Caratterizzazione biochimica dei carboidrati contenuti nel formaggio PARMIGIANO-REGGIANO a diversi tempi di stagionatura. Prof. Giovanni Valentino Coppa
Introduzione A) L ecosistema intestinale ed i vantaggi della flora bifidogena. E noto che il tratto digerente dell uomo è colonizzato da un elevato numero di specie batteriche che si organizzano in un complesso equilibrio dinamico. I batteri presenti nell intestino umano possono essere classificati, a seconda del loro impatto sulla salute dell individuo, in tre gruppi: a) batteri ad effetto benefico (Bifidobatteri, Lattobacilli ed Eubatteri); b) batteri potenzialmente patogeni (Stafilococchi, Clostridi, Proteus e Pseudomonas); c) batteri che possono esercitare sia effetti benefici che patogeni (Coli, Streptococchi, Batterioidi ed Enterococchi). La colonizzazione microbica dell intestino umano inizia alla nascita, quando da una situazione di sterilità il neonato affronta l ambiente esterno ricco di numerose specie batteriche. Studi sperimentali hanno dimostrato che la natura del parto esercita una notevole influenza sulla composizione della microflora intestinale nei primi giorni di vita, ma trascorsa la prima settimana, indipendentemente dalle modalità tipo del parto, lo sviluppo della flora intestinale è fondamentalmente influenzato dal tipo di alimentazione. Infatti, i lattanti alimentati con latte materno presentano una flora microbica caratterizzata dalla netta prevalenza (circa 90%) di bifidobatteri e lattobacilli ( flora bifidogena ); al contrario, il bambino allattato artificialmente sviluppa una flora mista con minor numero di bifidobatteri (40-60%) e presenza di altri germi che, in alcune situazioni particolari, possono anche avere effetti patogeni (clostridi, stafilococchi, batterioidi). Con il divezzamento vanno attenuandosi le differenze tra il bambino allattato al seno ed artificialmente fino a scomparire attorno all anno con lo stabilizzarsi di una flora microbica molto vicina a quella dell adulto. In questi ultimi anni sono state eseguite numerose ricerche che hanno messo in evidenza i principali meccanismi attraverso cui la flora bifidogena esplica effetti benefici sulla salute dell individuo. Essi si possono schematicamente riassumere come segue: 58
Facilita l assorbimento dei nutrienti e dei minerali Ostacola lo sviluppo della flora patogena e protegge dalle infezioni gastrointestinali Stimola il sistema immunitario Favorisce la sintesi di vitamine Riduce la produzione di gas B) Come modulare l ecosistema intestinale: prebiotici, probiotici e sinbiotici. Da diversi anni particolare attenzione è stata rivolta a modulare la composizione dell ecosistema intestinale nell intento di favorire lo sviluppo della flora bifidogena sia in età pediatrica che nell adulto. A tal fine sono state impiegate diverse strategie: a) approccio probiotico : secondo le più recenti definizioni esso consiste nella somministrazione di microorganismi vivi di origine umana in quantità tale da sopravvivere all ambiente acido dello stomaco ed all azione dei sali biliari, da raggiungere il grosso intestino in quantità sufficiente da colonizzare in tale sede e da modificare la composizione della flora microbica esistente in maniera tale da esercitare effetti benefici sulla salute dell individuo; b) approccio prebiotico : consiste nella somministrazione di sostanze che non debbono essere né idrolizzate né assorbite nel primo tratto dell apparato digerente, sono quindi in grado di raggiungere il colon dove stimolano selettivamente la moltiplicazione dei ceppi benefici esistenti (bifidobatteri e lattobacilli) ed inducono effetti locali e sistemici vantaggiosi per l ospite; c) approccio sinbiotico : consiste nella somministrazione contemporanea di probiotico e prebiotico sempre al fine di ottenere gli effetti benefici sopra descritti. Razionale della ricerca. Dai dati della Letteratura emerge che, tra le sostanze prebiotiche, un ruolo di primo piano nella capacità di favorire lo sviluppo della flora bifidogena è svolto dagli oligosaccaridi presenti in grande quantità nel latte umano. Il latte vaccino, al contrario, ha un contenuto di tali sostanze 59
notevolmente inferiore e ciò spiega la notevole differenza della flora microbica del neonato allattato al seno rispetto a quello allattato artificialmente, come sopra esposto. Per ovviare a questa limitazione sono stati introdotti in commercio alcuni oligosaccaridi non digeribili (Galatto-oligosaccaridi, Frutto-oligosaccaridi, Inulina) che, aggiunti ai latti artificiali, sono in grado di fornire ad essi un effetto bifidogeno molto simile a quello del latte umano. Alcuni di questi oligosaccaridi vengono sintetizzati dopo la fermentazione del lattosio da parte di alcuni ceppi batterici. E, quindi, possibile che nel processo di preparazione del Parmigiano- Reggiano possano essere sintetizzati oligosaccaridi con un meccanismo analogo, oppure che catene oligosaccaridiche possano essere ottenute per degradazione di glicoproteine del latte ed essere presenti nel prodotto. Ciò rappresenterebbe il presupposto per valutare un possibile effetto prebiotico del Parmigiano-Reggiano. Scopo dello studio. Individuazione di eventuali carboidrati presenti in campioni di Parmigiano- Reggiano con diversi stadi di maturazione, tramite test biochimici (High Performance Anion Exchange Chromatography-HPAEC e Thin Layer Chromatography-TLC). In particolare lo studio prevedeva, come da accordi stabiliti nel contratto di convenzione: A) dosaggio quantitativo del lattosio; B) caratterizzazione qualitativa di eventuali altri carboidrati presenti (monosaccaridi, disaccaridi, oligosaccaridi). Materiali e metodi. Sono stati ricevuti n.14 campioni di formaggio Parmigiano-Reggiano da analizzare in cieco.i campioni, numerati in ordine progressivo, sono arrivati in buste sigillate già grattugiati, in ambiente refrigerato e sono stati conservati a 20 C fino al momento dell analisi. 60
Preparazione dei campioni: I campioni sono stati diluiti ad una concentrazione di 200 mg/ml con H 2 O ad alto grado di purezza, agitati al Vortex per circa 5 min. e successivamente sottoposti, in bagno di ghiaccio, a 3 cicli di ultrasuoni della durata di 5 ciascuno. Dopo centrifugazione a 3000 rpm x 10 min. a 4 C, lo strato acquoso infranatante è stato raccolto per aspirazione, e sottoposto a procedura di deproteinizzazione tramite miscelazione con acetonitrile in rapporto 1:1. Dopo agitazione al Vortex il campione è stato centrifugato nelle stesse condizioni sopra descritte. Il sovranatante è stato, quindi, filtrato con membrane da 0,2 _m ed utilizzato per le procedure analitiche: Analisi dei campioni: Thin Layer Chromatography : semina su lastre di vetro al gel di silice Merck, seguita da migrazione cromatografica eseguita in una miscela di butanolo: acido acetico: acqua, secondo il metodo di Humbel et al. (Clin.Chim. Acta,1975; 60: 143). High Performance Anion Exchange Chromatography: iniezione del campione nel sistema Dionex Dx 500 e separazione cromatografia a gradiente con il metodo di Coppa et al. (IJP, 1999; 25: 209-212). Lo strumento è stato calibrato con soluzioni scalari di lattosio standard, per il dosaggio quantitativo dello stesso. Il contenuto di lattosio di ogni singolo campione è stato calcolato come media di tre successive corse. Il picco del lattosio è risultato nella stragrande maggioranza dei campioni ai limiti della seppur alta sensibilità del detector, e per di più in prossimità di altri picchi; per tale motivo al fine di identificare con certezza e di quantizzare con precisione il lattosio, si è ritenuto opportuno allestire un altra serie di prove aggiungendo una concentrazione nota di lattosio standard in ciascuno dei campioni precedentemente esaminati. 61
Risultati. Identificazione dei campioni: Al completamento delle analisi, ci è stato fornito dal Consorzio Parmigiano- Reggiano l elenco per la decodifica dei campioni studiati. Nella tabella seguente sono riportati gli abbinamenti: n del campione analizzato / luogo di produzione / grado di stagionatura. Campione mesi 1 1 2 2 3 4 4 10 5 6 6 12 7 36 8 20 9 7 10 6 11 12 12 20 13 11 14 17 Caratterizzazione qualitativa dei carboidrati: Thin Layer Chromatography : con tale metodica in tutti i campioni non è stato possibile identificare alcuna banda in corrispondenza del punto di migrazione del lattosio standard; sono state individuate solo alcune bande, molto tenui, nella zona degli oligosaccaridi. High Performance Anion Exchange Chromatography : tale metodica ha messo in evidenza in tutti i campioni esaminati numerosi picchi riferibili ad oligosaccaridi con tempi di ritenzione compresi tra 2 e 55 min.; il lattosio presentava un tempo di ritenzione costantemente attorno ai 16 min. (Fig. 1). 62
Dosaggio quantitativo del lattosio: I risultati ottenuti, derivanti dalla media dei dosaggi in triplicato, sono riportati nella tabella seguente. La concentrazione del lattosio nei campioni analizzati è stato espressa non solo in mg di lattosio/100 gr di Parmigiano, ma anche in mg di lattosio/100 kcal, al fine di verificare la possibilità di considerare il prodotto Lactose free sulla base delle norme proposte della Commissione Europea relativa ai latti artificiali per il neonato ed il lattante (http://europa.eu.int/comm/food/fs/ sc/scf/index_en.html). Lattosio e grado di stagionatura. Nel grafico seguente è riportato l andamento del lattosio (in mg/100gr di Parmigiano) in rapporto al tempo di stagionatura in tutti i campioni analizzati, indipendentemente dalle sedi di produzione. Campione Mesi mg latt/100 gr mg latt/100kcal 1 1 n.d.(*) n.d. 2 2 0,0867 0,0232 3 4 0,11 0,0294 4 10 0,16 0,0428 5 6 0,2 0,0535 6 12 0,2 0,0535 7 36 0,3867 0,1034 8 20 0,1967 0,0526 9 7 0,0733 0,0196 10 6 0,0567 0,0152 11 12 0,19 0,0508 12 20 0,2433 0,0651 13 11 0,125 0,0334 14 17 n.d. n.d. (*) : non dosabile 63
Conclusioni. I risultati sopra riportati si possono riassumere come segue: A) Dosaggio quantitativo del lattosio. In tutti i campioni analizzati, indipendentemente dal periodo di stagionatura e dai caseifici di provenienza, la concentrazione del lattosio è risultata decisamente bassa con un range compreso tra non dosabile e 0.39 mg/100 gr. B) Parmigiano Reggiano come prodotto lactose free. Le Tabelle di composizione degli alimenti pubblicate nel 1989 dall Istituto Nazionale della Nutrizione riportano per il Parmigiano un concentrazione calorica pari a 374 kcal/100 gr di prodotto. Il Report of the Scientific Commettee on Food on the Revision of Essential Requirements of Infant Formulae and Follow-on Formulae della Commissione Europea pubblicato nell Aprile 2003 (http://europa. eu.int/comm/food/fs/sc/scf/index_en.html) propone, a pagina 86, di qualificare come lactose free i latti artificiali che abbiano un contenuto di lattosio minore di 10 mg/100 kcal. Per questo motivo abbiamo calcolato la concentrazione di lattosio in mg/100 kcal. 64
I risultati della concentrazione di lattosio, da noi ottenuti, variano da non dosabile a 0,1 mg /100 kcal. Di conseguenza il Parmigiano Reggiano può essere senza dubbio definito un alimento privo di lattosio, pur in attesa della definizione delle normative sui claims. C) Altri carboidrati: oligosaccaridi. In tutti i campioni esaminati sono stati individuati numerosi picchi riferibili ad oligosaccaridi (Fig. 1). Il pattern di tali picchi ha dimostrato una sequenza abbastanza costante nei diversi campioni esaminati. Le indagini mettono in evidenza la presenza di oligosaccaridi in tutti i campioni analizzati. Dall analisi dei cromatogrammi, gli oligosaccaridi non sembrano riferibili ad un effetto di sommazione o concentrazione di quelli del latte vaccino, in quanto molto più numerosi degli oligosaccaridi contenuti nel latte vaccino stesso (confronta Fig. 1 e Fig. 2) 65
La loro presenza nel prodotto finito potrebbe essere, più probabilmente, ricondotta alla azione dei complessi processi fermentativo-digestivi che si verificano nella catena di produzione del Parmigiano-Reggiano. Tali processi potrebbero, infatti, portare alla sintesi di nuovi oligosaccaridi o alla liberazione di catene oligosaccaridiche da molecole più complesse quali caseina ed altre glicoproteine. Tali risultati rappresentano il razionale biochimico per un possibile effetto prebiotico del Parmigiano-Reggiano. 66