RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G La superfamiglia dei recettori accoppiati alle proteine G è costituita da proteine integrali di membrana caratterizzate da sequenze di amminoacidi che contengono molti domini idrofobici. Questi sono situati nelle regioni transmembranali delle proteine e sono il motivo del nome che gli è stato assegnato: recettori 7-TM o eptaeliche. I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono rappresentati in moltissimi organismi e molti tipi di messaggeri chimici svolgono la loro azione attraverso essi. Appartengono a questa categoria molti neurotrasmettitori o neuromodulatori, come messaggeri monoamminici (adrenalina, acetilcolina, serotonina, istamina, dopamaina, ecc.) oppure lipidi (prostaglandine, cannabinoidi e endogeni), neuropeptidi, (neuropeptide y, sostanza P, colecistochinina, oppiodi,ecc.) e proteine ormonali (glucagone, angiotensina, bradichinina), proteine piccole (chinochinina) e proteine grandi (glicoproteine ormonali, trombina acc.). Tutti questi messaggeri sono coinvolti nella trasmissione del segnale all interno della cellula attraverso l interazione con le proteine eterotrimeriche G. Inoltre appartengono a questa famiglia importanti proteine sensoriali, come la rodopsina e i recettori olfattivi. Figura 1: rappresentazione di recettore accoppiato a proteina G 6
CARATTERISTICHE STRUTTURALI DEI RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G La grandezza dei GPCR può variare molto significativamente: da meno di 300 amminoacidi a 300-370 residui fino a 350-600 residui per il peptide ormonale a monoammina, a 650-750 amminoacidi per recettore proteico e anche più di 1100 amminoacidi per il recettore del glutammato ametabotropico. Tutti i membri della famiglia contengono 7 domini idrofobici di 20-25 amminoacido di lunghezza, che rappresentano le regioni di transmembrana. Si suppone che questi domini siano strutturalmente simili sulla base della struttura della batteriorodopsina, per cui sono disponibili dati di diffrazione [1]. Essi sono formati da α- eliche orientate a formare una tasca per il binding del ligando. Uno studio sulla conformazione della proteina ha portato ad evidenziare che la sequenza N-terminale è extracellulare e quella C-terminale intracellulare. Quindi si ritiene che ogni recettore abbia una zona N-terminale extracellulare che può variare in lunghezza da meno di 10 amminoacidi a molte centinaia, seguito poi da tre set di loop extra ed intracellulari e un sequenza finale C-terminale. Si stima che la maggioranza dei loop extra ed intra cellulare sia composta da 10 e 40 residui tenendo conto che il terzo loop intracellulare e la sequenza C- terminale possono avere più di 150 residui. Le sottofamiglie delle GPCR sono caratterizzate dalla lunghezza dei segmenti extracellulari ed intracellulari e dall identità di specifici residui, benchè molte caratteristiche siano simili tra i vari recettori : ad esempio, un peso molecolare più alto fa supporre che il recettore sia glicosilato e gran parte di esso contenga uno o più residui di aspargina nella parte N-terminale, anche se alcuni recettori possono essere glicosilati in altri loop extracellulari. La glicosilazione può aumentare il peso molecolare fino a 20 kd e il glucoside aggiunto può costituire fino al 30% del peso del recettore totale. Anche se la glicosilazione può essere importante nella determinazione della corretta distribuzione del recettore nella cellula e nell espressione cellulare, si ritiene comunque 7
giochi un ruolo minore nel binding degli agonisti della maggior parte dei recettori. Sono presenti inoltre un residuo di cisteina al finale C-carbossilico del primo loop extracellulare e un secondo nel mezzo del secondo loop extracellulare. Ciò comporta la formazione di un importate ponte disolfuro. E stato dimostrato nella rodopsina che questo ponte è essenziale per il corretto folding della proteina SOTTOFAMIGLIE DEI RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G Si conosce la struttura primaria di più di 300 recettori accoppiati a proteina G, i quali sono suddivisi in sottofamiglie. I criteri seguiti per la loro suddivisione possono basarsi sul tipo di ligando oppure sul modo ipotetico in cui avviene il binding, o sul tipo di proteina G con cui avviene l interazione. Si possono distinguere tre grandi tipi di sottofamiglie: la famiglia delle rodopsine-simili, delle calcitonine-simili e dei recettori metabotropici del glutammato. Tutti hanno in comune il fatto che è presente un ponte disolfuro tra un residuo di cisteina nella parte alta del terzo dominio transmembrana e un altro nel secondo loop extracellulare. La batteriorodopsina risulta avere sequenza amminoacidiche completamente diverse dalla GPCR, ma presenta una struttura simile a sette eliche. La maggior parte dei recettori clonati appartiene alla sottofamiglia rodopsine-like, che include recettori che legano amine bioattive, lipidi, purine, chinine, endoteline, NPY, opsine e rodopsine. Un numero di residui polari sono conservati nella zona transmembranale: Asn18 su TM1, Asp10 su TM2, Arg26 su TM3 e Asn16 su TM7. Questi residui creano probabilmente una rete di legami idrogeno che sono importanti per la struttura del recettore. Un quarto loop intracellulare, formato da un residuo di cisteina palmitoato nel segmento C- terminale, può intervenire nella desensibilizzazione nel recettore. Il secondo loop intracellulare e parte del terzo loop intracellulare e parte del segmento C-terminale sono coinvolti nella interazione della proteina G. 8
I recettori dell adenosina, oggetto di questa tesi, appartengono a questa sottofamiglia.. Inizialmente i recettori purinergici che mediano gli effetti dell adenosina erano stati chiamati generalmente recettori P1. La scoperta della loro capacità di regolare i livelli intracellulari di camp ha costituito la base per la loro iniziale classificazione in recettori A 1, i quali inibiscono l adenilato-ciclasi (responsabile della sintesi di camp), e in recettori A 2, che invece la stimolano. L ulteriore suddivisione dei recettori A 2 in due sottotipi è stata proposta da Daly et al. nel 1983 sulla base della scoperta di siti ad alta affinità per l adenosina presenti sulle membrane delle cellule striatali del ratto e di siti a bassa affinità presenti, invece, nel resto del cervello, siti in grado, gli uni e gli altri, di stimolare l attività dell adenilati-ciclasi. L esistenza di due distinti sottotipi di recettori A 2 è stata suggerita anche dalla scoperta della presenza di siti ad alta affinità in colture di cellule di neuroblastoma e di siti a bassa affinità in cellule di glioma. Questi siti ad alta e a bassa affinità sono stati successivamente chiamati rispettivamente recettori A 2A e recettori A 2B. Attualmente la classificazione dei recettori adenosinici P1 prevede la loro suddivisione in quattro sottotipi sulla base della diversità delle loro strutture molecolari, della loro distribuzione tissutale e dei loro profili farmacologici. Si hanno, perciò, recettori A 1 e A 3 (che inibiscono l attività dell adenilato-ciclasi) e recettori A 2A e A 2B (che stimolano l adenilato-ciclasi) [2]. La maggior parte dei peptidi ormonali o neuropeptidi sono ligandi di proteine appartenenti alla famiglia delle calcitonine. I peptidi glucagone-simile, il glucagone, il peptide inbitorio della gastrina, secretina, il peptide intestinale vasoattivo, calcitonina,ecc, sono alcuni esempi di ligandi che interessano questa sottofamiglia. Il segmento N-terminale (100 150 residui) di questa sottofamiglia contiene sei residui di cisteina che potrebbero interconnettersi attraverso ponti disolfuro formando ipoteticamente un dominio di binding del ligando di forma globulare. Ci sono inoltre molt residui di prolina conservati localizzati su differenti posizioni sui recettori per la rodopsina. 9
Il terzo e più piccolo gruppo di recettori accoppiati a proteine G è quello dei recettori per il glutammato. E caratterizzato a un enorme segmento N-terminale (500-600 amminoacidi) e un altrettanto grande dominio C-terminale. I segmenti transmembranali sono connessi da un piccolo loop e con una sequenza non omologa. SISTEMA DI TRASMISSIONE PROTEINE G Molti ligandi extracellulari agiscono aumentando la concentrazione di secondi messaggeri come l AMP ciclico, lo ione calcio e fosfatilidinositoli. In molti casi essi usano un sistema di trasmissione transmembrana costituito da tre componenti. In primo luogo, il ligando extracellulare è riconosciuto da un recettore di membrana. Il recettore attiva a sua volta una proteine G localizzata sul lato citoplasmatico della membrana. La proteina G attivata modifica l attività di un effettore, di solito un enzima o un canale ionico. Quest ultimo determina una variazione di concentrazione di un secondo messaggero intracellulare. La corrispondente proteine G, chiamate G s, stimola l adenilato ciclasi dopo essere stata attivata da una grande varietà di ormoni e neurotrasmettitori, ciascuno dei quali agisce attraverso uno specifico recettore. G s e altre proteine utilizzano un meccanismo molecolare che implica il legame e l idrolisi di GTP. 10
Figura 2: schema di funzionamento delle proteine G 11
La proteina G s può esistere in due forme. Quando il suo sito che lega il nucleotide guanosidico è occupato dal GTP, G s è nella sua forma attiva e può interagire con l adenilato ciclasi, attivandola a sua volta. Quando il sito contiene invece GDP la proteina G s è inattiva e incapace di attivare la ciclasi. L attivazione dell adenilato ciclasi da parte della G sα è autolimitante; la G sα ha una debole attività GTPasica e si inattiva da sola convertendo il GTP in GDP. La G sα inattiva si dissocia dall adenilato ciclasi e si riassocia alla subunità β e γ. In questo modo l adenilato ciclasi ritorna inattiva e la proteina G s ricomposta è pronta per l interazione con il recettore cui si è legato l ormone. La trasduzione del segnale attraverso l adenilato ciclasi presenta due tappe in sequenza che amplificano il segnale ormonale. In primo luogo una molecola di ormone legata al recettore attiva cataliticamente diverse molecole di proteina G s. In seguito, attivando una molecola di adenilato ciclasi, una molecola G sα determina la sintesi catalitica di molte molecole di camp. L effetto di questa cascata è un amplificazione del segnale ormonale. A seguito dell interazione G s -GTP, la durata dell attivazione dell adenilatociclasi dipenderà dalla longevità del legame G s a GTP. Infatti, G s legata a GTP rimane attiva per decine di secondi il che amplifica enormemente il segnale originario. La famiglia delle proteine G comprende proteine diverse fra di loro; oltre alla G s che stimola l adenilatociclasi, vi sono anche le proteine G i ( i sta per inibitorio), che si legano ai recettori per inibire la produzione di adenilatociclasi. La sottofamiglia delle G i include due proteine chiamate anche trasducine, G t1 e G t2,che mediano la trasduzione dei bastoncelli e nei coni della retina. 12
TABELLA 1: rappresenta la distribuzione e la funzionalità fisiologica delle proteine G ADENOSINA Figura 3: rappresentazione strutturale tridimensionale dell'adenosina L adenosina non è un tipico ormone o neurotrasmettirore, ma è probabilmente il più importante neuromodulatore nel sistema nervoso centrale e periferico. Un neuromodulatore è 13
una molecola che ha effetti modulatori sull attività neuronale, incrementando o diminuendo l azione della cellula neuronale. I neuromodulatori sono distinti dai neurotrasmettitori perché sono specificatamente coinvolti nella zona presinaptica, rilasciati nello spazio sinaptico, e interagiscono con i recettori post sinaptici. Un neuromodulatore, come l adenosina, può essere liberato molto più facilmente durante una bassa o alta attività metabolica. Alcuni esempi del ruolo dell adenosina possiamo trovarli nella liberazione dal muscolo durante una ischemia, e in alcuni casi anche dai muscoli che si contraggono con un apporto sanguigno normale, anche se il nucleoside rende conto di una parte della vasodilatazione indotta dall atticità solo nei muscoli veloci di tipo ossidativo. I livelli di adenosina nel cervello aumentano con l ischemia, l ipossiemia, l ipotensione, l ipocapnia, la stimolazione elettrica del cervello o gli attacchi epilettici. Per applicazione topica, l adenosina agisce come un potente dilatatore per le arteriose piali. In breve, ogni situazione che o riduce l apporto di ossigeno al cervello o aumenta la richiesta di ossigeno da parte del tessuto cerebrale provoca una rapida formazione di adenosina nei tessuti cerebrali. Contrariamente al ph e alla concentrazione di K +, la concentrazione di adenosina nel cervello aumenta con l inizio dello stimolo e rimane elevata per tutto il periodo in cui l ossigeno è insufficiente. L adenosina liberata nel liquido cerebrospinale durante le condizioni di inadeguato apporto d ossigeno al cervello aumenta e rimane disponibile per la reincorporazione negli adenin-nucleotidi del tessuto cerebrale. Con tutta probabilità, questi tre fattori, il ph, la concentrazione di K + e l adenosina, agiscono di concerto per adeguare il flusso ematico cerebrale all attività metabolica del cervello, ma deve ancora essere chiarito come questi fattori interagiscano tra loro nel compiere questa regolazione. 14
STRUTTURA GENOMICA DEI RECETTORI ADENOSINICI La struttura genomica appare essere simile per tutti i recettori dell adenosina. C è un singolo introne che interrompe la sequenza codificata corrispondente al secondo loop intracellulare [3-5] Quando la struttura del recettore più studiato, l A 1, fu riportata per la prima volta, venne notata la presenza di due grandi trascrizioni [6,7]. I trascritti contenenti tre esoni, chiamati esoni 4,5, e 6 furono trovati in tutti i tessuti in cui è espresso il recettore, mentre quelle contenenti anche esoni 3, 5, e 6 furono trovati in tessuti che esprimono alte concentrazioni di recettori come il cervello, testicoli, e rene. Ci sono due promotori, uno prossimale denominato promotore A, e uno distale denominato promotore B, distanti circa 600 paia di basi, il promotore B e l esone 1B sono parti di un introne quando il promoter A è attivo. E stato ipotizzato che entrambi i promotori non presentino la tradizionale sequenza TATA. [7] Il promoter A contiene essenzialmente elementi per l espressione del recettore A 1 ; nei ratti l espressione principale sta nella ß- galattosidasi. In ogni modo il promoter contiene i siti d attacco del GATA e per NKx2.5, i quali guidano l attività del promotore e il suo atto sinergico.[9] IL promotore B è attivato dai glucocorticoidi. È risaputo che i glucorticoidi possono stimolare l espressione dei recettori A 1 nelle cellule DDT 1 MF-2 e nel cervello. [10] La clonazione di molti dei cromosomi 22, dove i recettori A 2A sono localizzati suggerisce una struttura con due esoni che è simile a quella riportata dal ratto. [11] I recettori A 2A mostrano un ibridizzazione nella trascriptasi in molti tessuti esaminati. L espressione dei recettori A 2A può essere stimolata dalla protein chinasi ma non si conoscono i fattori della trascrizione. Si può affermare che gli A 2A sono polimorfi. 15