Folding e misfolding delle proteine

Transcript

1 Università degli Studi di Firenze Prof. Niccolò Taddei Folding e misfolding delle proteine 15 Aprile 2015, Liceo Scientifico James Joyce Ariccia (RM)

2 LE PROTEINE Folding Il folding delle proteine è la seconda metà del codice genetico ATCGATCGATCG DNA UAGCUAGCUAGC RNA Trascrizione AlaProLeuGlu Proteina Proteina funzionale Traduzione Folding

3 LE PROTEINE Folding Premessa: la denaturazione di una proteina Denaturazione indotta da agenti: Fisici Elevata temperatura, elevata pressione, forze di torsione e stiramento Chimici Valori estremi di ph, tensioattivi, agenti caotropici, sali, solventi

4 LE PROTEINE Folding Il percorso del folding Denaturato Nativo

5 LE PROTEINE Folding Meccanismi proposti per il folding

6 Le possibili conformazioni di una proteina LE PROTEINE Folding ribosoma partially unfolded unfolded native

7 Legame del ligando o modificazioni covalenti LE PROTEINE Folding ribosoma partially unfolded unfolded native

8 Legame del ligando o modificazioni covalenti Oligomeri funzionali LE PROTEINE Folding ribosoma partially unfolded Fibre funzionali unfolded native

9 Legame del ligando o modificazioni covalenti Oligomeri funzionali LE PROTEINE Folding ribosoma partially unfolded Fibre funzionali unfolded native Frammenti degradati

10 Legame del ligando o modificazioni covalenti Oligomeri funzionali LE PROTEINE Folding ribosome partially unfolded Fibre funzionali unfolded native Aggregati disordinati Aggregati disordinati Aggregati Native-like Frammenti degradati

11 Legame del ligando o modificazioni covalenti Oligomeri funzionali LE PROTEINE Folding ribosome partially unfolded Fibre funzionali unfolded native Aggregati disordinati Aggregati disordinati Aggregati native-like Frammenti degradati Aggregati con struttura β (es. protofibrille) Fibrille amiloidi

12 Lo stato conformazionale esistente negli aggregati proteici strutturati (fibrille amiloidi o loro precursori) è il più stabile per una catena polipeptidica. LE PROTEINE Folding

13 Lo stato conformazionale esistente negli aggregati proteici strutturati (fibrille amiloidi o loro precursori) è il più stabile per una catena polipeptidica. LE PROTEINE Folding Le fibrille amiloidi sono il buco nero dell universo proteico

14 Legame del ligando o modificazioni covalenti Oligomeri funzionali LE PROTEINE Folding ribosome partially unfolded Fibre funzionali unfolded native Aggregati disordinati Aggregati disordinati Aggregati native-like Frammenti degradati Aggregati con struttura β (es. protofibrille) Fibrille amiloidi

15 Legame del ligando o modificazioni covalenti Oligomeri funzionali LE PROTEINE Folding ribosome Hsp70/40 PFD/TriC Hsp90 shsp NAC? Hsp70/40 PFD Hsp70/40 PFD proteasoma Hsp 104 Hsp70/40 PFD/TriC Hsp90 shsp Hsp 104 Hsp70/40 PFD/TriC Hsp90 proteasoma Hsp90 Hsp90 Fibre funzionali Aggregati disordinati Aggregati native-like proteasoma Frammenti degradati Aggregati con struttura β (es. protofibrille) Fibrille amiloidi

16 Malattie da Misfolding proteico Malattie dovute all impossibilità di una proteina specifica o di un peptide ad adottare una struttura nativa stabile 1. Malattie in cui si ha una diminuita efficienza di folding di una proteina e in cui quindi il paziente non beneficia di una quantità sufficiente di proteina funzionale Esempio: fibrosi cistica 2. Malattie in cui si ha un folding scorretto di una data proteina con conseguente difficoltà della proteina stessa a raggiungere il tessuto bersaglio Esempio: enfisema precoce 3. Malattie dovute alla conversione di una data proteina o peptide dalla sua forma solubile in aggregati fibrillari insolubili. Esempio: malattia di Alzheimer

17 1. Malattie in cui si ha una diminuita efficienza di folding di una proteina e in cui quindi il paziente non beneficia di una quantità sufficiente di proteina funzionale Esempio: fibrosi cistica CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator F 508 = 70% dei casi di FC

18 2. Malattie in cui si ha un folding scorretto di una data proteina con conseguente difficoltà della proteina stessa a raggiungere il tessuto bersaglio Esempio: enfisema precoce Forma attiva protease in the elastic tissues of the lungs (neutrophil elastase) Alpha 1 antitrypsin reactive loop neutrophil elastase Alpha 1 antitrypsin Forma latente (+ stabile)

19 3. Malattie dovute alla conversione di una data proteina o peptide dalla sua forma solubile in aggregati fibrillari insolubili (tossici). Esempio: Malattia di Alzheimer proteina nativa aggregati fibrillari insolubili

20 Circa 40 patologie umane sono associate alla formazione di fibrille amiloidi extracellulari o inclusioni intracellulari con caratteristiche amiloidi Alcuni esempi: - Patologie neurodegenerative proteina che aggrega Malattia di Alzheimer peptide Aβ (1-40, 1-42) Encefalopatie spongiformi prione (intero o frammenti) - Amiloidosi sistemiche proteina che aggrega Amiloidosi da catene leggere Amiloidosi sistemica senile catene leggere delle immunoglobuline transtiretina - Amiloidosi localizzate proteina che aggrega Diabete di tipo II Medullary carcinoma of the thyroid amilina (IAPP) calcitonina

21 Le tre caratteristiche peculiari delle fibrille amiloidi 1. Morfologia fibrillare osservabile con microscopio elettronico a trasmissione 2. Struttura cross-β monitorabile con diffrazione a raggi X 3. Birifrangenza verde in presenza di Rosso Congo in luce polarizzata

22 Prima caratteristica: Morfologia fibrillare osservabile con microscopio elettronico 100 nm 200 nm Amyloid fibrils of the Aβ 1-40 peptide by transmission electron microscopy (Walsh et al J. Biol. Chem. 274, 25945) Amyloid fibrils of Aβ 1-42 peptide by atomic force microscopy (Harper et al. 1997, Chem. Biol. 4, 119)

23 Seconda caratteristica: Struttura cross-β monitorabile con diffrazione a raggi X 4.8 Å 4.8 Å Å Å X-ray diffraction of Aβ fibrils Serpell, 2000, Bioch. Biophys. Acta 1502, 16-30

24 Terza caratteristica: Birifrangenza verde in presenza di Rosso Congo in luce polarizzata Fibrillar deposits of β2-microglobulin Ivanova et al., 2003, Biochemistry 42,

25 - Le fibrille amiloidi sono formate da protofilamenti (diametro di 2-5 nm) che si avvolgono o si associano lateralmente a formare fibrille di diametro maggiore (generalmente 7-13 nm o maggiore) - Nei protofilamenti è presente una struttura a foglietto β. I singoli filamenti β sono paralleli tra di loro e perpendicolari all asse maggiore della fibrilla.

26 Malattia di Alzheimer LE PROTEINE Misfolding Segni e sintomi clinici - Perdita della memoria - Decadimento cognitivo - Instabilità comportamentale Istologia - Riduzione delle sinapsi nel cervello - Morte neuronale nel cervello (neurodegenerazione) - Presenza di placche senili (amiloide extracellulare) - Presenza di grovigli neurofibrillari (intracellulari) Biochemistry - Fibrille amiloidi extracellulari di peptide β-amiloide - Filamenti elicoidali appaiati intraneuronali di proteina tau

27 Malattia di Alzheimer LE PROTEINE Misfolding

28 Encefalopatie spongiformi trasmissibili Segni e sintomi clinici - Disfunzione neurologica che conduce a morte in tempi brevi Forme cliniche: - Malattia di Creutzfeld-Jacob (nell uomo); morbo della mucca pazza; scrapie (nelle pecore) Istologia: - Formazione di depositi amiloidi extracellulari nel tessuto nervoso. Formazione di vaste aree cave (spongiformi) nel cervello. Biochimica - Depositi amiloidi extracellulariformati da proteina prionica

29 Encefalopatie spongiformi trasmissibili PrP c PrP sc

30 disordered aggregates disordered aggregates functional oligomers ribosome Le possibili conformazioni di una catena polipeptidica degraded fragments unfolded partially unfolded native functional fibres disordered aggregates toxic! toxic! disordered aggregates native-like aggregates toxic! β-structured aggregates (e.g. protofibrils) Amyloid fibrils

31 Le cause della tossicità Immagini al microscopio confocale di cellule in coltura alla presenza di aggregati proteici Gli esperimenti mostrano che gli aggregati possono inserirsi nelle membrane cellulari [Bucciantini et al., Nature 416, (2002)]

32 Le cause della tossicità L analisi in criomicrosciopia elettronica di aggregati iniziali di peptide Aβ e α-sinucleina mostra che questi assumono una forma a ciambella Queste immagini sono molto simili alle strutture generate da tossine batteriche che creano pori sulle membrane delle cellule

33 Fibrille di dominio SH3 di IP-3K Le fibrille hanno tutte le caratteristiche proprie delle fibrille amiloidi

34 Fibrille di mioglobina Le fibrille si formano rapidamente a seguito di riscaldamento della proteina in presenza di condizioni parzialmente denaturanti [Fandrich et al., Nature 410, (2001)]

35 Numerose proteine non associate a patologie note sono state convertite in fibrille amiloidi in vitro Ecco alcuni esempi: SH3 domain from PI3 kinase (Bovine) Betabellin 15D (human) Fibronectin type III module (Mouse) GAGA factor (D. melanogaster) Muscle acylphosphatase (Human) Tailspike protein (Bacteriophage P22) Cold shock protein A (human) Monellin (D. camminsii ) Phosphoglycerate kinase (Yeast) Apolipoprotein C-II (Human) Glycoprotein B fragment (Herpes S. virus) Fiber protein (Adenovirus) ADA2h (Human) Met aminopeptidase (P. furiosus) HypF N-terminal domain (E. coli) Lysozyme (Hen) Apocytochrome c (H. thermophilus) Apomyoglobin (Horse) B1 Ig-binding domain of protein G (Human) Amphoterin (Human) Curlin CgsA subunit (E. coli) α-lactalbumin (Human) V(L) domain of antibody F11 (Mouse) Prothymosin α (mammalian) Acidic fibroblast growth factor (N. viridescens) Stefin B (Human) β-lactoglobulin (Human) Endostatin (Human) Barstar (Bacillus amyloliquefaciens) Chaplins (S. coelicolor) fragment of Pmel17 (Human) acylphosphatase (Sulfolobus solfataricus) S6 (Thermus thermophilus) histones (Human) α-chymotrypsin (Human) AcPDro-2 (Drosophila melanogaster)

36 Le proteine sono polimeri evoluti Una fibrilla amiloide rappresenta la struttura primordiale di una proteina che è determinata dalle proprietà intrinseche della catena principale del polipeptide Le proteina naturali possiedono sequenze altamente selezionate in cui le interazioni fra catene laterali sono tali da impedire lo sviluppo delle preferenze conformazionali della catena principale e determinano la struttura nativa della proteina stessa