ISOLAMENTO DI ENTEROVIRUS E PARECHOVIRUS

METODO NAZIONALE STANDARD ISOLAMENTO DI ENTEROVIRUS E PARECHOVIRUS VSOP 24 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections S Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 1 di 11

STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS), algoritmi e linee guida, promuovono l adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo. I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell organizzazione di cui sono membri. L elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite e-mail all indirizzo standards@hpa.org.uk. Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza. La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk La HPA è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l indirizzo standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2006). Isolation of enterovirus and parechovirus. National Standard Method VSOP 24 Emissione 2. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_virology.asp. Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 2 di 11

INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 SCOPO...... 5 GENERALITA... 5 1 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA... 6 1.1 PRELIEVO DEL CAMPIONE...... 6 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE... 6 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE. 6 2 RACCOLTA DEL CAMPIONE... 6 2.1 TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE.......... 6 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE... 6 3.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA 6 3.2 ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO... 6 4 PROCEDURA SUL CAMPIONE... 7 4.1 SELEZIONE DELLA PROVA......... 7 4.2 COLTURA E RICERCA... 7 4.3 IDENTIFICAZIONE..... 7 5 ASSICURAZIONE DI QUALITA... 8 6 LIMITI... 8 7 REFERTAZIONE DEI RISULTATI... 8 8 SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI REGIONALI ED AL CDSC CENTER FOR INFECTIONS)... 8 9 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI... 9 BIBLIOGRAFIA... 10 Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 3 di 11

PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato VSOP 24 Isolamento degli enterovirus e parechovirus Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Data 2/ 02.05.06 Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. 1.1 2 5 Pagina Sessione(i) interessate Modifica 6 7 Generalità 1.3 Procedura sul campione 4.2.2 Isolamento Contenuto aggiornato Aggiunte note per Polio Aggiornamento sulla linea cellulare Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 4 di 11

ISOLAMENTO DEGLI ENTEROVIRUS E PARECHOVIRUS Tipo di campione Tampone faringeo Tampone da vescicola Tampone oculare LCR Feci Liquido pericardico Tampone rettale Biopsia tissutale Liquido da vescicola Tessuto post mortem INTRODUZIONE Scopo Questa POS descrive l isolamento e l identificazione degli enterovirus e parechovirus da materiale clinico. Generalità Nei generi Enterovirus e Parechovirus, appartenenti alla famiglia delle Picomaviridae, sono presenti più di 60 sierotipi in grado di infettare l uomo. Gli enterovirus umani sono classificati in 5 specie: poliovirus ed enterovirus umani dei gruppi A-D 3. Prima della più recente classificazione molecolare, i sottogruppi si definivano con le correlazioni sierologiche ed includevano poliovirus (3 sierotipi), Coxsackie A e B (rispettivamente 23 e 6 sierotipi), echovirus (26 sierotipi) ed i più recenti enterovirus classificati come tipi 68-71. Due virus, in precedenza classificati con gli echovirus 22 e 23, hanno dimostrato di comprendere un genere separato all interno della famiglia delle Picornaviridae, il genere Parechovirus; questi virus sono ora assegnati ai parechovirus umani di tipo 1 e 2. In questo documento la dizione enterovirus sarà usata genericamente per definire sia enterovirus che parechovirus. Gli enterovirus sono in grado di causare un ampio spettro di malattie nell uomo, da lievi stati febbrili nonspecifici, associati ad esantemi nelle infezioni delle vie aeree superiori, a meningite asettica, pleurodinia, ed infezioni a possibile prognosi infausta, quale miocardite, encefalite e poliomielite paralitica. La maggior parte delle infezioni è comunque asintomatica. La diagnosi di infezione da enterovirus con l isolamento in coltura cellulare è diffusamente disponibile, relativamente rapida e l isolato può essere tipizzato con antisieri per motivi epidemiologici. In ogni caso i metodi PCR sono sempre più utilizzati. Questi sono generalmente più sensibili e più rapidi dei metodi di coltura cellulare e possono rilevare infezioni da enterovirus non coltivabili 4-7. Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 5 di 11

1.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA 2-10 1.1 PRELIEVO DEL CAMPIONE Appropriati contrassegni di rischio in accordo con le direttive locali. 1.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE E essenziale l adeguamento alle regolamentazioni attuali della posta e del trasporto. Deve essere usato (quando opportuno) un appropriato sistema di trasporto, ed il campione inserito in un sacchetto o borsa di plastica sigillata. Utilizzare appropriati contrassegni di rischio in accordo con le direttive locali. 1.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE Tutti gli enterovirus appartengono al Gruppo di Rischio 2. Le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina microbiologica di sicurezza E richiesta la vaccinazione anti polio; le indicazioni sono fornite nella Health Protection Agency immunisation policy Fare riferimento alle linee guida attuali per la manipolazione sicura dei microrganismi del Gruppo di Rischio 2 descritti in questo Metodo Nazionale Standard Per cortesia prendere nota che ai laboratori che conservano poliovirus selvaggi infettivi o materiali potenzialmente infettivi è raccomandato di lavorare al livello di biosicurezza 2/polio (BSL-2/polio) 11 Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio 2 RACCOLTA DEL CAMPIONE 2.1 TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE Tamponi, materiali da raschiamento, liquido pericardio e tessuti devono essere prelevati il più rapidamente possibile dopo la comparsa dei sintomi ed inseriti immediatamente in Terreno di Trasporto per Virus (TTV). Le feci ed il LCR possono essere raccolti in contenitori di plastica sterili. 3 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE 3.1 TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA ANALITICA I campioni devono essere processati il più presto possibile. In linea teorica, i sistemi di trasporto dovrebbero assicurare l arrivo dei campioni entro 24 ore dal loro prelievo. 3.2 ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO I campioni devono essere inseriti in un TTV idoneo immediatamente dopo il prelievo. Se la procedura è ritardata, i campioni devono essere refrigerati. Se il ritardo supera le 24 ore, i campioni devono essere congelati a -70 C, o a temperatura inferiore, e scongelati immediatamente prima della procedura analitica. Devono essere evitati ripetuti congelamenti e scongelamenti. Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 6 di 11

4 PROCEDURA SUL CAMPIONE 4.1 SELEZIONE DELLA PROVA L isolamento in coltura cellulare è stato in passato il metodo più utilizzato per la diagnosi di enterovirus e lo è tuttora nella pratica comune. Tuttavia, la PCR offre evidenti vantaggi per quanto riguarda la sensibilità ed il tempo complessivo di risposta. I centri specialistici devono essere in grado di definire la tipizzazione di specie con il sequenziamento 12, 13 genetico sul campione originale perché la PCR non consente la disponibilità dell isolato. 4.2 COLTURA E RICERCA 4.2.1 ISOLAMENTO Feci I campioni fecali sono preparati in sospensione al 10-20% con una soluzione salina bilanciata contenente antibiotici, chiarificata poi con centrifugazione a 1600-2000 g per 10 minuti. Tessuti I tessuti sono macinati in un mortaio sterile. Occasionalmente può essere richiesta l aggiunta di sabbia sterile ed una piccola quantità di terreno. Dopo la preparazione di una sospensione al 10-20% in TTV, chiarificare con centrifugazione a 1600-2000 g per 10 minuti. Tamponi I tamponi devono essere scossi per far rilasciare il materiale cellulare nel terreno di trasporto per i virus, ponendo attenzione a non generare aerosol. LCR e liquido pericardio Questi sono considerati campioni puliti e richiedono una minima preparazione. 4.2.2 ISOLAMENTO Molte delle linee utilizzate di routine per l isolamento virale sono per lo più sensibili all infezione da enterovirus. Fra le linee comunemente utilizzate, quelle primarie di rene di scimmia rhesus (RKM rhesus monkey kidney) sono le più sensibili, ma queste, per motivi etici, non saranno più disponibili dal mese di Aprile 2006. Le linee cellulari diploidi umane, quali le MRC-5 14 sono risultate ugualmente sensibili e, rispetto alle altre linee cellulari, presentano l effetto citopatico più precocemente. Le cellule RD (rabdomiosarcoma) sono state riscontrate sensibili a molti enterovirus (con eccezione del gruppo Coxsackie B), compresi un certo numero di Coxsackie A, che di solito sono isolati solo nel topo neonato 15. Per ridurre i tempi ed aumentare la possibilità di isolamento degli enterovirus possono essere utilizzate più linee cellulari di tipo diverso. Inoculare 0.2 ml di LCR, estratto fecale o TTV contenente il materiale clinico in ciascuna di due linee cellulari. Le cellule devono essere incubate a 35 37 C per 10 giorni. Devono essere controllate ad intervalli regolari per la comparsa del caratteristico effetto citopatico degli enterovirus. 4.3 IDENTIFICAZIONE 4.3.1 IN LABORATORIO La crescita degli enterovirus nella coltura cellulare può essere identificata dalla comparsa di caratteristiche modificazioni citopatiche e confermata con immunofluorescenza o neutralizzazione. La sierotipizzazione degli enterovirus deve essere eseguita principalmente per escludere i poliovirus. La determinazione di gruppo degli enterovirus, echovirus, coxsackie B e poliovirus è di consuetudine Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 7 di 11

effettuata con immunofluorescenza indiretta e anticorpi monoclinali tipo-specifici. I poliovirus dovrebbero essere ulteriormente tipizzati per determinare il sierotipo 1-3. Se richieste, possono essere eseguite successive tipizzazioni con prove di immunofluorescenza indiretta o neutralizzazione con combinazione di pool di sieri neutralizzanti di Lin, Benyesh, Melnick (LBM) od altri reagenti commerciali 14,16. La preparazione e la colorazione dei campioni con reagenti commerciali per immunofluorescenza devono essere eseguite osservando in modo rigoroso le indicazioni del produttore. 4.3.2 INVIO AL LABORATORIO DI RIFERIMENTO 17 Devono essere inviati tutti i virus polio e quelli non identificati per accertare la loro appartenenza al tipo vaccinale o ad isolati selvaggi. 5 ASSICURAZIONE DI QUALITA Deve essere istituito un sistema di qualità per assicurare il mantenimento di un appropriata qualità interna ed esterna ed il controllo delle procedure della qualità 18-19. E essenziale che i laboratori abbiano la registrazione della validazione dei metodi, degli strumenti e delle procedure analitiche commerciali e proprie, che evidenzi in modo adeguato l idoneità allo scopo 20. 6 LIMITI L esito favorevole dell isolamento dipende da: corretto prelievo, trasporto, conservazione e procedura analitica del campione; qualità, numero delle linee cellulari utilizzate, adeguata condizione delle colture e disponibilità di sufficiente/appropriata documentazione clinica. Devono essere utilizzate esclusivamente linee cellulari sensibili all infezione da enterovirus. La sensibilità deve essere verificata al momento della loro acquisizione e ad intervalli regolari in corso di utilizzazione. Prima della loro utilizzazione le cellule prelevate dalla conservazione in azoto liquido devono essere verificate per la loro sensibilità. La procedura(e) di questo documento ha lo scopo di descrivere un buon metodo microbiologico standardizzato per la tipologia dei campioni specificati. Possono essere richieste altre procedure ed è essenziale l interpretazione dei risultati da parte di un gruppo professionale qualificato. Per cortesia, prendere nota che le conoscenze delle malattie infettive cambiano continuamente e, nonostante questo Metodo Nazionale Standard sia riveduto regolarmente, potrebbe non includere alcuni patogeni emergenti. 7 PROCEDURE DI REFERTAZIONE I campioni negativi devono essere refertati come: Virus non isolati I campioni positivi devono essere refertati come Isolato enterovirus (tipo xx) o Isolato enterovirus. Risultato della tipizzazione a seguire 8 SEGNALAZIONE ALL HPA 21 (SERVIZI LOCALI O REGIONALI ED AL CDSC CENTER FOR INFECTIONS) Qualsiasi risultato positivo deve essere segnalato al CDSC secondo le linee guida pubblicate. Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 8 di 11

9 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI Questo Metodo Nazionale Standard è stato proposto e sviluppato dal Virology Working Group on Standards and Quality (http://www.hpa-standardmethods.org.uk/wg_virology.asp). Si ringraziano per la collaborazione i numerosi operatori dei laboratori di virologia e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento, ed infine il Redattore Medico. I National Standard Method sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per altre informazioni prendere contatti con: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale London NW9 5EQ E-mail: standards@hpa.org.uk Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 9 di 11

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19. Curry A, Ashley CR. Quality assurance in electron microscopy. In: Snell JJS, Brown DFJ, Roberts C, editors. Quality Assurance Principles and Practice in the Microbiology Laboratory. London: Public Health Laboratory Service; 1999. p. 221-30. 20. Clinical Pathology Accreditation (UK) Ltd. Standards for the Medical Laboratory. Sheffield 2004. p. 1-56 21. PHLS, CDSC. Reporting to the PHLS Communicable Disease Surveillance Centre: a reference for laboratories. May. 2001. Revisione no: 2 Data di revisione: 02.05.06 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 11 di 11 y