Encefalite Spongiforme Trasmissibile del Bovino Dr.ssa Paola Marconi IZSLT Laboratorio TSE animali 20 Corso Nazionale per Tecnici di Laboratorio Biomedico Riccione, 21 24 maggio 2013
L approccio interdisciplinare P. Daszak Science Vol 287-2000
Tra le patologie emergenti degli ultimi due decenni l encefalopatia spongiforme bovina è, con l AIDS, quella che ha avuto maggiore risonanza soprattuto per il legame individuato con la nuova variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob nell uomo
Encefaliti Spongiformi Trasmissibili ANIMALI Scrapie Encefalopatia spongiforme bovina Encefalopatia trasmissibile del visone Malattia del dimagramento cronico Encefalopatia spongiforme felina
ENCEFALOPATIE SPONGIFORMI TRASMISSIBILI Eziologia EST: malattie degenerative a lento decorso del sistema nervoso centrale indotte da prioni. PRIONI: (proteinaceous infectious particles Prusiner) piccole particelle proteinacee infettanti. La proteina prionica (PrP) è una glicoproteina idrofobica di 253 aminoacidi e di 33-35 kda di peso molecolare. E codificata da un gene denominato PRNP localizzato sul braccio corto del cromosoma 20 In condizioni patologiche la PrP normale (PrPc) si trasforma in PrPsc (da scrapie) o PrPres (da resistente)
Caratteristiche comuni alle EST Lungo periodo di incubazione Sintomatologia di tipo neurologico Decorso clinico progressivo e costantemente fatale Lesioni di tipo prettamente degenerativo a livello del SNC Non si rilevano lesioni infiammatorie Non si rilevano risposte immunitarie da parte dell organismo Costante presenza di proteina prionica Resistenza a numerosi agenti fisici o chimici in grado di inattivare altri microrganismi
EZIOLOGIA DELLE EST La proteina prionica resistente (patologica) si forma in seguito ad alterazioni conformazionali della proteina cellulare normale (sensibile) PrPc PrPres Ricca Alfa eliche Alto contenuto in foglietti beta
Differenze fisico-chimiche tra PrP cellulare PrP resistente solubile PrPc idrofoba facilmente PrPres molto poco autoaggregabile digestione completa con le proteasi e le fosfolipasi solubile e distrutta con i detergenti localizzazione esclusiva nella membrana cellulare turnover cellulare rapido ed emivita breve (qualche ora) presenza in tutte le cellule dell organismo distruzione facile conformazione spaziale con molte alfa-eliche autoaggregabile e polimerizzabile digestione parziale con le proteasi e le fosfolipasi insolubile nei detergenti localizzazione cellulare intracitoplasmatica nei lisosomi secondari e nel neuropilo, e localizzazione extracellulare (placche) sintesi lenta e stabile presenza quasi esclusiva nel sistema nervoso centrale resistenza notevole agli agenti fisici e chimici conformazione con molti foglietti beta ripiegati
IPOTESI Meccanismo autocatalitico responsabile di produzione massiva di PrP res PROTEINA PRIONICA CELLULARE PROTEINA PRIONICA PATOLOGICA Si ipotizza che l'isoforma PrPSc trasmetta la sua caratteristica resistenza all'isoforma PrPC, e che questo provochi un accumulo di materiale proteico che causerebbe la malattia. Questo tipo di modificazione strutturale, da una conformazione prevalentemente alfa-elicoidale ad una forma denominata beta-prp è stata riprodotta in vitro, e l'attitudine della forma beta-prp a costituire aggregati fibrillari sembra fornire un plausibile meccanismo molecolare della propagazione del Prione.
CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE cause: mutazioni spontanee o genetiche che modificano così la struttura della proteina normale; dall'esterno, quando una proteina prionica anomala forma un complesso con una molecola prionica nativa alterandone la conformazione, creando perciò un'altra proteina prionica anomala non degradabile
La proteina prionica cellulare viene sostituita progressivamente da proteina prionica patologica con specifiche localizzazioni anatomiche, in forma di accumuli
L evento patogenetico peculiare delle EST è l accumulo a livello cerebrale di una proteina amiloidea caratteristica denominata PrPres in quanto resistente alle proteasi che deriva da un precursore (PrPsen ) biologico identico per sequenza aminoacidica e modificazioni post-trasduzionali alla PrPres, ma ne differisce per la struttura secondaria
MICROSCOPIA ELETTRONICA Scrapie associated fibrils (SAF) Fibrille scrapie Microfotografia computerizzata La proteina prionica PATOLOGICA tende a depositarsi sotto forma di fibrille amiloidee nel SNC dei soggetti colpiti causando malattia L'osservazione al microscopio elettronico permette di evidenziare fibrille con struttura ad elica semplice o doppia di 100-500 nm di lunghezza
ISTOLOGIA Spongiosi da moderata a grave del neuropilo e vacuolizzazione dei neuroni Vacuolizzazione del neuropilo nel nucleo del tratto solitario e e nel nucleo del tratto spinale del nervo trigemino Vacuolizzazione dei neuroni del complesso dei nuclei vestibolari; nella formazione reticolare, nel nucleo dorsale del vago Astrocitosi Perdita neuronale
ISTOLOGIA Vacuolizzazione, perdita neuronale
ISTOLOGIA Bovino, SNC, nucleo del tratto solitario (midollo allungato) spongiosi nel neuropilo. Ematossilina-eosina
IMMUNOISTOCHIMICA su sezioni di tessuto cerebrale incluse in paraffina. Viene messa in evidenza la presenza di PrPsc mediante pretrattamenti atti a denaturare la PrPc e a smascherare i siti antigenici con l'uso di anticorpi monoclonalie policlonali anti-prp. Deposito di PrP in tutte le aree cerebrali con aspetto comune caratterizzato da accumulo diffuso, fine o grossolano, nel neuropilo Deposito di PrP puntiforme nel nucleo dorsale del nervo vago Aspetto a corona di rosario dei depositi PrP Piccoli depositi di PrP simili a placche nel neuropilo
IMMUNOISTOCHIMICA Bovino, SNC, mesencefalo, tratti lineari di PrPsc - anticorpo policlonale p7/7. Metodica utilizzata: immunoistochimica
CORRELAZIONE BSE /malattia di Creutzfeld Jacob variante nell uomo A sporadic CJD B NEW VARIANT CJD C Kuru D BSE Histopathology shows spongiform changes in brain (pictures A-C Hans Kretzschmar, München, D Martin Groschup, Insel Riems)
ENCEFALITE SPONGIFORME BOVINA diffusione enzootica 1-2 soggetti/allevamento periodo di incubazione lungo da 2 anni e mezzo fino a 8 anni (media di 4-5 anni) decorso clinico piuttosto lungo (2-6 mesi) osservata soprattutto in bovine di 4-6 anni prevalentemente da latte contagio, per via alimentare
RILIEVI CLINICI BSE iperestesia Disturbi della sensibilità ipereazione stimoli tattili, acustici luminosi Turbe del comportamento apprensione, paura, aggressività Altro Calo peso, riduzione produzione lattea Alterazioni locomotorie Atassia, paresi, paralisi Disturbi da SNA Bradicardia
EFSA Documenta alcuni atteggiamenti caratteristici nella epidemia inglese
EFSA Documenta alcuni atteggiamenti caratteristici nella epidemia inglese
EFSA Documenta alcuni atteggiamenti caratteristici nella epidemia inglese
RILIEVI CLINICI BSE Sono correlati a vacuolizzazione ed accumulo amiloide a livello del tronco encefalico sede di strutture deputate a numerose funzioni Nuclei nervi cranici centri di controllo funzioni cardio- respiratorie, sensitive, comportamentali Vie ascendenti (da midollo spinale a talamo e corteccia) Propriocezione, dolore, tatto Vie discendenti (da encefalo a midollo) Iperestesia, ipereazione stimoli luminosi, tattili, acustici Sistema nervoso autonomo Disturbi app. cardio vascolare
VIE DI TRASMISSIONE BSE Mangimi contenenti proteine animali provenienti da animali ammalati BSE L infettività del prione non viene alterata dalle normali procedure di decontaminazione nel rendering resistente bollitura sterilizzazione standard in autoclave a 121 C per quindici minuti alcool Formaldeide raggi UV Incenerimento di tessuti contaminati a T>600 C inattivato per un'ora dall'ipoclorito di sodio al 2% sterilizzazione per 20 min a 134-138 C
BSE EPIDEMIA BSE in UK Real feed ban CONFIRMED CASES OF BSE IN U.K. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 First histopathological confirmation Feed ban introduc ed Real feed ban 500 0 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000
Recenti studi mostrano evidenza del rapporto tra MCJv e BSE MCJv è riferibile alla esposizione dell uomo all agente BSE Ciò ha indotto la EU ad intraprendere, a partire dal 2001, piani di sorveglianza sanitaria finalizzati alla tutela del consumatore BSE- and vcjd-cases in the UK. The number of assured BSE- (red) and vcjd cases (black) in the UK from 1988 to 2005 (data source: OIE World Organisation for Animal Health, DEFRA (GB) - updated 9/2005; UK Creutzfeldt-Jakob Disease Surveillance Unit - updated 10/2005
STRATEGIE DI CONTROLLO SICUREZZA ALIMENTARE EU per TSE ANIMALI (BSE) MISURE DI SORVEGLIANZA ATTIVA PASSIVA MISURE A TUTELA DEL CONSUMATORE ELIMINAZIONE MSR CERTIFICAZIONE ED ETICHETTATURA DELLE CARNI MISURE DI CONTROLLO ALIMENTAZIONE ANIMALE - FEED BAN
MISURE DI CONTROLLO ALIMENTAZIONE ANIMALE DIVIETO DI UTILIZZO FARINE DI ORIGINE ANIMALE TECNICA MICROSCOPICA si basa sull'identificazione di frammenti ossei e permette il riconoscimento di residui animali provenienti da classi diverse (mammifero, volatile, pesce)
MISURE DI CONTROLLO MATERIALE SPECIFICO A RISCHIO Gli MSR contengono dal 96 al 98% dell agente infettante nell animale con BSE: cervello (60.2%) e midollo spinale (24.2%) La concentrazione dell infettività solo nel SNC ha favorito il successo delle misure di contenimento della BSE
MISURE DI SORVEGLIANZA BSE Test di laboratorio ricorso a test diagnostici rapidi sorveglianza passiva SISTEMI DI SEGNALAZIONE OBBLIGATORIA CASI DI MALATTIA ANIMALI MORTI IN AZIENDA (Test di laboratorio) >24 mesi sorveglianza attiva MONITORAGGIO AL MACELLO (Test di laboratorio) >24 mesi 2001 >30 mesi 2005 >48 mesi 2008 >72 mesi 2011
145 casi BSE su circa 7 milioni di bovini testati IZSPVLA CEA - 2013
DIAGNOSI di LABORATORIO BSE Attuata sui fronti sorveglianza attiva e passiva è alla base del piano e di interventi logistici fonte di nuove acquisizioni epidemiologiche eziologiche elemento per la definizione rischio geografico
Piano di Sorveglianza e prelievo Il Piano di sorveglianza subisce modifiche in relazione a nuove acquisizioni scientifiche L attività diagnostica di laboratorio è strumento della sorveglianza ed è soggetta a continui miglioramenti Il prelievo è il punto cardine per l attività diagnostica e richiede sempre nuove indicazioni
Pattern glicosilazione BSE BASE Pattern gliale IHC Pattern Istolesivo Pattern di deposizione
OVI-CAPRINI e BSE Il 28 gennaio del 2005 è stato confermato (mediante prova biologica) il primo caso di BSE in un caprino regolarmente macellato nel 2002 in Ardeche (Francia) e sottoposto al regolare screening previsto dalla sorveglianza attiva. Si trattò in quel caso dell unico animale risultato infetto nel gregge. NESSUN ALTRO CASO CONFERMATO, MA La differente distribuzione della PrPsc negli ovi-caprini rispetto ai bovini, che implica una precoce presenza della proteina patologica in organi e tessuti, con coinvolgimento di tutto l organismo a partire dal sistema linfatico, ha evocato uno stato di allarme riferito alla possibilità di rischio per la salute pubblica derivato dal consumo di carni, latte e prodotti a base di latte provenienti da ovini o caprini.
Bibliografia Casalone C. et al Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encefalophalopathy: Mmolecular similarities with sporadic Creutsfeld-Jacobs disease Proct Natl Acad Sci U s a, 2004 2;101 Sharon LR S. et al The identification of disease-induced biomarkers in the urine of BSE Proteome Science 2008, 6:23 Masucci M. et al Rilievi clinici in corso di BSE Pocchiari M. et al La malattia di Creutzfeld-Jacob aspetti clinici ed epidemiologici Relazione AIENP Peter Daszak, Andrew A. Cunningham, Alex D. Hyatt SCIENCE VOL 287 21 JANUARY 2000 Emerging Infectious Diseases of Wildlife: Threats to Biodiversity and Human Health