiche di accumulo del metallo delle cinque cultivar analizzate. Della famiglia dei trasportatori ABC sono stati identificati in silico 12 geni di riso, che appartengono alla sottofamiglia MRP (Multidrug Resistance-associated Proteins) ed è stata condotta l analisi dei primi 6 (ABC1, ABC2, ABC3, ABC7 ABC9, ABC12), su quattro repliche biologiche, limitatamente a 3 cultivar (Gladio, Loto e Roma). I dati indicano che in tutte e tre le cultivar i geni sono espressi, ma si registra una differenza tra le 2 cultivar ad alto accumulo (Gladio e Loto) e Roma (basso accumulo): in quest ultima tutti i geni, tranne ABC9, risultano più

17 espressi. Circa la risposta al Cadmio, si osserva una leggera induzione di ABC1 in Loto (foglie), di ABC2 in Loto e Roma (foglie), ABC3 in Gladio (foglie) e Loto (foglie e radici) e ABC9 in Gladio (foglie) e Roma (foglie e radici). Al fine di mettere in evidenza in modo più esaustivo la risposta al trattamento con Cd, sia a livello di sviluppo della pianta, e sia in termini di attivazione genica, a partire dal secondo anno del progetto abbiamo deciso di saggiare l effetto di diverse concentrazioni di Cadmio: oltre a 0.1, 1 e 10 µm, e di monitorarne l effetto nel tempo, prelevando il materiale dopo 3, 10 e 17 giorni di trattamento. Per questo esperimento si è deciso di focalizzare l attenzione su due sole cultivar (Gladio, ad alto accumulo e Roma, che accumula cadmio a basssi livelli) e di analizzare più approfonditamente l espressione dei geni che avevano mostrato risultati interessanti nella prima fase del progetto: ZIP1, ZIP4, ABC1, ABC7, ABC9, ABC12. Le analisi sono state ripetute due volte su ogni campione derivato da due esperimenti indipendenti (due repliche tecniche per ciascuno delle due repliche biologiche per un totale di 4 repliche per ogni misura). I dati risultanti sono stati sottoposti ad ANOVA, includendo come principali fonti di variazione il genotipo, la dose di Cd applicata e la sua interazione con il genotipo, il tempo di trattamento e la sua interazione con il genotipo. Per quanto riguarda l espressione genica in piante trattate con cadmio rispetto a controllo è emerso che, in generale, i geni sono indotti maggiormente nelle radici rispetto alle foglie, la risposta è funzione della dose, e diminuisce a tempi lunghi (17 giorni). In particolare: OsZIP1 - A seguito del trattamento con Cd nelle foglie della cultivar Gladio non si evidenziano regolazioni significative mentre nelle foglie Roma si si rileva l induzione di OsZIP1 in piante trattate per 3 giorni con 10 µm di CdCl 2 (espressione relativa in piante trattate/controllo: T/C: 4,15). Proseguendo col trattamento, il livello d espressione del gene si abbassa fino a risultare down-regolato dopo 17 giorni di esposizione al metallo. L espressione del gene in radice è indotta nettamente in entrambi i genotipi, in particolare in piante trattate con 1 e 10 µm di CdCl 2 per 10 giorni, e la sua espressione diminuisce dopo 17 giorni di trattamento; in piante trattate con concentrazioni minori di Cd (0.1 µm) si nota l induzione solo a 17 giorni. Si evidenzia inoltre che l induzione del gene alle dosi elevate è significativamente maggiore in radici Roma (T/C: 17,2) rispetto a radici Gladio (T/C: 2,7). OsZIP4 Questo gene viene indotto dal Cd in modo significativo nelle foglie Roma, e la sua espressione aumenta in funzione della dose. Nelle foglie del genotipo ad alto accumulo Gladio non si evidenzia alcuna regolazione significativa. Anche nelle radici l espressione di OsZIP4 cresce proporzionalmente alla dose di metallo somministrata, ma in questo tessuto la differenza si osserva solo alla dose di 10 M. Quindi si può concludere che l espressione del gene OsZIP4 è regolato positivamente dal Cd in radici Gladio e sia in foglia che in radice Roma e che la sua espressione aumenta in funzione della dose del metallo, in particolare nelle radici. OsABC1 - Nelle foglie di piante trattate con diverse concentrazioni di Cd per diversi tempi si nota una differenza significativa tra le due cultivar analizzate: il gene è indotto in foglie Roma, mentre in Gladio la sua espressione non sembra essere regolata dal metallo. Nelle radici la regolazione dell espressione genica risulta più evidente. Sia in Gladio che in Roma l espressione di OsABC1 aumenta in funzione della dose ma sembra diminuire nel tempo. Se si considera il trattamento meno aggressivo (0.1 µm) il gene è leggermente indotto indipendentemente dal tempo di trattamento, e l espressione nelle radici Gladio (T/C: 5) è

18 superiore a Roma (T/C: 2). Aumentando la dose di cadmio somministrato si nota un immediata induzione in radici Gladio (già dopo 3 giorni di trattamento), che sembra diminuire nel tempo, mentre in Roma l induzione non si manifesta fino a 10 giorni: sembrerebbe che la risposta cella pianta nella cultivar che accumula Cd ad alti livelli sia precoce rispetto a quella delle radici di Roma. Anche in piante trattate con 10 µm di CdCl 2 si nota una differenza nella regolazione dell espressione del gene nelle due cultivar: mentre in Gladio il gene è espressso a livelli simili durante tutto il trattamento, in Roma si ha un induzione molto forte già dopo 3 giorni ed il livello di espressione di OsABC1 diminuisce gradualmente fino a raggiungere il livello d espressione in Gladio. In questo caso si nota una risposta più intensa e precoce nelle piante che accumulano Cd a bassi livelli (Roma). OsABC7 - L espressione di questo gene è diversa nei due genotipi studiati: mentre in Gladio si riscontra un induzione solo in foglie trattate per 10 giorni con 1 µm di CdCl 2 (T/C: 3,7) in Roma il gene viene idotto dal trattamento 1 µm di CdCl2 già a 3 giorni (T/C: 2,3) e poi l espressione tende a diminuire nel tempo; l effetto più evidente si ha in foglie Roma trattate con 10 µm di CdCl 2, in questo caso l induzione del gene in piante trattate rispetto a controllo è di circa 4,5 volte e si abbassa nel tempo fino a circa 2 volte a 17 giorni. In radice l effetto del trattamento è maggiore che nelle foglie, ma non si riscontrano differenze significative tra i due genotipi o risposte dipendenti dal dosaggio; in questo tessuto l espressione del gene OsABC7 sembra essere regolata in modo differente in funzione del tempo di somministrazione del metallo, ma la relazione non è lineare. OsABC9 - In piante cresciute in presenza di Cd si nota un induzione in foglie Roma, non correlabile alle dosi o ai tempi di durata del trattatmento, mentre l espresione in foglie Gladio non sembra essere influenzata dalla presenza del metallo nel terreno di crescita. In radice il trattamento determina una induzione dell espressione di OsABC9 maggiore rispetto alla foglia in entrambe le cultivar ma c è una interazione significativa tra genotipi e trattamenti: in Gladio l espressione massima si osserva alla dose 1 µm, mentre in Roma gli stessi livelli d induzione si raggiungono solo a seguito del trattamento con 10 µm di CdCl 2. Sembrerebbe quindi che in foglia l espressione del gene sia regolata maggiormente nel genotipo Roma, mentre in radice sia il genotipo Gladio a rispondere al trattamento già a dosaggi di metallo minori, mentre in Roma la risposta sia in qualche modo legata alla presenza di una maggiore quantità di metallo. OsABC12 - L espressione di OsABC12 non è regolata in modo significativo dalla presenza di Cd nel terreno di crescita nelle foglie; è invece riscontrabile una forte induzione nelle radici Roma a seguito del trattamento con 10 µm di CdCl 2 : dopo 3 e 10 giorni di trattamento l espressione del gene è 12 volte maggiore in piante trattate rispetto a controllo, questa iduzione diminuisce dopo 17 giorni di trattamento. I geni più interessanti sembrano essere OsZIP1, OsABC1, OsABC9, e OsABC12. In generale, i due genotipi studiati mostrano un quadro diverso di regolazione dei geni per i trasportatori studiati: in Roma essi sono fortemente up-regolati solo alle dosi più elevate e a tempi brevi, mentre in Gladio sono espressi in maniera apprezzabile anche a basse dosi di Cd, e anche a 17 giorni dal trattamento. Nelle figure 8 e 9 è riportata l espressione relativa dei primi due geni nelle piante trattate con Cd rispetto al controllo, in funzione della dose e del tempo di trattamento, dei genotipi Gladio e Roma. La relativa analisi statistica è nelle Tabelle 2 e 3, rispettivamente.

19 OsZIP1 in shoots OsZIP1 in roots 1 m 1 m 0.1 m Figura 8. Profili di espressione del gene OSZIP1 ANOVA Germoglio Radice FV DF MS MS GENOTIPI 1 2.6569 48.6274* DOSI 2 2.5443 71.84** Componente Lineare 1 4.9686* 123.3067** Non Lineare 1 0.1200 20.3733 TEMPI 2 2.7604 29.9690* Componente Lineare 1 5.1337* 4.6905 Non Lineare 1 0.3870 55.2476* G x D 2 1.4957 47.8267** Componente Lineare 1 1.4602 81.6966** Non Lineare 1 1.5313 13.9568 G x T 2 3.0769 16.6243 Componente Lineare 1 5.5488* 5.9302 Non Lineare 1 0.6050 27.3184 D x T 4 1.4750 22.6217* G x D x T 4 1.5112 17.1769 Error 18 0.9488 7.6072 Tabella 2

20 OsABC1 in germoglio OsABC1 in radici Figura 9. Profili di espressione del gene OsABC1 Germoglio Radici FV DF MS MS GENOTIPI 1 7.9430* 11.2337 DOSI 2 4.5690 82.954** LIN 1 0.1350 122.0406** Non Lin 1 9.0029* 43.8674** TEMPI 2 0.0432 18.5127** LIN 1 0.0241 21.69802** Non Lin 1 0.0624 15.32738* G x D 2 1.8129 45.8920** 0.0704 75.615** 3.5555 16.1691* G x T 2 0.7400 14.3755* 0.2053 18.65607* 1.2746 10.09503 D x T 4 0.9367 15.3469** G x D x T 4 1.2733 18.7427** Error 18 1.4516 2.6412 Tabella 3