Ruolo dello ione Cu II nell aggregazione dell Ubiquitina: implicazioni per le malattie neurodegenerative. Vincenza CALO

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1 GIORNATA PUGLIESE su FARMACO e PRODOTTI per la SALUTE II EDIZIONE Il farmaco per le diagnosi precoci e malattie rare Ruolo dello ione Cu II nell aggregazione dell Ubiquitina: implicazioni per le malattie neurodegenerative Vincenza CALO Dottorato di Ricerca in Sintesi Chimica ed Enzimatica Applicata XXIII ciclo Dip.. Farmaco-Chimico Università degli Studi di Bari A. Moro

2 Ruolo dello ione Cu II nell aggregazione dell Ubiquitina: implicazioni per le malattie neurodegenerative Vincenza Calò, Fabio Arnesano, Giovanni Natile Università degli Studi di Bari, Dipartimento Farmaco-Chimico, Via E. Orabona 4, Bari, Italia La maggior parte delle malattie neurodegenerative (ND) mostra un meccanismo molecolare comune, basato sull alterazione del folding proteico e conseguente aggregazione con formazione di strutture amiloidi [1,2]. Tali aggregati proteici, accumulandosi a livello neuronale, possono impedire alla cellula nervosa di svolgere le sue normali funzioni fisiologiche e portare all apoptosi. Un ruolo importante nel promuovere l alterazione del folding proteico è svolto da alcuni ioni metallici, in particolare dallo ione rame [3]. La maggior parte delle proteine coinvolte nell insorgenza delle malattie neurodegenerative ha la capacità di legare lo ione Cu II e formare, a livello cellulare, inclusioni e placche contenenti anche Ubiquitina (Ub) [4,5]. Ub è una proteina che riveste un ruolo fondamentale nella degradazione proteica e possiede una struttura estremamente stabile e compatta. Abbiamo dimostrato recentemente che tale stabilità viene compromessa quando Ub lega Cu II[6]. In queste condizioni Ub subisce un estesa aggregazione in presenza di solventi organici e forma strutture anulari potenzialmente neurotossiche in presenza di bistrati fosfolipidici [7]. Al fine di approfondire la conoscenza dei meccanismi molecolari alla base dell aggregazione proteica, abbiamo prodotto un mutante di Ub (E16V) che, comportandosi come le proteine amiloidogeniche, può essere utilizzato come sistema modello per chiarire i meccanismi di neurodegenerazione. Una maggiore conoscenza di tali meccanismi è necessaria per la progettazione di farmaci in grado di inibire o di invertire l aggregazione proteica e offrire una possibilità di cura per le malattie neurodegenerative. [1] Soto C, Nature Reviews. 2003; 4: [2] Chiti F, Dobson CM, Annu Rev Biochem. 2006; 75: [3] Gaggelli E, Kozlowski H, Valensin D, Valensin G, Chem Rev. 2006; 106: [4] Ciechanover A, Brundin P, Neuron. 2003; 40(2): [5] Ross CA, Poirier MA, Nature Med. 2004; 10 Suppl: S [6] Milardi D, Arnesano F, Grasso G, Magrì A, Tabbì G, Scintilla S, Natile G, Rizzarelli E, Angew Chem Int Ed Engl. 2007; 46: [7] Arnesano F, Scintilla S, Calò V, Bonfrate E, Ingrosso C, Losacco M, Pellegrino T, Rizzarelli E, Natile G, PLoS One. 2009; 4(9): e7052. Glu18 Met1 Glu16 His68 Val

3 Malattie Neurodegenerative Le Malattie Neurodegenerative sono caratterizzate dalla perdita progressiva e selettiva di neuroni nelle aree motorie, sensitive o cognitive del SNC La terapia farmacologica attuale è sintomatica, non curativa Malattia di Parkinson Malattia di Alzheimer α-sinucleina β-amiloide (Aβ) Malattia di Huntington Sclerosi Laterale Amiotrofica Malattia di Creutzfeldt-Jacob (morbo della mucca pazza) Huntingtina Superossido Dismutasi 1 Prione Ciechanover and Brundin, Neuron Gaggelli, Kozlowski, Valensin D. and Valensin G., Chem. Rev Ad ogni malattia neurodegenerativa èassociata l alterazione della struttura nativa di una specifica proteina, definita amiloidogenica. 3

4 Meccanismo di fibrillazione proteica Proteina nativa Proteina misfolded Fibrilla Oligomero Alzheimer Parkinson Protofibrilla Huntington Creutzfeldt-Jakob Sclerosi Laterale Amiotrofica Soto, Nat Rev Neurosci Tutte le inclusioni e placche contengono Ubiquitina In seguito all alterazione della struttura nativa di una proteina si formano oligomeri, protofibrillee fibrille che danno origine a inclusioni e placche. Tali aggregati, che si accumulano a livello delle cellule nervose, contengono Ubiquitina.

5 Meccanismo di citotossicità monomero oligomero fibrilla membrana Ca II e altri ioni Cerf et al., Biochem. J Le specie dotate di maggior potere citotossico sono gli intermedi oligomerici capaci di interagire con le membrane cellulari e formare dei pori responsabili dell alterazione dell omeostasi ionica e della conseguente morte cellulare.

6 Ubiquitina (Ub) C-term Molto Compatta Met1 N-term Molto Stabile Molto Conservata Lys63 His68 L Ubiquitinaèuna proteina di 76 aminoacidi molto compatta, stabile e conservata negli organismi eucarioti.

7 Proteina Ub Ub Ub Condizioni Fisiologiche Proteasoma Peptidi La sua importante funzione fisiologica èquella di regolare il processo di degradazione proteica.

8 Ub Ub Ub Ub Proteina Condizioni Patologiche Proteasoma In condizione patologiche le proteine non vengono degradate dal proteasomama si accumulano come aggregati contenenti Ubiquitina.

9 Ubiquitina e Malattia di Alzheimer (AD) Aβ Ub Aβ+Ub Placche di tipo amiloide di AD contenenti ubiquitina rivelate attraverso immunofluorescenza Oddo, J. Cell Mol. Med Nel caso della malattia di Alzheimer gli aggregati di β-amiloide (Aβ) sono circondati da Ubiquitina.

10 Cu II Glu18 Met1 Glu16 Val His68 Ub nativa legata a Cu II Ub mutante E16V Studi di risonanza magnetica nucleare hanno permesso di identificare i siti di legame di Cu II sull Ubiquitina. L effetto del legame di Cu II può essere in parte mimato attraverso una mutazione del glutammato 16 in valina (mutante E16V) che neutralizza una carica negativa.

11 Aggregazione di ubiquitina in presenza di Cu membrane biologiche Cu II e Ub+Cu II 1 µm 1µm 1 µm monomero oligomero filamenti membrana 1µm Lo ione Cu II destabilizza l Ubiquitinadeterminando la formazione di oligomeri sferici che si organizzano in strutture anulari e possono formare filamenti estesi o pori all interno di membrane.

12 Analogia morfologica con oligomeri di β-amiloide Ub+Cu II β-amiloide Gli oligomeri anulari di Ubiquitina sono morfologicamente simili a quelli formati dal β- amiloide nella malattia di Alzheimer.

13 Aggregazione di ubiquitina mutante su superfici di quarzo UbE16V monomero oligomero quarzo Il mutante E16V di Ubiquitinapuò aderire a superfici di quarzo attraverso interfacce idrofobiche consentendo la caratterizzazione allo stato solido degli aggregati di tipo amiloide depositati.

14 Dipartimento Farmaco-Chimico, University of Bari: Prof. Giovanni NATILE Dr. Fabio ARNESANO Maurizio LOSACCO Vincenzo MANGINI Simone SCINTILLA Lab H Dipartimento di Chimica e Istituto di Biostrutture e Bioimmagini-CNR, University of Catania: Danilo MILARDI Enrico RIZZARELLI Dipartimento di Chimica, University of Bari: Annarosa MANGONE Chiara INGROSSO Elisabetta FANIZZA Francesco MILANO Massimo TROTTA National Nanotechnology Laboratory of CNR-INFM: Teresa PELLEGRINO Dipartimento di Chimica, University of Bologna: Giuseppe FALINI Simona FERMANI Giovanna TOSI