Sviluppo di un sistema di acquisizione ed analisi di immagini digitali per gel elettroforesi Nicola Franchini Relatore Prof. Claudio Rivetti
INTRODUZIONE Tra le tecniche utilizzate nei laboratori di biologia molecolare, l elettroforesi su gel è sicuramente quella che annovera il più ampio campo di applicazioni. Infatti il suo impiego va dalla semplice separazione di DNA o proteine in base alla loro dimensione e carica elettrostatica, all analisi strutturale di macromolecole, come per esempio l analisi del piegamento intrinseco o indotto da proteine di frammenti di DNA, allo studio delle interazioni macromolecolari proteina-proteina o DNA-proteina, al sequenziamento degli acidi nucleici. Punto chiave dell elettroforesi è la capacità di separare le molecole che si muovono in un campo elettrico. Sebbene l elettroforesi possa essere condotta in soluzione acquosa, risulta più conveniente usare un mezzo di supporto. I due tipi di supporto più frequentemente utilizzati sono il gel di agarosio ed il gel di poliacrilamide immersi in una soluzione tampone. Al termine della corsa elettroforetica, le diverse specie molecolari che si sono separate nel gel vengono colorate con opportune sostanze al fine di renderle visibili e quindi valutabili. Nel caso del DNA, il colorante più frequentemente utilizzato è il bromuro di etidio, una sostanza intercalante e fluorescente, in grado cioè di inserirsi tra le basi della doppia elica e di emettere luce se illuminato con opportune lunghezze d onda. Per le proteine il metodo di colorazione più utilizzato è il Coomassie Blue che legandosi ai polipeptidi separati sul gel conferisce loro una colorazione blu intenso. A causa della loro natura gelatinosa, l archiviazione dei gel come tali risulta poco pratica e presenta alcuni rischi di tossicità data la presenza del bromuro di etidio o dell acrilamide. Nella maggior parte dei casi è quindi preferibile archiviare un immagine fotografica del gel. Fino a qualche anno fa la fotografia dei gel veniva ottenuta con dispositivi Polaroid che permettevano di avere l immagine su carta in pochi minuti. Con l avvento dell era digitale anche la fotografia ha subito notevoli cambiamenti primo fra tutti la comparsa delle fotocamere digitali, in grado cioè di acquisire un immagine digitale senza l utilizzo di alcuna pellicola fotografica. Le immagini vengono registrate in una memoria della fotocamera e quindi trasferite ad un personal computer dove possono essere ottimizzate, archiviate su supporti ottici o magnetici ed eventualmente riprodotte su carta. La notevole praticità offerta da questi sistemi, unita ad un contenuto costo iniziale e ad un bassissimo costo di utilizzo se confrontato con i sistemi Polaroid ci ha invogliato a mettere a punto un apparato ottimizzato per l'acquisizione delle immagini di gel basato su di un sistema fotografico digitale. Il progetto di questa tesi consiste quindi nell'adattare un esistente sistema Polariod in modo da poter montare indifferentemente una fotocamera classica con pellicole istantanee o una fotocamera digitale ad alta risoluzione.
Principi e pratica dell'elettroforesi La tecnica di separazione elettroforetica è basata sul movimento di molecole cariche all interno di un campo elettrico. Molecole dissimili si muovono con velocità diverse e che sono funzione del rapporto tra la carica elettrica e la massa della molecola; le molecole con carica netta positiva migrano all interno di un mezzo verso il catodo, mentre quelle con carica netta negativa migrano verso l anodo. Sebbene l'elettroforesi possa essere condotta in una soluzione tampone, gli effetti delle correnti di convezione (derivate dal riscaldamento dovuto al campo elettrico) e la diffusione delle molecole all'interno della soluzione tampone rendono preferibile eseguire l'elettroforesi su supporti porosi. Questi supporti, contenenti gli elettroliti del tampone ed il campione, permettono alle singole molecole di rimanere in zone ben definite mentre migrano a velocità diverse sotto l'azione del campo elettrico. I mezzi porosi introducono un ulteriore effetto di setaccio molecolare in quanto le dimensioni dei pori sono dello stesso ordine di grandezza delle dimensioni delle molecole che vengono separate e riducono il movimento delle molecole più grandi rispetto a quelle più piccole. Quindi la separazione dipende sia dalla densità della carica che dalle dimensioni della molecola. Per l'elettroforesi di proteine ed acidi nucleici, i supporti comunemente usati sono la poliacrilamide, un polimero solubile con legami crociati e l agarosio, un polisaccaride. La mobilità elettroforetica, cioè la velocità di migrazione di un particolare tipo di molecola in risposta ad un campo elettrico applicato dipende da: Carica netta: le molecole cariche negativamente (anioni) migrano verso l'anodo (+), mentre le molecole cariche positivamente (cationi) migrano verso il catodo (-); le molecole altamente cariche si muovono più velocemente verso l'elettrodo di carica opposta di quelle con carica minore.
Dimensione: la resistenza frizionale esercitata su molecole che si muovono in una soluzione fa sì che le molecole più piccole migrino più velocemente di quelle più grandi. Forma: l'effetto dell'attrito fa sì che la forma della molecola influenzi la mobilità, ad esempio proteine globulari rispetto a proteine fibrose, DNA lineare rispetto a DNA circolare. Forza del campo elettrico: la mobilità aumenta con la forza del campo elettrico (voltaggio), ma vi sono limiti pratici all'uso di alti voltaggi, specialmente a causa del riscaldamento. L'influenza combinata della carica netta e delle dimensioni fanno sì che la mobilità (µ) sia determinata da: qe µ = r in cui q è la carica netta della molecola, r è il raggio molecolare ed E la forza del campo. Elettroforesi di DNA e Proteine Gli acidi nucleici in soluzione hanno generalmente una carica elettrica negativa, dovuta alla ionizzazione dei gruppi fosfato; migrano perciò verso il polo positivo. Generalmente il rapporto tra la carica e la massa delle lunghe catene degli acidi nucleici è costante in quanto ogni monomero contribuisce con la stessa carica e all incirca la stessa massa. Ne deriva che nell'elettroforesi su gel, gli acidi nucleici vengono separati in base alla loro lunghezza. Per le proteine la situazione è leggermente diversa in quanto la carica netta di una proteina dipende dal ph ed è determinata dal numero relativo di amminoacidi carichi negativamente e positivamente ad un dato ph. Viene definito punto isoelettrico della proteina quel particolare ph a cui la carica netta della proteina è zero. Ad un ph superiore al punto isoelettrico la proteina avrà una carica netta negativa mentre avrà una carica netta positiva a ph inferiori al punto isoelettrico. Per separare le proteine in base alla loro massa molecolare (dimensione), si rende quindi necessario utilizzare uno stratagemma al fine di conferire alle proteine una carica netta che sia indipendente dalla loro composizione amminoacidica. In tal modo, la mobilità elettroforetica delle proteine dipenderà solo dalla loro dimensione. Inoltre, prima e durante la corsa elettroforetica le proteine verranno mantenute allo stato denaturato per uniformare la resistenza frizionale incontrata durante il movimento nella matrice gelatinosa. Le proteine, prima di essere caricate sul gel vengono denaturate al calore e trattate con il detergente SDS (sodio dodecil solfato) che legandosi agli amminoacidi mantiene la proteina in stato denaturato e che a ph intorno alla neutralità conferisce alla proteina una carica netta negativa. Gli apparati elettroforetici Gli apparati elettroforetici maggiormente utilizzati sono quelli ad immersione per i gel di agarosio e quelli verticali per i gel di poliacrilamide. I primi prevedono che il gel disposto orizzontalmente all'interno di una vaschetta sia completamente sommerso dal tampone. Il campo elettrico viene creato applicando una differenza di potenziale, che dipende dalle dimensioni del gel, all'estremità della vaschetta. Gli apparati verticali utilizzano invece lastre di vetro che sostengono il gel messo in contatto con due vaschette contenenti il tampone ed il campo elettrico viene creato applicando una differenza di potenziale tra le due vaschette. In entrambi i casi il caricamento del campione viene fatto in una soluzione contenente glicerolo al fine di rendere la soluzione del campione più densa del tampone di corsa ed un tracciante colorato idrosolubile per seguire il progredire della corsa.
Marcatori di Taglia Per poter stabilire la lunghezza delle varie specie molecolari presenti nel nostro campione risulta conveniente caricare sul gel, accanto al campione, un marcatore di taglia. Nel caso del DNA si tratta di una serie di frammenti di DNA di lunghezza nota e definita, mentre nel caso delle proteine si tratta di proteine a peso molecolare noto. Al termine dell'elettroforesi, il confronto tra la mobilità del campione rispetto al marcatore di taglia permetterà di determinare con buona approssimazione la dimensione (PM) del campione in esame. Rilevamento delle bande mediante colorazione Sia il DNA che le catene polipeptidiche non assorbono luce visibile, non hanno quindi colore e non possono essere direttamente visibili nel gel al termine dell'elettroforesi. Per permettere la facile individuazione delle bande esistono svariati mezzi di colorazione sia per il DNA che per le proteine. La colorazione maggiormente utilizzata per evidenziare le proteine nei gel è il Coomassie Blue R-250 che ha un limite di rilevazione di circa 0.2 µg e la colorazione è quantitativa fino a 20 µg. Per il DNA invece il colorante maggiormente utilizzato è il bromuro di etidio che intercalandosi tra le coppie di basi rende il DNA fluorescente. Il bromuro di etidio si intercala nel DNA con una frequenza di una molecola per 2,5 bp ed ha un limite di rivelazione di circa 10 ng. Mentre la colorazione al Coomassie Blue permette la visualizzazione delle bande con luce bianca, la visualizzazione del DNA nel gel mediante bromuro di etidio richiede che il gel venga illuminato con una sorgente di luce UV (transilluminatore). Le radiazioni UV a 254 nm sono assorbite dal DNA e trasmesse al colorante mentre le radiazioni a 302 nm e 366 nm sono assorbite dallo stesso colorante legato al DNA. In entrambi i casi, l energia assorbita dal bromuro di etidio viene riemessa sottoforma di radiazione luminosa con una lunghezza d'onda di 590 nm che conferisce alle bande di DNA una caratteristica colorazione arancione. Poiché la resa in fluorescenza del complesso bromuro di etidio DNA è circa 20-30 volte maggiore di quella del colorante non legato, bande contenenti DNA risultano molto più luminose rispetto al resto del gel. Il bromuro di etidio può essere usato per evidenziare DNA o RNA sia a singolo che a doppio filamento, anche se l affinità per gli acidi nucleici a singolo filamento è relativamente bassa e la resa in fluorescenza è minore. Al fine di aumentare il contrasto delle bande evidenziate, sia nel caso della colorazione al Coomasie Blue che in quella al bromuro di etidio è consigliabile effettuare una procedura di decolorazione che permetta di togliere dal gel il colorante in eccesso.
Nella maggior parte dei casi la realizzazione di un'indagine elettroforetica implica la necessità di documentare in modo fedele il risultato ottenuto. La poca praticità di conservare il gel come tale, unita alla possibile tossicità dell'acrilamide e del bromuro di etidio, rende la riproduzione fotografica il metodo d'eccellenza per documentare risultati di elettroforesi. I sistemi di ripresa oggi in commercio riguardano un ampio mercato con prestazioni e costi altamente variabili. Tra i più diffusi vi è il sistema Polaroid che mediante pellicole istantanee è in grado di fornire un'immagine del gel in pochi minuti. Una configurazione molto versatile di questo sistema consiste in una camera montata su di un supporto piramidale che impedisce alla luce ambiente di interferire con la luce del transilluminatore su cui si trova il gel. Un'impugnatura a "pistola" permette inoltre un'estrema facilità di utilizzo. Polaroid CU-5 Land Camera Vantaggi e svantaggi di un sistema di riproduzione digitale rispetto al sistema Polaroid tradizionale Benché il sistema Polaroid presenti una notevole praticità di utilizzo esso comporta una serie di svantaggi che rendono altri sistemi di riproduzione preferibili. Per esempio l'impossibilità di agire sull'immagine una volta acquisita e l'unicità dell'immagine stessa; il decadimento qualitativo sia delle fotografie scattate che delle lastre da impressionare; la difficoltà di ottenere un'immagine ottimale con un solo scatto che si somma all'elevato costo per scatto (un'istantanea costa circa 2 Euro); l'impossibilità di effettuare un'analisi quantitativa; la difficoltà di archiviazione. Con lo sviluppo delle fotocamere digitali è oggi possibile sopperire a tutti gli svantaggi del sistema Polaroid tradizionale mantenendo la praticità e versatilità che lo contraddistingueva. Le fotocamere digitali garantiscono, oltre ad avere l'immagine in formato digitale e quindi suscettibile di tutti quei
vantaggi che ciò comporta, un'alta fedeltà nella riproduzione (la sensibilità dei CCD utilizzati consente di percepire variazioni cromatiche minime in condizioni di illuminazione molto varie e critiche), la possibilità di ottimizzare l'immagine anche in tempi successivi alla sua acquisizione, la facilità di archiviazione e consultazione, il basso (praticamente nullo) costo per scatto. Ciò consente anche di effettuare più esposizioni per uno stesso gel. A parte una leggera variazione tonale tra scatti diversi, il sistema digitale non presenta svantaggi rilevanti. Il prezzo sempre più accessibile di queste apparecchiature rende il sistema digitale vantaggioso anche sotto il profilo puramente economico. Non è errato ritenere che in un laboratorio di medie dimensioni il costo dell'apparecchiatura digitale possa essere ammortizzato nel giro di pochi mesi. L acquisizione dell immagine scomposta nei tre canali (RGB) che costituiscono i colori fondamentali della luce (Rosso, Verde e Blu), ci permette di valutare al meglio i contrasti cromatici e sfruttare un singolo canale, per isolare informazioni sull immagine stessa. Mediante l'elaborazione successiva dell'immagine sarà possibile scegliere il canale che meglio rileva la colorazione e da questo ottenere un immagine in bianco e nero con più dettaglio, più contrasto e meno rumore. Per esempio gel di proteine colorati con Coomassie Blue possono essere ottimizzati utilizzando solo il canale del Verde. Per quanto riguarda invece i gel colorati con bromuro di etidio, con un'emissione di luce a 590 nm, le migliori immagini saranno ottenute utilizzando il solo canale del Rosso. Siccome la ripresa fotografica di un gel colorato al bromuro di etidio viene eseguita illuminando il gel con luce UV, la presenza di un filtro che non faccia passare radiazioni con lunghezza d'onda inferiori a 405 nm e caratterizzato da una lunghezza d onda dominante di 579,5 nm, aumenterà notevolmente la qualità dell'immagine. Per questo scopo, date le sue caratteristiche, si è utilizzato un filtro in gelatina della serie Kodak Wratten, che causa ben pochi problemi ottici e che con buona cura dura parecchio anche se non può essere pulito e viene danneggiato facilmente da impronte e graffiature. Curva spettrofotometrica del filtro utilizzato Kodak Wratten 2A
Il sistema di acquisizione digitale che abbiamo realizzato presenta tutti i vantaggi della tecnologia digitale e conserva tutte le caratteristiche di praticità e versatilità del sistema Polaroid tradizionale. Infatti, per la sua realizzazione ci siamo serviti di una parte dell'apparato Polaroid (il tubo di ripresa) sul quale è stata adattata una camera digitale. L'apparato ottenuto potrà quindi montare indifferentemente una camera Polaroid tradizionale o una camera digitale e la transizione può essere effettuata facilmente in pochi secondi. Scelta della fotocamera Il primo passo consiste nella scelta di una camera digitale che soddisfi tutte le caratteristiche richieste per questo tipo di applicazione. Dopo aver analizzato diversi modelli si è scelto di utilizzare una PENTAX Optio 330 RS che presenta le seguenti caratteristiche: CCD con 3,2 Milioni di pixel Zoom ottico Possibilità di memorizzare le impostazioni Connessione al PC mediante porta USB Taratura manuale del bianco Corta distanza di messa a fuoco Tempi di esposizione lunghi Radiocomando IR Possibilità di funzionare mediante alimentatore Costo contenuto
Per poter fissare la camera digitale sul supporto di ripresa è stato costruito un adattatore che può essere fissato al tubo di ripresa mediante viti, che permette il facile aggancio del corpo della macchina fotografica e che ha la possibilità di montare filtri diversi a seconda della luce utilizzata per illuminare il gel.
Preparazione di un gel di poliacrilamide per la separazione di proteine da utilizzare come test Sol. proteine: 2,5 µl BSA 20 µg/µl Vol. proteine finale 15 µl 5 µl Lys 10 µg/µl Vol. coomassie blue 5 µl 10 µl A C 5 µg/µl Vol. caricato 20 µl 82,5 µl H 2 O 1 2 4 6 8 10 12 14 µl Soluzione proteine 14 13 11 9 7 5 3 1 µl H 2 O Il gel ottenuto è stato fotografato con diverse impostazioni di messa a fuoco, tempi e diaframmi e si è concluso che le impostazioni migliori per la riproduzione fotografica di gel di proteine illuminato con luce bianca, sono le seguenti: Modalità M Messa a fuoco MF 0,4 Bilanciamento bianco Tempo 1/250 Diaframma f 7,3 Modalità M Messa a fuoco MF 0,4 Bilanciamento bianco Tempo 1/250 Diaframma f 7,3 Canale del verde
Preparazione di un gel di agarosio per la separazione di DNA da utilizzare come test Il gel è stato preparato con quantità crescenti di un marcatore di taglia noto, lo SmartLadder, che produce un pattern di 14 bande regolarmente spaziate, che coprono un range che va da 200 a 10000 bp. 0,5 1 2 3 4 5 6 7 µl DNAM 10,3 9,8 8,8 7,8 6,8 5,8 4,8 3,8 µl H 2 O 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 µl Dye Il gel ottenuto è stato fotografato con diverse impostazioni messa a fuoco, tempo e diaframma e si è concluso che le impostazioni migliori per la riproduzione fotografica di gel colorati con etidio bromuro ed illuminati con luce UV (312nm) sono le seguenti: Modalità M Messa a fuoco MF 0,4 Bilanciamento bianco Display Tempo 1,3 sec Diaframma f 7,3 Filtro Kodak Wratten 2A Riproduzione fotografica di piastre con colonie batteriche
Oltre alla documentazione dell'analisi elettroforetica, l'apparato fotografico da noi costruito può essere utilizzato anche per la riproduzione fotografica di piastre con colonie batteriche. Lo scopo può essere quello della semplice archiviazione o il conteggio automatico delle colonie presenti sulla piastra mediante software. La fotografia di piastre di agarosio è stata effettuata su transilluminatore a luce bianca impostando i seguenti valori di ripresa: Modalità M Messa a fuoco MF 0,4 Bilanciamento bianco Display Tempo 1/250 Diaframma f 7,3 Trasferimento delle immagini su PC
Le immagini scattate con la fotocamera digitale possono essere facilmente e velocemente trasferite su un PC mediante la connessione USB (Universal Serial Bus). Questa operazione non richiede PC con particolari prestazioni in quanto le immagini dopo essere state scaricate sul PC vengono trasferite, via internet, sui PC degli utenti per l'analisi e l'archiviazione. Abbiamo quindi utilizzato un PC di qualche anno fa sul quale sono stati installati i driver necessari per la connessione con la fotocamera. Questo ci ha permesso di avere un computer interamente dedicato all'acquisizione delle immagini dei gel. Ottimizzazione delle immagini dopo l'acquisizione Uno dei vantaggi della fotografia digitale è la possibilità di intervenire sull'immagine in qualsiasi momento mediante software per l'elaborazione di immagini e foto ritocco. Il più diffuso è sicuramente Adobe Photoshop che mediante alcune semplici operazioni permette di ottimizzare il contrasto, la luminosità dell'immagine, il livello dei diversi colori nonché la possibilità di rimuovere dall'immagine eventuali impurità. La maggior parte delle modificazioni utili da effettuare sull'immagine di un gel possono essere compiute mediante l utilizzo di regolazioni come Luminosità e Contrasto oppure Curve. CONCLUSIONI In questo lavoro di tesi si è dimostrata la possibilità di adattare un sistema Polaroid tradizionale per la riproduzione di gel con un sistema fotografico digitale pur mantenendo le caratteristiche di praticità dell'apparato Polaroid. Questo ha permesso di acquisire tutti i vantaggi connessi alla disponibilità dell'immagine del gel in formato digitale. Inoltre il basso costo di esercizio della camera digitale rispetto alle tradizionali istantanee Polaroid, rende questo sistema interessante anche dal punto di vista economico. Il costo complessivo per la realizzazione di questo apparato è stato di circa 600 Euro. Costo che va confrontato con le diverse migliaia di Euro dei sistemi digitali di documentazione dei gel che si trovano attualmente in commercio.