Piante transgeniche prive di geni marker I geni marker sono necessari per l'isolamento di piante transgeniche (efficienza di trasf. non ottimale), ma poi non servono più. Possibili problemi una volta in campo (il marker diventa non solo non necessario, ma anche indesiderabile o inaccettabile). La necessità di trasferire più geni (trasf multiple) richiederebbe troppi geni marker diversi. Soluzioni: no gene marker analisi molecolare delle piante ottenute, uso di geni reporter piuttosto che marker (GFP), selezione positiva (marker free) eliminazione geni marker (marker removal)
Marker free Recenti applicazioni, alle cellule trasformate si dà un vantaggio metabolico non selettivo. Si aumenta la capacità di crescita e di rigenerazione delle cellule trasformate rispetto a quelle non trasformate. Fosfomannoso isomerasi, pmi. Substrato di crescita contiene mannosio. Una volta nella cellula viene fosforilato a Mann-6-P, si accumula inibendone la crescita. Se le cellule sono trasformate hanno l'isomerasi che converte il mannosio in fruttosio che può essere metabolizzato.
Mannose selection has so far been shown to be successful for the transformation of sugar beet, potato, oil seed rape, wheat and maize. Facilmente saggiabile con saggio colorimetrico
Marker removal Deve essere rapido e molto efficiente e limitare il numero di trasformazioni aggiuntive o di incroci sessuali. Diversi metodi per eliminare il gene marker (tradizionale) dopo la rigenerazione: co-trasformazione excisione.
For cotransformation various arrangements of marker gene (red) and the gene of interest (target gene, green) are possible on the vector: - two different strains of Agrobacteria, each with a transformation vector; one vector contains the marker gene, the other the target gene (top diagram); - one bacterial strain with two vectors, each with one gene (centre); -one bacterial strain with one vector, on which the two genes are located at separate sites (bottom). Cotransformation is successful if both genes are integrated independently of each other
Once the target and marker gene have been integrated independently into the plant genome, they can be separated again in the progeny of these genetically modified plants: the progeny receive one gene or the other but not both. Parents: Gametes (sex cells) contain only one chromosome set. It may carry only the marker gene (M, red), the target gene (Z, green), both genes or neither gene. Progeny: Various combinations of marker and target genes are possible in the progeny generation. The plants that do not carry a marker gene (blue) can be used for further breeding. Mathematically, every fourth plant of this marker-gene-free group of progeny will carry neither marker gene nor target gene.
Analisi della progenie dopo 1 incrocio F1 per segregazione tra marker e gene d'interesse. Bisogna essere certi che ci sia solo una copia di entrambi i geni e che siano davvero unlinked. Bisogna fare uno screening su molti individui per trovare quello giusto.
Excisione Eliminazione del marker dopo la trasformazione. Marker e gene d'interesse nello stesso locus vengono separati da una ricombinazione sito specifica. In the early 1990's a new method was developed to delete a specific portion of DNA. The procedure took advantage of the basic research performed on the bacteriophage called P1. In this virus, there is an enzyme called cre and particular DNA sequences called lox P sites. The lox P sites work in pairs and they flank a segment of DNA called a target
When the cre enzyme binds to the lox P sites, it cuts the lox sites in half and then splices together the two halves after the target DNA has been removed
M: gene marker R: ricombinasi sotto il controllo di un promotore inducibile, tramite induttore ind Siti loxp
Ricombinasi Cre del fago P1 rimuove il marker fiancheggiato dai siti lox (34bp ripetuti diretti). Ricombinasi espressa in modo transiente o da un altro T-DNA che viene poi fatto segregare oppure ancora da un gene posto anch'esso tra i siti lox. La re-inserzione della molecola deleta non si osserva perché la molecola circolare prodotta non si replica e viene persa. Applicabile anche ai plastidi. Problema: evitare la continua espressione della ricombinasi per evitare riarrangiamenti cromosomici su siti lox spuri.
Trasposasi Marker (o gene d'interesse) fiancheggato da TIR. Trasposoni a DNA
L'efficienza non e' sufficientemente elevata e ci sono rischi che il trasposone (o la trasposasi) causi riarrangiamenti cromosomici, serve comunque l analisi della progenie dove avviene la segregazione.