LA CRESCITA MICROBICA

LA CRESCITA MICROBICA

DEFINIZIONE DI CRESCITA PER CRESCITA SI INTENDE L AUMENTO DELLE DIMENSIONI DI UN INDIVIDUO OVVERO L AUMENTO DEL NUMERO DI INDIVIDUI DI UNA POPOLAZIONE

COMUNEMENTE I MICROBIOLOGI SONO INTERESSATI ALLA CRESCITA MICROBICA DI POPOLAZIONE PIUTTOSTO CHE ALLA CRESCITA DEI SINGOLI INDIVIDUI

LA SCISSIONE BINARIA Prima della divisione la cellula microbica subisce un allungamento fino a 2 volte la sua lunghezza originaria DNA REPLICAZIONE DEL DNA N=2 n GENERAZIONE CELLULARE ALLUNGAMENTO DELLA CELLULA FORMAZIONE DEL SETTO FORMAZIONE DI PARETI DISTINTE DIVISIONE DELLA CELLULA

La crescita dei M si può apprezzare studiando la curva di crescita Quando i M vengono coltivati in mezzo liquido essi crescono come coltura in batch o in sistema chiuso, vale a dire in un recipiente chiuso che contiene un solo tipo di substrato omogeneamente distribuito In un sistema chiuso (BATCH), durante l incubazione non viene aggiunto substrato fresco e si assiste ad una progressiva diminuzione dei nutrienti ed aumento dei prodotti di rifiuto. La crescita dei M che si riproducono per scissione binaria è rappresentabile in una curva di crescita che si divide in 4 porzioni riferite a 4 fasi della crescita stessa Nella curva sono rappresentati i valori logaritmici del n di cellule in funzione del tempo di incubazione

CURVA DELLA CRESCITA MICROBICA Logaritmo CONCENTRAZIONE CELLLULARE fase esponenziale fase stazionaria fase di morte TEMPO Ore

Fase di latenza o fase lag Quando si inocula un M in un sistema chiuso NON si assiste ad un immediato aumento del n di cellule La fase di latenza, prima della divisione cellulare, è estremamente necessaria: se le cellule sono vecchie c è bisogno che il M attivi processi di sintesi essenziali [ATP, DNA, RNA (mainly ribosomi), proteine, cofattori etc.] se le cellule sono danneggiate (perché erano state sottoposte a stress vari come congelamento, refrigerazione, starving etc.) c è bisogno di un tempo di recupero che le rimetta in sesto ovvero che consenta loro di avere tutti i costituenti necessari alla duplicazione se le cellule provengono da un substrato diverso, la fase di latenza è dovuta all ADATTAMENTO del M al nuovo substrato (che richiede con ogni probabilità la sintesi di nuovi enzimi) La durata della fase di latenza dipende dalle condizioni del M e dalla sua adattabilità al substrato fornito, se si fornisce al M un substrato identico a quello precedentemente utilizzato e il M non è stressato la crescita può anche iniziare senza fase lag.

Fase esponenziale o logaritmica (log) Durante questa fase i M sono adattati al substrato e lo utilizzano al meglio è la fase di sviluppo massimo dei microrganismi con la massima espressione di tutte le attività metaboliche LA VELOCITA DI CRESCITA SI MANTIENE COSTANTE (a causa del fatto che i M si duplicano ad intervalli regolari e poco sfalsati) = la curva assume un andamento lineare (l aumento del n di cellule nell unità di tempo è costante) durante questa fase la popolazione è omogenea sia chimicamente che fisiologicamente. Per questo motivo le colture in fase log vengono utilizzate per i saggi in laboratorio

Fase stazionaria I M non possono crescere all infinito. Con un tempo di duplicazione di 20 min un M raggiungerebbe in 48h un popolazione con un peso pari a 4000 volte il peso della terra e pensate che una cellula pesa circa 10-12 g!! La fase stazionaria è l inizio dell arresto della crescita a causa dell esaurimento dei nutrienti o per l accumulo, fino a livelli tossici, di prodotti del metabolismo Durante questa fase il n di cellule vitali (contabili) è costante. Sebbene non si moltiplichino, le cellule possono rimanere metabolicamente attive (Stato VBNC = Viable But Non-Culturable). E una fase importante per la produzione di metaboliti biotecnologicamente importanti quali antibiotici ed alcuni enzimi

Fase di morte La fase stazionaria ha una durata dipendente da più fattori (tipo di M, substrato, condizioni di incubazione etc.) Successivamente la popolazione va incontro a morte e quindi il n di cellule vitali diminuisce nel tempo Il numero di cellule che muoiono nell unità di tempo è costante quindi la curva ha andamento logaritmico discendente In molti casi le cellule oltre a cessare tutte le loro attività vanno incontro a lisi

LA CRESCITA ESPONENZIALE a x Log a x Y Log a x 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 0 1 2 3 4 2 n Log 2 n a x 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 0,00 0,301 0,602 0,903 1,204 CRESCITA MICROBICA: PROGRESSIONE GEOMETRICA IN BASE 2 X

CURVA DELLA CRESCITA MICROBICA CONCENTRAZIONE CELLLULARE Log numero di cellule fase esponenziale fase stazionaria 2 n Log 2 n 2 0 0,00 2 1 0,301 2 2 0,602 2 3 0,903 2 4 1,204 fase di morte TEMPO

VELOCITÀ DELLA CRESCITA n k = t Log numero di cellule K = costante media del tasso di crescita n = numero di generazioni al tempo t TEMPO t

TEMPO DI GENERAZIONE 1 k = t n = g g = tempo medio generazionale Log numero di cellule TEMPO t

N t = N 0 2 n N t = popolazione al tempo t N 0 = popolazione iniziale n = numero di generazioni al tempo t n = LogN t - LogN 0 0,301 n LogN k = t - LogN = 0 t 0,301 t

numero di cellule 10 6 tempo 10 9 7 ore t = 7 ore N 0 = 1 10 6 N t = 1 10 9 k = LogN t - LogN 0 0,301 t g = 1 k k = 9-6 0,301 7 = 1,4 generazioni/ora g = 0,301 7 9-6 = 0,7 ore/generazione

MISURAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA NUMERO DI CELLULE Conta diretta: microscopio Conta indiretta: in substrado solido o liquido MASSA CELLULARE Peso secco Turbidometria

CONTA DIRETTA Camera di conta Petroff-Hausser (profondità 0,02 mm = 1/50 mm)

Camera di conta Thoma (profondità 0,1 mm = 1/10 mm) Camera di conta Petroff-Hausser (profondità 0,02 mm = 1/50 mm)

CONTA INDIRETTA 1 ml SU MEZZO SOLIDO Tubi da 9 ml di soluzione disperdente (10-1 ) (10-2 ) (10-3 ) (10-4 ) (10-5 ) (10-6 ) 1 ml per piastra Terreno nutritivo solido in scatole di Petri UFC/ml

CONTA INDIRETTA 1 ml SU MEZZO LIQUIDO Tubi da 9 ml di soluzione disperdente (10-1 ) (10-2 ) (10-3 ) (10-4 ) (10-5 ) (10-6 ) 1 ml per tubo Terreno nutritivo liquido MPN/ml

MISURA DEL PESO SECCO Pesare un tubo vuoto da centrifuga Centrifugare X ml di brodocoltura Allontanare il surnatante colturale Lavare le cellule con tampone isotonico Seccare il campione in stufa Pesare il campione Per differenza si avrà il peso secco delle cellule mg/ml

TURBIDOMETRIA sorgente luminosa coltura microbica rilevatore e registratore - cell Densità Ottica OD + cell

Quando la crescita viene misurata con lo spettrofotometro il risultato non è esattamente identico...

Oltre alle colture in batch esiste anche la possibilità di far crescere i M in COLTURE in CONTINUO Queste vengono realizzate in chemostati in cui viene continuamente aggiunto brodo colturale fresco e contemporaneamente viene rimosso un eguale volume di brodo esausto contenente cellule

FATTORI AMBIENTALI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA MICROBICA Temperatura ph Attività dell acqua Nutrienti Composizione dell atmosfera