La risposta immunitaria di tipo umorale Linfociti B, Plasmacellule ed Anticorpi 1
2
L IMMUNITA UMORALE (mediata da anticorpi) Questo tipo di immunità protegge dagli antigeni circolanti, quali: batteri extracellulari esotossine microbiche virus nella fase extracellulare ANTICORPI Gli anticorpi, o immunoglobuline, sono glicoproteine che possono esistere sia in forma legata alla membrana dei linfociti B, dove fungono da recettori per l antigene (BCR), che in forma solubile. Gli anticorpi solubili circolano nel sangue e sono presenti nelle secrezioni dove svolgono la funzione effettrice dell immunità umorale neutralizzando ed eliminando i microbi e le loro tossine. 3
Migrazione elettroforetica dei componenti del siero (albumina e globuline, e ) la linea tratteggiata è il profilo elettroforetico prima dell'immunizzazione; la linea continua rappresenta la migrazione elettroforetica del siero ottenuta dopo l'immunizzazione. STRUTTURA DEGLI ANTICORPI L anticorpo è costituito da due catene pesanti e da due catene leggere. Sia le catene pesanti che le catene leggere possiedono alcune regioni simili in molti anticorpi (regioni costanti) ed una regione che è propria di ciascuna molecola di anticorpo (regione variabile). Le regioni variabili conferiscono all anticorpo la specificità per l antigene e legano direttamente l antigene. 4
5
Esistono cinque tipi di catene pesanti diverse per la regione costante. Gli anticorpi che contengono catene pesanti differenti appartengono ad un diverso isotipo o classe: i cinque isotipi sono denominati IgM, IgD, IgG, IgE e IgA. I vari isotipi si differenziano per le caratteristiche biologiche e le funzioni effettrici. Isotipo di IgG: tipo di catena pesante in essa presente Idiotipo: porzione dei frammenti Fab della immunoglobulina che interessa la reattività con l'epitopo dell'ag. 6
7
ANTICORPI CHIMERICI e UMANIZZATI 8
Alcune caratteristiche e ruolo delle classi Ig nella difesa dell'ospite IgM : ca 5% caratteristici della risposta primaria; nel siero sono sotto forma pentamerica; fissano efficacemente le proteine del complemento, agglutinazione di batteri, opsonine. IgD : <1% espresse come immunoglobuline di membrana IgG : 85% indicano (anche) riesposizione all antigene; nel siero sono in forma monomerica; antitossine, opsonine, fissano efficacemente il complemento; neutralizzazione dei virus nel sangue; possono attraversare la barriera placentare (protezione del feto e del neonato); sono suddivise in sottotipi. IgE : mediano le risposte allergiche (ipersensibilità di tipo I) e asmatiche, antiparassitarie (induzione della degranulazione dei mastociti e opsonizzante per gli eosinofili). IgA: 10-15% dimeriche; si trovano in elevata concentrazione nelle secrezioni mucose, prevengono l'adesione batterica alle membrane mucose, antivirali, antitossine. 9
CINETICA DELLA RISPOSTA ANTICORPALE 10
CINETICA DELLA RISPOSTA ANTICORPALE VERSO ANTIGENI TD Risposta immunitaria primaria In seguito a una prima immunizzazione con un antigene, si osserva una lag fase, durante la quale non si riscontrano, nel siero di un soggetto, anticorpi specifici per quell antigene. Dopo questa fase, l antigene viene riconosciuto, processato e presentato alle cellule T appropriate, che a loro volta, sono state attivate, hanno proliferato e si sono differenziate in linfociti TH maturi e attivati. Tali linfociti TH possono allora aiutare la completa attivazione dei linfociti B in plasmacellule producenti anticorpi. Solitamente dopo 7-10 giorni nel siero è possibile riscontrare anticorpi specifici per l antigene. Nella prima fase della risposta primaria compaiono nel siero le IgM, successivamente le IgG. La produzione di Ig decresce in seguito alla scomparsa dell antigene. Risposta immunitaria secondaria Quando un soggetto incontra nuovamente lo stesso antigene, la sua risposta immunitaria risulta più efficace e più veloce. I livelli anticorpali nel siero incrementano rapidamente e la quantità di anticorpi totali prodotti è maggiore. Inoltre, gli anticorpi presentano: una maggiore affinità per l antigene; i vari isotipi (IgG, IgA, IgE) in quanto si è verificato lo switch isotipico; un ampia gamma di funzioni effettrici. 11
FUNZIONI EFFETTRICI DEGLI ANTICORPI Neutralizzazione di microbi e tossine bloccando il loro legame alle cellule. Attivazione della via classica del complemento da parte delle IgM e delle IgG. Opsonizzazione dei microbi come stimolo per la fagocitosi. Citotossicità cellulare anticorpo-dipendente mediata da cellule NK Immunità a livello delle mucose mediata da IgA. Immunità neonatale mediata da IgG materne che attraversano la placenta e l epitelio intestinale nel circolo del feto e del neonato Ipersensibilità mediata da IgE. Immunità delle mucose mediata dalla secrezione di IgA Dosaggio Radioimmunologico E.L.I.S.A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay 12
Principi del dosaggio radioimmunologico Principi: reazione immunologica [reazione Antigene Anticorpo] per dosare qualsiasi composto immunogenico Ag + Ag* + Ab AgAb + Ag*Ab + Ag + Ab* Ag* non legato e Ag libero Radioattività rilevata del residuo legato Concentrazione ligando è inversamente propozionale alla radioattività Vantaggi e Svantaggi del RIA Vantaggi Alta specificità: le reazioni immunologiche sono specifiche Alta sensibilità: le reazioni immunologiche sono sensibili Svantaggi Pericoli radiologici: collegati all uso dei reagenti radioattivi Richiesta di personale qualificato Laboratori con specifiche licenze in campo radiologico Richieste speciali per lo smaltimento e la conservazione del materiale radioattivo 13
Requisiti per il RIA 1. Preparazione e Caratterizzazione dell Antigene 2. Radiomarcatura dell Antigene 3. Preparazione dell Anticorpo Specifico 4. Sviluppo dei Sistemi di Rilevazione Preparazione e Radiomarcatura dell Antigene Antigeni preparati da Sintesi delle molecole Isolazione da sorgenti naturali Radiomarcatura [Procedura di marcatura] 3 H 14 C 125 I sono utilizzati come tag Gli antigeni sono marcati 3 H 14 C 125 I La marcatura non disturba la Specificità Antigenica e L Attività Antigenica! 14
Preparazione dell Anticorpo specifico L Antigene iniettato in maniera intradermica in conigli o maialini di Guinea produzione anticorpi Anticorpi recuperati dal siero Non sono Antigeni: Ormoni, Steroidi, Farmaci APTENI Es: Gastrina, Morfina, Gli Apteni coniugati all albumina antigeni Sviluppo del Sistema di Rilevazione Un punto cruciale è la separazione degli antigeni non legati Questo è dipendente dal legame degli anticorpi alla fase solida Gli Antigeni legati agli anticorpi fissati restano fortemente adesi Rimuovere lavando o decantando gli antigeni non legati Altre tecniche di separazione: Centrifugazione 15
Procedura Aggiungere campioni noti + antigene marcato nei pozzetti Incubare attendere la formazione del complesso Decantare e lavare il contenuto dei pozzetti rimuovere tutti gli antigeni non legati Radioattivtà emessa è misurata con un Contatore [GM Contatore, Scintillatore etc] L INTESITA della radioattività è inversamente proporzionale alla concentrazione degli antigeni nel campione noto Sensibile anche a concentrazioni basse di Antigeni Principi: E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Usa una reazione immunologica come RIA Differisce dal RIA per il metodo di rilevazione La rilevazione è basata su Reazione catalizzata da un enzima Sonda Fluorescente No Radioattività [grande vantaggio!] 16
E. L. I. S. A. Vantaggi dell ELISA Sensibile: nell ordine di nanogrammi o ancora meno Riproducibilità Reagenti minimi Qualitativa e Quantitativa Qualitativa Es Test HIV Quantitativa Es Rilevazione concentrazioni Farmaci Lo scopo: I pozzetti possono essere ricoperti con Antigeni o Anticorpi Automatica alta velocità NO Pericoli radiazioni 17
Tipi di ELISA 1. Metodo Noncompetitivo o a Sandwich 1. Sistema per misurare l antigene [Pozzetti coperti con Anticorpi; Anticorpi marcati con enzima] 2. Sistema per misurare gli anticorpi [Pozzetti coperti con antigeni; AntiAnticorpi marcati con Enzima] 2. Metodo Competitivo [Pozzetti coperti con anticorpi; Antigeni marcati con enzima] Metodo Noncompetitivo o Sandwich Sistema misurazione Antigene Pozzetti coperti con anticorpi Aggiunta di campioni Incubare: attendere l interazione antigene-anticorpo Lavare rimuovere l antigene non legato Aggiungere l Anticorpo marcato con l enzima Incubare e attendere che l anticorpo marcato sia legato Lavare rimuovere l Anticorpo marcato non legato Aggiungere il substrato; incubare Enzima + Substrato Prodotto Misurazione fluorescenza Fluorescenza proporzionale all Anticorpo nel campione 18
Metodo Noncompetitivo o Sandwich Sistema per la misurazione dell Anticorpo Pozzetti coperti con l antigene Aggiunta campione da analizzare contenente l anticorpo Incubare: attendere la formazione del complesso antigene anticorpo Lavare rimuovere l Anticorpo non legato Aggiungere Antianticorpo marcato con l Enzima Incubare con antianticorpi marcati complesso anticorpoantigene Lavare rimuovere antianticorpo marcato non legato Aggiungere il substrato; incubare Enzima + Substrato Prodotto fluorescenza Fluorescenza proporzionale all anticorpo presente nel campione Sistema Competitivo Pozzetti coperti con anticorpi Quantità note di campione contente antigene + antigene marcato con l enzima Incubare: reazione antigene e anticorpo Lavare rimuovere l antigene non legato Aggiungere il substrato; incubare Enzima + Substrato Prodotto fluorescenza Fluorescenza inversamente proporzionale all antigene presente nel campione 19
Marcatori Enzimatici Marcatori enzimatici: un alta specificità Facilmente complessati ai ligandi e al complesso marcato La reattività deve avvenire dopo che si è legato l enzima antigene/anticorpo Gli enzimi scelti devono essere presenti normalmente nel campione Esempi di enzimi marcati Perossidasi, Fosfatasi Alcalina, Glucosio ossidasi Applicazioni dei dosaggi Immunologici [RIA e ELISA] Analisi di ormoni, vitamine, metaboliti, diagnosi di marcatori Es. ACTH, FSH, T3, T4, Glucagone, Insulina, Testosterone, vitamin B12, prostaglandine, glucocorticoidi, Monitoraggio Farmaci ad uso terapeutico: Barbiturici, morfina, Diagnosi per malattie infettive HIV, Epatite A, B etc 20
Multiplex- Cytokine array Le determinazioni vengono effettuate su sieri opportunamente criopreservati a -20 C. I sieri sono processati per la valutazione di diverse proteine circolanti dotate di attività biologica impiegando come sistema di detezione il sistema Multiplex (Bio-Plex suspension array) della Bio-Rad. Esso permette di determinare quantitativamente i livelli sierici circolanti fino a 18 citochine sullo stesso campione di siero (50-100 microlitri di siero). Determinazione di diverse citochine allo stesso tempo: ad ogni citochina è assegnato una beads di dimensione diversa 21
Il secondo anticorpo fluorescente si lega alla citochina e l intensità di fluorescenza viene assegnata attraverso il colore delle beads alle diverse citochine. A cavallo della citofluorimetria e dell ELISA: le beads vengono lette una alla volta attraverso un sistema fluidico 22
23
Studio Biologico: determinazioni su siero (2) 24