Incorporazione in proteine di aminoacidi non naturali

Incorporazione in proteine di aminoacidi non naturali

La catena laterale dei 20 amminoacidi naturali manca di gruppi elettrofili non permette reazioni chimiche precise

Incorporazione di aminoacidi non naturali Sonde fluorescenti modifiche post traduzionali marcatura per fotoaffinità biotina chelanti per metalli

Metodi per incorporare aminoacidi Selettiva modifica chimica di un amminoacido non naturali aa* aa* ome si può modificare selettivamente un aamminoacido?

Methods for Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Sintesi chimica limitata a 30-50 residui ligazione del frammento H R 1 SR' H 2 HS H H R 1 H 2 S H H R 1 HS H H Dawson, P. E.; Muir, T. W.; lark-lewis, I.; Kent, S. B. H. Science 1997, 266, 776-779. Modifica Post-traduzionale tramite reazioni chimiche o enzimatiche

Metodi per Incorporare Aminoacidi modificati in Proteine In vivo crescita in un mezzo che contenga l aminoacido modificato In vitro modifica di tra già acilati lisina/cisteina alterazione dell anticodone 4 basi o 5 basi inserimento di nucleotidi modificati.. H H H H H H P P H P P H H H H P P H P P H H - pair iso-iso pair

Misacylation del tras cysteine-tra ys alanine-tra ys hapeville, F.; Lipmann, F.; von Ehrenstein,.; Weisblum, B.; Ray, W. J.; Benzer, S. Proc. atl. Acad. Sci. 1962, 48, 1086-1092. von Ehrenstein,.; Weisblum, B.; Benzer, S. Proc. atl. Acad. Sci. 1963, 49, 669-675.

Incorporazione di aminoacidi modificati mediante l uso di tra soppressori nonsenso

Sintesi proteica DA tra aa~amp mra Aminoacyl-tRA synthetase (aars) R H 2 peptide chain H 2 H 2 R EF-Tu acylated tra mra ribosome

odice genetico

Traduzione ATP TP elongation factor Tu aminoacyl tra synthetase

Terminazione Amber (UA), pal(ua), chre(uaa)

Yeast tra Phe e RF1 (Release Factor) umano Bertram,.; Innes, S.; Minella,.; Richardson, J. P.; Stansfield, I. Microbiology 2001, 147, 255-269.

tras Soppressori

onsense Mutation nonsense mutation proteina troncata e non funzionale

Prima evidenza della possibilità di usare Soppressori onsenso per inserire in una catena polipeptidica aminoacidi modificati Introduzione della diazirina in un sito che portava la mutazione amber Mediante modifica chimica del suppressor tra acilato F 3 6 2 H H 2 Shih, L. B.; Bayley, H. Anal. Biochem. 1985, 144, 132-141.

In vitro P.. Schultz et al. Science 1989, 244, 182

Misacylation of Suppressor tras pdpa-amino acid chemical suppressor tra(-a) aminoacyl tra synthetase in vivo suppressor tra amino acid

In vitro and in vivo Systems to Produce Protein + in vitro in vivo translational mixture Xenopus oocyte Thorson, J. S.; ornish, V. W.; Barrett, J. E.; load, S. T.; Yano, T.; Schultz, P.. Methods Mol. Biol. 1998, 77, 43-73. Dougherty, D. A. urr. pin. hem. Biol. 2000, 4, 645-652.

Incorporazione di aminoacidi nonnaturali in vivo

In Vivo Misacylation L aminoacido modificato non deve essere tossico e deve poter entrare nella cellula Il Suppressor tra deve essere acilato solo dalla sintetasi eterologa (orthogonal tra/synthetase pair) Saks, M. E. Proc. atl. Acad. Sci. 2001, 98, 2125-2127.

li amminoacidi vengono attivati mediante adenilazione La formazione dell amminoaciladenilato è catalizzata dall amminoacil-trasintetasi Amminoacil AMP (amminoaciladenilato) ATP+amminoacido+tRA PPi + tra AMP + amminoacil-tra Amminoacil-tRA+ AMP+ PPi 2Pi

Esistono due classi tra sintetasi che si differenziano per: Riconoscimento dell anticodone Enzimi di classe II non interagiscono con l anticodone Sito di amminoacilazione Enzimi di lasse I caricano l amminoacido sull H 2 Struttura

Le sintetasi riconoscono le anse dell anticodon e gli steli accettori delle molecole di tra

Le due classi di tra sintetasi legano lati diversi del tra

Alcune tra sintetasi hanno il sito per la correzione di bozze

onsense Suppression Methodology mutazione non senso in un tra specifico per un determinato aminoacido modificato amminoacil sintetasi in grado di riconoscere e attivare l amminoacido modificato Site-directed mutagenesis inserimento del codone di stop nella posizione in cui si vuole inserire la mutazione transcription translation oren,. J.; Anthony-ahill, S. J.; riffith, M..; Schultz, P.. Science 1989, 244, 182-188.

Ricerca di una coppia tra /sintetasi in grado incorporare aminoacidi modificati Le t-ra sintetasi e tra degli eucarioti e degli archea sono simili tra loro e diverse da quelle di coli Tentativi di Produrre di tra soppressori / sintetasi a partire da lutamil tra /sintetasi di Ecoli non hanno portato a risultati positivi

Selezione del tra Soppressore on deve essere acilato da sintetasi endogene Unnatural Amino acid Incorporated Into protein reacylation none

Selezione dei tra Suppressori glycyl-tra sintetasi non ha attività di editing Fersht, A. R.; Dingwall,. Biochemistry 1979, 18, 2627-2631. Mutagenesi nello stelo accettore per eliminare il riconoscimento con la E. coli ly sintetasi Bain, J. D.; Diala, E. S.; labe,..; Wacker, D. A.; Lyttle, M. H.; Dix, T. A.; hamberlin, A. R. Biochemistry 1991, 30, 5411-5421

tra soppressore di lievito da usare in Ecoli on è riconosciuto dalla sintetasi Phe di E. coli Bassa efficienza come soppressore Bassa affinità per il ribosoma E. coli aminoacidi polari non sono incorporati load, S. T.; Liu, D. R.; Froland, W. A.; Schultz, P.. hem. & Biol. 1996, 3, 1033-1038. Ellman, J.; Mendel, D.; Anthony-ahill, S.; oren,. J.; Schultz, P.. Methods in Enzymology 1991, 202, 301-336.

Sintetasi e tra M. jannaschii A U A U U A A A 5' p U A A A U A U 3' A H A T A A U U U A U U A M. jannaschii tra Tyr è ortogonale alla sintetasi di E. coli M. jannaschii TyrRS è ortogonale a E. coli tras M. jannaschii TyrRS non ha interazione con l anticodone M. jannaschii TyrRS non ha attività di editing

Selezione per tra/sintetasi M. jannaschii E. coli negative selection survivors orthogonal tras non-functional tras Toxic barnase tra library endogenous positive selection synthetase orthogonal tra/ synthetase pair ampicillin b-lactamase tra library endogenous Wang, L.; Schultz, P.. hem. & Biol. 2001, 8, 883-890.

Evoluzione diretta di Mj TyrRS per selezionare trasintetasi in grado di identificare diversi aa modificati

rescono le colonie che contengono le sintetasi capaci di caricare su tra mut UA aa naturali e modificati

Expanded enetic ode in E. coli H 2 H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H I 3 H H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H 2 - S H 2 H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H 2 H B(H) 2 F 3 H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H H 2 H

Incorporazione del fotocrosslinker pbenzilfenilalanina (pbpa)

Produzione di proteine glicosilate in E coli p-acetilfenilalanina

MMetodi per ottimizzare la produzione d di proteine con aminoacidi modificati in E coli

ptimizing protein yields in E. coli E. coli prolyl-tra promoter and terminator for the amber suppressor tra Mutated form of the glns promoter for the synthetase D286R substitution in the synthetase gene Multiple copies of the suppressor tra gene Yield of adiponectin (lu123bpa) mutant: 0.4g/L Ryu & Schultz at. Methods 3, 263 (2006)

Mj tra expression cassette E. coli prolyl tras have 1-72 pair, which is major identity determinant of MjtRA Important context for the precise tra processing prok tra is most frequently used in E. coli FIS enhances tra transcription A RAse T, PH etc RAse P 5' A U U U U U A A A A A A U A A U 3' A A A U U A A A A U U A A A RAse E RAse III U A A A U U A U U U U U U U U A A U JYTR Terminator

espressione di MjtRA aars promoter glns glns glns glns glns glns tra promoter - lpp prok prok prok prok tra copy # 0 1 1 1 3 6 JYTR

Mutant glns promoter enhances the synthetase expression WT Mutant -35 region -10 region +1 AAAAAATAAATTTATTTTATAAATATATTATATT AAAAAATAAATTTATTTT-TAATATATATTATATT WT Mutant BpaRS

Asp286Arg (D286R) aumenta tra(ua) binding affinity TyrRS (WT) tra Tyr (WT) TyrRS (WT) tra Tyr (UA) TyrRS (D286R) tra Tyr (UA) His283 Asp286 34 Asp286 34 34 Arg286 34 Phe261 K m = 0.35 mm k cat = 0.19 s -1 k cat /K m (relative) = 1 K m = 39 mm k cat = 0.070 s -1 k cat /K m (relative) = 0.0033 K m = 0.68 mm k cat = 0.079 s -1 k cat /K m (relative) = 0.22 Kobayashi et. al. at. Struct. Biol. 10, 425 (2003)

b-alactosidase assay for suppression efficiency TA arabad promoter leader lacz prok prok + D286R prok + glns prok + glns + D286R + 3TR + 6TR

Incorporazione differenti aminoacidi modificati 3 I H 2 2 H H 2 2 H H 2 2 H H 2 2 H Bpa pacphe pazphe piphe

Strategy to identify the YebF transporter

Unnatural protein medicinal chemistry