RIDASCREEN Verotoxin Saggio immunoenzimatico per la rilevazione delle Verotossine 1 e 2 Art. No.: R5701 Test in vitro Conservare a 2-8 C R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Telefax: +49 (0) 61 51 81 02-20
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RIDASCREEN Verotoxin Introduzione RIDASCREEN Verotoxin (Art. No.: R5701) è un saggio immunoenzimatico a sandwich per la rilevazione delle Verotossine 1 e 2 (SLT-I e SLT-II) da coltura di arricchimento. Tutti i reagenti richiesti per l analisi immunoenzimatica compreso un controllo positive sono contenuti nel kit. Il kit è sufficiente per 96 determinazioni (incluso il controllo positivo). Per la quantificazione è necessario un lettore per micropiastre. Preparazione campioni: Tempo necessario: Limite di rilevabilità: Cross-reazioni: dopo l arricchimento e la centrifugazione del campione, il surnatante della coltura viene utilizzato direttamente nel saggio preparazione campione pre-arricchimento... 6 ore arricchimento per una notte... 16-18 ore esecuzione del test (incubazione)... 1 ora 45 min l arricchimento per 16-18 ore è sufficiente ad individuare le tossine nel surnatante della coltura non si individuano cross-reazioni oltre alla rilevazione specifica di SLT-I e SLT-II 1. Scopo RIDASCREEN Verotoxin è un analisi immunoenzimatica per la rilevazione delle Verotossine 1 e 2 (SLT-I e SLT-II) in una coltura di arricchimento. RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17 3
2. Generale Le Enterobacteriaceae della specie Escherichia coli (E. coli) sono commensali della flora intestinale dell individuo sano e anche di molti animali da allevamento, e quindi indicatori della contaminazione fecale delle acque e degli alimenti. A causa di diversi fattori di patogenicità, spesso legati a plasmidi o trasmessi tramite fagi, E. coli sono considerati come patogeni facoltativi. A partire dal 1977, sono stati individuati ceppi di E. coli in grado di produrre due citotossine, le Verotossine 1 e 2. A causa delle loro somiglianze con la tossina Shiga di Shigella dysenteriae, le Verotossine sono denominate anche tossine Shiga-like 1 e 2 (SLT I e II). Il prototipo dei ceppi di E. coli enteroemorragico (EHEC) fu descritto per la prima volta nel 1982. I sintomi clinici riferibili a EHEC vanno dalla gastroenterite lieve a quella grave,fino alla colite emorragica che è responsabile del 10-20% di tutte le infezioni. Possono inoltre verificarsi complicazioni post-infettive e situazioni di pericolo di vita nel 5-10 % dei casi. Sono colpiti specialmente i neonati e i bambini della prima infanzia, ma anche gli anziani e i pazienti immunocompromessi. Grazie alla sua elevata resistenza ambientale e alla relativa tolleranza acida, il livello di infezione da EHEC è solo di circa 10² microbi. Le principali fonti di infezione sono i prodotti a base di carne bovina, ovina e caprina, specialmente se la carne è cruda oppure cotta in maniera insufficiente o se è mal conservata, e il latte crudo. Particolarmente importanti sono le catene infettive, specialmente se si sviluppano in strutture pubbliche quali gli asili, gli istituti per gli anziani o gli ospedali, e i contatti diretti con gli animali. La procedura attualmente raccomandata per l analisi di prodotti alimentari prevede un pre-arricchimento del patogeno per 6 ore, l inoculo di una certa aliquota del pre-arricchimento in un nuovo brodo e la successiva incubazione per tutta la notte (16-18 h). Dopo tale procedura i batteri dovrebbero essere stati isolati. Nello stesso tempo, utilizzando il brodo di arricchimento, è possibile eseguire la rilevazione delle verotossine, il più sicuro fattore di patogenicità. Questa può essere svolta mediante PCR o mediante analisi immunologiche in ELISA. Rispetto alla PCR, le tecniche ELISA, quali ad esempio RIDASCREEN Verotoxin, sono metodi semplici e possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio. Una procedura di arricchimento è richiesta per entrambi i metodi dal momento che l escrezione dei germi, nonchè il contenuto di tossina negli alimenti, può essere molto basso. 4 RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17
3. Principio del test Il test si basa su una reazione antigene-anticorpo. Gli anticorpi monoclonali contro le Verotossine 1 e 2 sono legati sulla superficie dei pozzetti della micropiastra. Vengono poi aggiunti i controlli e le soluzioni dei campioni. Dopo il lavaggio viene aggiunto e incubato a temperatura ambiente l enzima coniugato (anticorpi monoclonali legati a perossidasi). Se è presente la verorossina, si forma un complesso a sandwich tra gli anticorpi immobilizzati, la verotossina e l anticorpo coniugato all enzima. Il coniugato all enzima non legato viene eliminato con un lavaggio. Nei pozzetti viene aggiunta e incubata la soluzione substrato/ cromogeno. Il coniugato legato all enzima converte il cromogeno incolore in un prodotto blu. L aggiunta della soluzione di stop provoca un viraggio del colore dal blu al giallo. Le determinazioni quantitative vengono eseguite fotometricamente a 450 nm. I valori di assorbanza trovati sono direttamente proporzionali alla concentrazione di Verotossina nel campione. 4. Reagenti forniti Ogni kit contiene materiale sufficiente per 96 determinazioni (incluso un controllo positivo). Ciascun kit contiene: 1 x Micropiastra (12 strip da 8 pozzetti ciascuna) 96 pozzetti rivestiti con anticorpi monoclonali contro le Verotossine 1 e 2 1 x Controllo positivo (1.8 ml)... tappo rosso di Verotossine inattivate, pronto all uso 1 x Enzima Coniugato (10 ml).... tappo rosso HRP-anticorpi monoclonali coniugati diretti contro le Verotossine 1 e 2 pronto all uso 1 x Tampone di lavaggio (100 ml)... tappo marrone concentrato 10 volte contiene Thimerosal 0.1 % 1 x Substrato / Cromogeno (10 ml)... tappo marrone contiene perossido d urea / tetrametilbenzidina (TMB) pronto all uso 1 x Soluzione di stop (6 ml)... tappo giallo contiene acido solforico 1 N RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17 5
5. Materiale richiesto ma non fornito 5.1. Attrezzatura spettrofotometro per micropiastra (450 nm) beute sterili da 500 ml, agitatore micropipette a volume variabile 20 µl - 200 µl e 200-1000 µl 5.2. Reagenti terreno per il pre-arricchimento: brodo mtsb modificato con Novobiocina Composizione: 17 g/l Triptone, 3 g/l Soitone, 5 g/l NaCl, 4 g/l K 2 HPO 4, 2.5 g/l Glucosio, 1.5 g/l Sali biliari No. 3 integrato con 10 mg/l Novobiocina (concentrazione finale) terreno per l arricchimento: brodo mtsb con supplemento (mitomicina C) Composizione: mtsb (vedi sopra) integrato con 50 µg/l Mitomycin C (concentrazione finale) Per l arricchimento è possibile utilizzare il brodo pronto all uso RIDA Enrichment broth (Art. No. Z1000 e Z1003). Attenzione: La mitomicina è una sostanza mutagena, prestare attenzione alle avvertenze del produttore! 6. Avvertenze e precauzioni per gli utilizzatori Il controllo positivo contiene Verotossina inattivata. È bene tuttavia considerare il controllo positivo come potenzialmente contagioso e trattarlo con le dovute precauzioni. Tutti i materiali e i reagenti che vengono a contatto con campioni potenzialmente infetti devono essere trattati con disinfettanti o sterilizzati in autoclave a 121 C (250 F) per almeno 1 ora. Il reagente di stop contiene acido solforico 1 N (R36/38, S2-26). 6 RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17
7. Istruzioni per la conservazione Conservare il kit a 2-8 C (36-46 F). NON CONGELARE. Riporre i pozzetti non utilizzati nella busta originale richiuderli insieme all essiccante fornito e conservare a 2-8 C (35-46 F). La soluzione substrato/cromogeno incolore è fotosensibile, pertanto evitare di esporla a luce diretta. Non utilizzare il kit oltre la data di scadenza indicata sulla confezione. Non scambiare singoli reagenti appartenenti a kit con diverso numero di lotto. 8. Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti Qualsiasi colorazione della soluzione substrato/cromogeno è indicativa di deterioramento dei reagenti, che devono essere eliminati Un valore inferiore a 0.8 unità di assorbanza (A450 nm < 0.8) per il controllo positivo nonché un valore di assorbanza superiore o uguale a 0.25 per il controllo negativo possono essere indice di un deterioramento dei reagenti 9. Preparazione dei campioni Per la rilevazione delle verorossine prodotte da E. coli con il kit RIDASCREEN Verotoxin fino ad un limite di 1 CFU/25 g di campione alimentare, è necessario eseguire prima una procedura di pre-arricchimento della durata di 6 ore a 37 C (98.6 F). Si raccomanda pertanto l uso di mtsb integrato con Novobiocina (secondo la direttiva tedesca Raccolta ufficiale di metodi analitici; 64 LFGB ). Per ottenere una sensibilità sufficiente, è consigliabile quantificare la tossina dopo un secondo arricchimento colturale. Si raccomanda a tal fine di effettuare un arricchimento di una notte in terreno mtsb a 37 C (98.6 F) (vedi 5.2.), agitando la coltura. Per l induzione delle verotossine prodotte da E. coli si raccomanda l aggiunta di mitomicina C (50 µg/l) al terreno. omogeneizzare 25 g di campione in 225 ml di mtsb (contenente Novobiocina) pre-riscaldato a 37 C (98.6 F), incubare per 6 ore a 37 C (98.6 F) in agitatore aggiungere 1ml del brodo di pre-arricchimento a 4 ml di mtsb + mitomicina C oppure aggiungere il contenuto di una provetta di RIDA Enrichment broth (Art. No. Z1000 e Z1003, par. 5.2) ed incubare per una notte (16-18 h) a 37 C (98.6 F) in agitatore RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17 7
trasferire la coltura in una provetta da centrifuga centrifugare per 10 min, 3500 g, temperatura ambiente (20-25 C / 68-77 F) nel saggio utilizzare 100 µl per ogni pozzetto 10. Esecuzione del test 10.1. Indicazioni preliminari Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C / 68-77 F) prima dell uso. Il tampone di lavaggio è fornito concentrato 10 volte. Prima di procedere alla diluizione, disciogliere completamente con un bagno termostatico i cristalli che inevitabilmente si formano. Diluire quindi il tampone concentrato 1:10 (1+9) con acqua distillata (ad es. 100 ml di concentrato + 900 ml di acqua distillata) prima dell uso. Una volta diluito, il tampone resta stabile a 2-8 C (35-46 F) per ca. quattro settimane. Come controllo negativo si raccomanda l uso di un terreno di arricchimento non inoculato 10.2. Procedura del test Per ciascun test eseguire in duplicato sia il controllo positivo contenuto nel kit che il controllo negativo. Attenzione: Tutti i brodi di arricchimento (campione arricchito nonché mtsb puro utilizzato come controllo negativo) devono essere portati a temperatura ambiente (20-25 C / 68-77 F) prima del loro utilizzo. Elevate temperature del brodo possono causare falsi positivi mentre si misura l assorbanza al termine della procedura di analisi. Seguire attentamente la procedura di lavaggio raccomandata. Evitare il prosciugamento dei pozzetti tra un passaggio e l altro del saggio. 1. Inserire nel supporto della micropiastra un numero sufficiente di pozzetti per tutti i controlli e i campioni da eseguire in duplicato. Registrare le rispettive posizioni. 2. Addizionare nei rispettivi pozzetti 100µl di ciascun controllo o campione preparato e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (20-25 C / 68-77 F). Durante l incubazione si raccomanda di coprire la micropiastra. 8 RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17
3. Svuotare i pozzetti del liquido in essi contenuto e rovesciare la micropiastra per tre volte su carta assorbente picchiettandola energicamente per assicurare la completa fuoriuscita del liquido dai pozzetti. Riempire questi ultimi con 300 µl di tampone di lavaggio (vedi10.1.) e svuotarli di nuovo. Ripetere per altre quattro volte. 4. Addizionare in ogni pozzetto 100 µl di enzima coniugato e incubare per 30 min. a temperatura ambiente (20-25 C / 68-77 F). Durante l incubazione si raccomanda di coprire la micropiastra. 5. Svuotare i pozzetti del liquido in essi contenuto e rovesciare la micropiastra per tre volte su carta assorbente picchiettandola energicamente per assicurare la completa fuoriuscita del liquido dai pozzetti. Riempire questi ultimi con 300 µl di tampone di lavaggio (vedi 10.1.) e svuotarli di nuovo. Ripetere per altre quattro volte. 6. Addizionare in ciascun pozzetto 100 µl di substrato/cromogeno. Miscelare manualmente con cautela e incubare per 15 min. a temperatura ambiente (20-25 C / 68-77 F). 7. Addizionare in ogni pozzetto 50 µl di reagente di stop. Miscelare manualmente con cautela e rilevare le assorbanze a 450 nm contro aria. Leggere i risultati entro 10 minuti dall aggiunta della soluzione di stop. 11. Risultati Per l interpretazione di risultati è disponibile il software RIDA SOFT Win (Art. No. Z9999). Il file è salvato come Stxfood.met nel database interno del software. Dopo aver avviato il software, selezionare Food and Feed e aprire la cartella OTHERS. I risultati sono valutati in base a un valore di cut-off. Questo valore-soglia si determina aggiungendo 0.1 unità all assorbanza media del controllo negativo. I campioni sono considerati positivi se il valore di assorbanza è superiore al valore di cut-off. I campioni sono considerati negativi se il valore di assorbanza è uguale o inferiore al valore di cut-off. RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17 9
12. Sensibilità Campioni alimentari di latte crudo, carne macinata e insaccati sono stati inoculati con 1, 10 o 100 germi di ceppi di E. coli O157:H7 e quindi incubati per una notte in brodo mtsb. In tutti i campioni inoculati di latte crudo e insaccati è stato possibile rilevare la tossina utilizzando il test RIDASCREEN Verotoxin, mentre con la carne macinata di manzo si è notata una minor produzione della tossina, che è stata rilevata in campioni arricchiti con 10 o più germi (vedi tabella 1). I risultati disponibili mostrano che, in condizioni idonee, è possibile rilevare, con RIDASCREEN Verotoxin, anche un solo germe moltiplicabile produttore di verotossina. Tabella 1: Inoculo di campioni alimentari con E. coli O157:H7 numero di germi latte crudo carne insaccati aggiunti macinata 0 < 0.000 0.015 0.016 1 > 2.000 0.026 > 2.000 10 > 2.000 1.034 > 2.000 100 > 2.000 > 2.000 > 2.000 Esame dei campioni inoculati dopo 18 ore di incubazione (in brodo mtsb). Sono riportate le assorbanze misurate a 450 nm, con lunghezza d onda di riferimento > 600 nm. 10 RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17
13. Specificità Nessuna crossreattività è stata evidenziata dall analisi mediante RIDASCREEN Verotoxin di microrganismi patogeni dell intestino e non. Le colture sono state propagate in un terreno non selettivo. Tabella 2: Specificità del test RIDASCREEN Verotoxin Microrganismo OD450nm - OD620nm Acinetob. lwoffii DSM 2403 0.001 Aeromonas hydrop. anaerogenes DSM 30188 0.002 Aeromonas hydrop. hydrophila DSM 30016 0.000 Citrob. freundii* 0.000 Citrob. freundii DSM 30039 0.006 Enterob. cloacae DSM 30054 0.005 Enterococcus faecalis DSM 2570 0.010 Enterococcus faecium ATCC 27164 0.009 E. coli* 0.002 E. coli* 0.002 E. hermanii DSM 4560 0.005 Lactococcus lactis DSM 20481-0.005 Listeria innocua* -0.008 Proteus mirabilis DSM 788 0.004 Proteus mirabilis DSM 4479-0.005 Proteus vulgaris DSM 30119-0.007 Providencia stuartii DSM 6676-0.003 Pseudom. aerug. DSM 939 0.014 Pseudom. fluorescens DSM 4358 0.006 Pseudom. fluorescens DSM 50124 0.008 Salmonella Agona* 0.017 Salmonella Braenderup* -0.003 Salmonella infantis* -0.005 Salmonella Ohio* 0.001 Salmonella typhimurium* 0.000 Serratia proteamaculans DSM 4487 0.005 Shigella flexneri DSM 4782 0.008 Shigella sonnei DSM 5570-0.006 Staph. aureus DSM 20372 0.042 Staph. aureus* -0.004 Strep. agalactiae* -0.003 Strep. dysgalactiae* -0.001 Strep. uberis* 0.001 E. coli 026:H8 VT1 2.196 RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17 11
Controllo Positivo E. coli VT 1+2 (0157:H7) 2.401 Controllo Negativo (mtsb) 0.004 Controllo Positivo (testkit) 2.008 cut-off 0.104 * Isolato 14. Riproducibilità La variabilità Intra-Assay è stata studiata analizzando, per 24 volte ciascuna, 4 diverse concentrazioni di preparati di antigeni Verotossina 1 e 2 (VT 1 e VT 2). Preparati di antigeni VT 1 e VT 2 sono stati analizzati 11 volte indipendentemente (3 lotti di kit, 5 tecnici di laboratorio per 7 giorni). Vengono riportati i valori relativi all assorbanza media, alla deviazione standard e al coefficiente di variazione (determinazione 11x per ogni concentrazione) I risultati sono presentati in tabella 3. Tabella 3: Precisione del kit RIDASCREEN Verotoxin negativo debolmente positivo fortemente positivo positivo VT 1 Intra-Assay Assorbanza media 0.05 0.651 1.227 1.887 Deviazione standard 0.009 0.046 0.058 0.101 Coefficiente di variazione(%) 17.93 7.06 4.75 5.37 VT 2 Intra-Assay Assorbanza media 0.06 0.869 1.646 2.472 Deviazione standard 0.008 0.053 0.08 0.063 Coefficiente di variazione(%) 13.46 6.1 5.07 2.53 VT 1 Inter-Assay VT 1 Assorbanza media 0.056* 0.626 1.192 2.105 Deviazione standard 0.008 0.092 0.105 0.111 Coefficiente di variazione(%) 14.80 14.70 8.80 5.29 VT 2 Inter-Assay VT 2 Assorbanza media 0.056* 0.602 1.157 2.088 Deviazione standard 0.008 0.051 0.094 0.133 Coefficiente di variazione(%) 14.80 8.41 8.15 6.37 * La determinazione della variazione inter-assay per entrambe le tossine è stata eseguita in parallelo, dunque è stato impiegato un solo preparato negativo. 12 RIDASCREEN Verotoxin 12-10-17
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