Elettroforesi degli acidi nucleici Una volta che i frammenti del DNA o del RNA da analizzare sono stati amplificati con la reazione PCR è necessario separarli ed identificarli. A tale scopo si utilizza la tecnica dell elettroforesi che, come dice il nome, consiste nel movimento di molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico generato dalla differenza di potenziale creata da un alimentatore di corrente. Dato che in tampone alcalino o neutro gli acidi nucleici si comportano come molecole cariche negativamente (anioni) esse migreranno verso il polo positivo. Nella pratica quotidiana l elettroforesi viene effettuata su supporto solido, generalmente costituito da gel di agarosio o di poliacrilamide. Il primo si utilizza per separazioni rapide a bassa risoluzione, quando i frammenti sono grandi e molto diversi tra loro per grandezza; il gel di poliacrilammide si utilizza invece per frammenti piccoli o quando essi differiscono tra loro per pochi nucleotidi, come nel caso del sequenziamento. Elettroforesi in gel di agaroso La maggior parte delle elettroforesi di campioni di DNA viene eseguita utilizzando il gel di agarosio. L agarosio è un polisaccaride preparato per purificazione dell agar, che per riscaldamento e successivo raffreddamento forma un gel solido la cui struttura porosa ricorda i fori di un setaccio. A seconda della concentrazione dell agarosio i pori del gel sono più o meno grandi: le molecole di DNA passano attraverso i pori del gel e a seconda della propria lunghezza percorrono una distanza più o meno lunga. L'agarosio ha pori di dimensioni adeguate per la maggior parte dei frammenti di DNA normalmente analizzati. Per i piccoli frammenti o per separare molecole di DNA di grandezza molto simile si preferisce usare il gel di poliacrilammide.
L elettroforesi viene fatta avvenire all interno di una cella elettroforetica che contiene una soluzione tampone in contatto con gli elettrodi, il polo negativo o catodo e il polo positivo o anodo. Dato che le molecole di DNA sono cariche negativamente essere si spostano verso il polo positivo (migrazione anodica). In teoria tutti i frammenti in un campo elettrico dovrebbero muoversi con la stessa mobilità verso l'anodo. Tuttavia nel gel le molecole di agarosio che costituiscono la matrice oppongono una certa resistenza al movimento per cui le molecole più grosse incontrano più difficoltà nel passare attraverso i pori (le molecole molto grosse come l estratto totale di DNA genomico possono anche non muoversi affatto), mentre le molecole più piccole si muovono più velocemente. La velocità della migrazione dipende quindi dal peso molecolare dei vari frammenti: i frammenti a più alto peso molecolare migrano più lentamente rispetto a quelli a più basso peso molecolare. In commercio esistono particolari tipi di agarosio (es. Metaphor Agarosio) che hanno un maggior potere di rosoluzione e permettono di discriminare bene frammenti che differiscono anche solo di 4 paia di basi. La preparazione di un gel di agarosio avviene in questo modo: l agarosio in polvere o il Metaphor vengono pesati, sciolti nel tampone TBE e portati ad ebollizione. Il tampone TBE è un tampone Tris-borato che si prepara sciogliendo sodio borato e EDTA in acqua deionizzata. Prima che il gel raffreddi, a circa 50 C, si aggiunge il colorante Bromuro di Etidio (EtBr) (concentrazione finale di 0.5 g/ml) e si cola su un supporto di plastica nel quale è stato inserito un pettine che serve per la formazione dei pozzetti all interno del gel. Usando un puntale di pipetta si devono allontanare le bolle d aria verso le pareti o il fondo del contenitore, mentre il gel è ancora liquido. A temperatura ambiente il gel polimerizza in 10-15 minuti: quando si solidifica il gel diventa opaco. Bisogna fare attenzione a non muovere o far vibrare il supporto mentre l agaroso si sta solidificando. Per verificare se il gel si è solidificato basta toccare un angolo dell agarosio lontano dal pettine. Una volta avvenuta la polimerizzazione il gel viene inserito nella cella elettroforetica contenente il tampone TBE. Il gel può essere applicato verticalmente od orizzontalmente a ponte tra i due elettrodi a seconda del tipo di cella elettroforetica.
I campione di DNA vengono caricati sul gel con l aggiunta di coloranti (blu di bromofenolo, xilene cianolo) che permettono di seguire visivamente il caricamento del campione nel pozzetto e la migrazione del DNA nel gel. Inoltre viene aggiunto glicerolo o saccarosio per appesantire il campione e far si che vada a fondo nel pozzetto e non galleggi. In ogni pozzetto si caricano da 2 a 20 microlitri di amplificato (a seconda della profondità del pozzetto che viene regolata in base al volume del gel); in uno dei pozzetti viene caricato uno standard di pesi molecolari, di solito un ladder allelico, cioè una miscela di alleli di peso molecolare noto, che viene fatta migrare nello stesso gel per consentire il confronto con i frammenti da identificare. In genere la corsa viene effettuata ad un voltaggio costante (per esempio 120 volt) con un campo elettrico pari a 1.5V/cm. Facendo variare la concentrazione di agarosio si ottengono maglie più o meno fitte, che vengono usate in funzione della dimensione del frammento di DNA da separare. In genere la concentrazione dell agarosio varia tra 0,3 e il 4 grammi per cento, a seconda della dimensione degli acidi nucleici che devono essere separati. La seguente tabella riporta la concentrazione (%) dell agarosio richiesta per la separazione frammenti di DNA di diverse dimensioni (kilobasi): 0,3 1,0-70 kb 0,5 0,7-45 kb 0,8 0,4-20 kb 1,0 0,3-10 kb 1,2 0,2-8 kb 1,5 0,2-6 kb 2,0 0,1-5 kb Il tampone TBE è un tampone a bassa forza ionica e viene utilizzato anche come tampone di corsa dentro la cella elettroforetica: come abbiamo detto esso contiene sodio borato e acido etilendiammino tetraacetico (EDTA) che serve a chelare i cationi bivalenti, e impedire che possano attivare le numerose nucleasi che potrebbero digerire il DNA. Una volta terminata la corsa elettroforetica, è necessario colorare il gel per visualizzare le bande di DNA separate. Solitamente viene utilizzato il bromuro di etidio, un colorante fluorescente che viene stimolato utilizzando luce ultravioletta a una lunghezza d'onda di 302 nanometri, ma come vedremo in seguito esistono ora altri coloranti che sono meno tossici.
Elettroforesi in gel di poliacrilammide Quando è necessaria una elevata risoluzione anziché l agaroso occorre adoperare i gel di poliacrilamide. Essi vengono prodotti facendo polimerizzare una sostanza chimica che si chiama acrilamide. Questa sostanza in soluzione è un monomero, cioè è una molecola singola che però può essere trasformata in un polimero cioè in lunghe catene di monomeri legati tra loro mediante un altro composto che si chiama bis-acrilamide (per la precisione N,N'-metilen-bis-acrilamide). Questa reazione di polimerizzazione trasforma la soluzione liquida di acrilamide in un gel solido di poliacrilamide e la reazione viene catalizzata da un sale che si chiama ammonio persolfato (APS). L APS produce radicali liberi di ossigeno in presenza di ammine terziarie come la TEMED (N,N,N,'N' tetrametilendiammina) e questi radicali inducono la formazione di catene, appunto, di poliacrilammide disposte a formare un gel. La dimensione media dei pori è determinata sia dalla concentrazione totale dei monomeri che dalla percentuale di bis-acrilamide rispetto ai monomeri totali; di solito il rapporto acrilamide/bis-acrilammide è 19:1. La temperatura ottimale di polimerizzazione è tra i 25 e i 30 C e, in assenza di ossigeno che inibisce la polimerizzazione, la reazione è completa generalmente in 60 minuti. La percentuale di poliacrilammide nel gel varia dal 4 all 8 percento. Questi gel consentono di separare frammenti che differiscono l uno dall altro anche di un solo nucleotide. Il gel in genere è tenuto in posizione verticale e, come nel caso dell elettroforesi in agarosio, la corsa è controllata tramite marcatori colorati che seguono il fronte d onda. Bisogna ricordare che l'acrilammide è una potente neurotossina e nella forma non polimerizzata è facilmente assorbita attraverso la pelle. Una volta avvenuta la gelificazione perde la sua pericolosità in quanto non è più assorbita. Tecniche di colorazione dei gel Una volta terminata la corsa elettroforetica le bande del DNA devono essere visualizzate all interno della matrice del gel. Esistono differenti coloranti che si legano agli acidi nucleici con meccanismi diversi e che sono in grado di essere rivelati mediante sorgenti luminose di diverso tipo (raggi ultravioletti, luce visibile, etc.). Per il gel di agarosio si utilizza abitualmente il bromuro di etidio (EtBr), un agente intercalante che si lega al DNA e può essere rivelato con un transilluminatore UV. La molecola del bromuro di etidio è
piatta e molto simile a quella delle basi azotate per cui si insinua tra una base azotata e quella successiva nella doppia elica e inoltre emette fluorescenza arancione se eccitata da luce ultravioletta con lunghezza d onda compresa tra 254 e 306 nm, con un massimo a 302 nm, in un apparecchio che si chiama transilluminatore. Il bromuro di etidio è una molecola organica altamente mutagena e cancerogena, per cui va maneggiato con prudenza e inoltre va smaltita con opportune precauzioni per evitare la contaminazione dell ambiente. Questo colorante è in grado di evidenziare quantitativi di acidi nucleici fino a 50 ng. L'uso di un ladder (una serie di frammenti a dimensione nota), permette di avere informazioni sulle dimensioni dei frammenti. Anche per il gel di poliacrilammide è possibile effettuare una colorazione con bromuro di etidio oppure si può ricorrere alla colorazione argentica, metodo circa 100 volte più sensibile, anche se necessita di tempi operativi più lunghi. Il metodo si basa sulla precipitazione di argento metallico sui polimeri di DNA dopo fissazione e riduzione di ioni argento a livello dei gruppi fosfato. Il riducente utilizzato è costituito da tiosolfato di sodio in presenza di aldeide formica. Attualmente sono in corso di studio metodiche di colorazione altamente sensibili che utilizzano nuovi coloranti fluorescenti alternativi al bromuro di etidio. Questi coloranti come ad esempio il SYBR Green possono essere usati nello stesso modo del bromuro di etidio e il loro smaltimento non richiede trattamenti speciali di decontaminazione.