Vascolarizzazione e protesi vascolari Corso di Ingegneria dei Tessuti Lezione del 24_10_2012
VASO SANGUIGNO L endotelio è composto da circa 1-6 x 10 13 cellule, pesa circa 1 kg e copre una superficie di circa 1-7 m 2 Funzione di Trasporto: O2 e CO2 Nutrienti Metaboliti Ormoni Calore
Ci sono 3 tipi principali di vasi Arterie Vasi per la distribuzione del sangue al corpo Capillari Piccoli vasi che portano sangue alle cellule Vene Grossi vasi di raccolta che riportano il sangue al cuore Vasi intermedi Arteriole: portano il sangue ai capillari Venule : richiamano il sangue dai capillari
Classificazione dei Vasi Grandezza e Composizione
Struttura Generale Possiamo distinguere 3 strati o tuniche: Tunica avventizia, media e intima Le tuniche circondano il lume, la parte centrale dove fluisce il sangue
TUNICA INTERNA:L INTIMA Le cellule endoteliali formano la parete interna di tutti i vasi sanguigni e regolano il flusso di sostante nutritive Le cellule sono piatte, senza spazi inter-cellulari. Formano una superficie che minimizza l attrito tra sangue e superficie del lume uno strato di tessuto connetivo lasso, detto la lamina basale, forma un supporto per l endotelio. Tunica avventizia
TUNICA INTERNA:L INTIMA la cellula endoteliale Una tipica cellula endoteliale ECs ha forma allungata (circa 30 μm lunghezza, and 0.3 μm altezza) e possiede un glicocalice di glicosamminoglicani esternamente alla membrana cellulare che conferisce una parziale carica negativa (circa 10nm di spessore) (Ribatti et al, 2002, review). le cellule endoteliali: una popolazione eterogenea di cellule L eterogeneità degli endoteli dipende dalla specie, dalla grandezza dei vasi e dal letto microvascolare. A seconda del tipo di vaso (arteria, vena, capillare), le EC sono circondate da un numero variabile di strati di cellule peri-endoteliali costituite rispettivamente da periciti nei vasi piccoli e da cellule muscolari lisce nei vasi grandi.
TUNICA MEDIA La tunica media è formato principalmente da cellule del muscolo liscio e foglie di elastina. Le cellule sono orientate a spirale. L attivita del musclo liscio è regolata da fibre nervose vasomotorie che fanno parte sistema nervoso autonomo (simpatico). Tunica media
TUNICA MEDIA Le attivita della tunica media sono importanti nella regolazione della dinamica del sistema circolatorio. In genere, la tunica media è lo strato piu spesso nelle arterie, ed è responsabile del mantenimento della pressione sanguigna e di un flusso continuo di sangue.
TUNICA AVVENTIZIA una matrice collagenica costituita prevalentemente da fibroblasti dà rigidità e forma ai vasi sanguigni Piu sottile della tunica media Poche fibre elastiche è piu rigido della tunica media, e protegge il vaso da sovradeformazione Contiene i vasa vasorum e i nervi vascolari Tunica avventizia
longitudinale circonferenziale
Necessità di sostituti ingegnerizzati
Gel biopolimerici (fibrina/collagene)
Electrospinning di PCL collagene
In vivo 1.Vasculogenesi 2. Angiogenesi
VASCULOGENESI Processo di formazione di vasi a partire dai precursori mesodermici delle cellule endoteliali Cellule mesenchimali Isola sanguifera Emangioblasto cellula del sangue cellule endoteliali esternamente Angioblasti Precursori cellule endoteliali internamente Cellule ematopoietiche Precursori cellule del sangue Plesso vascolare primitivo Esse sono definite come cellule che hanno la potenzialità di differenziare in cellule endoteliali ma non hanno ancora markers specifici
PLASTICITÀ FENOTIPICA delle CELLULE ENDOTELIALI Stato quiescente vs Stato angiogenico Durante lo sviluppo embrionale e postnatale la proliferazione delle cellule endoteliali è cospicua, per ridursi o cessare del tutto nell adulto. L endotelio nell adulto, sebbene sia metabolicamente attivo, si dice essere in uno stato quiescente per il basso turnover cellulare. Diverse condizioni fisiopatologiche inducono l attivazione del processo angiogenico L endotelio si dice essere in uno stato angiogenico per il rapido turnover cellulare
Marcatori cellule endoteliali
Condizioni che attivano l angiogenesi Microambiente
Sprouting angiogenico: un processo multi-step 1.Stimolazione delle cellule endoteliali da parte di fattori con attività angiogenica 2. Degradazione della lamina basale dei capillari da parte delle cellule endoteliali attivate ad opera di proteasi extracellulari. divisione cellulare Fattori Angiogenici migrazione cellulare 3. Formazione di sprouting capillari e migrazione delle cellule endoteliali.
Sprouting angiogenico: un processo multi-step 4. Vasi neoformati contigui si fondono e danno origine ad una nuova rete vascolare pervia 5. Maturazione dei vasi neoformati. 5. Regressione del vaso in assenza di perfusione e maturazione Ciascuna fase del processo coinvolge specifici fattori
REGOLAZIONE DELLA MORFOGENESI ENDOTELIALE Morfogenesi (EC-M) BILANCIO ANGIOGENICO Quiescenza Regressione (EC-R) EC-r EC-r EC-m EC-m EC-m MMP-1, plasmina, plasma kailikreina EC-r vasculogenesi angiogenesi (+) regressione (-) (+) VEGFs, FGFs, PlGF, HGF, PDGF, FN, LM, Oligo-HA, MMPs, ipossia Inhibitori di proteinasi (PAI-1, TIMP-1), inhibitori di citokine periciti L espressione temporale e spaziale di questi fattori è ben coordinata durante il processo di angiogenesi In vivo the expression of the angiogenic modulators is well regulated in time and space Davis,The anatomical Record, 2002
Attivazione delle cellule endoteliali da parte di citochine e fattori di crescita VEGF Fattore di crescita dell endotelio vascolare Fattore di permeabilità vascolare bfgf Fattore di crescita dei fibroblasti PlGF Fattore di crescita placentale PDGF Angiogenina
Modificazione della LAMINA BASALE subendoteliale Endotelio quiescente Endotelio angiogenico Collagene IV Laminina HA degradazione rimodellamento Fibronettina, vitronettina, Oligo-HA, Fibrina, Collagene I, VIII, matricellular protein (SPARC, TSP-1) Stupack, D G. 2002 ; Bischoff, J.1995
Modificazione dell espressione delle INTEGRINE Endotelio quiescente α 2 β 1, α 1 β 1 α 3 β 1, α 6 β 1 Collagene, laminina ECM Quiescente Disponibilità dei ligandi ECM Angiogenica Endotelio angiogenico α 5 β 1, α V β 3, α 2 β 1 α 1 β 1, α 6 β 1 Fibronectina, laminina Stupack, 2002
artrite cecità cancro Eccessiva psoriasis sterilità ANGIOGENESI Insufficiente ulcera scleroderma malattie cardiache
Vascolarizzazione in ingegneria dei tessuti
Vascolarizzazione di matrici polimeriche PERCHE? Le cellule richiedono ossigeno e nutrienti per la loro sopravvivenza La mancanza di vascolarizzazione rappresenta il principale limite dell ingegneria dei tessuti La vascolarizzazione è indispensabile per il successo di impianti di ingegneria tessutale
APPROCCI PER UNA RAPIDA VASCOLARIZZAZIONE DI IMPIANTI FGF PDGF Impianto bioattivato da modulatori angiogenici Impianto cellulare
Impianto bioattivato da modulatori angiogenici I segnali pro-angiogenici devono essere presentati in un determinato contesto spaziotempo in una dose biologicamente attiva Tempi troppo brevi dovuti ad una concentrazione di fattore bassa non inducono angiogenesi Tempi troppo rapidi dovuti ad una concentrazione di fattore alta inducono angiogenesi precoce ma non funzionale (overdose) E fondamentale l uso di una adeguata dose e di una corretta presentazione del segnale per avere una risposta angiogenica stabile.
Il fattore di crescita può essere legato alla matrice polimerica mediante funzionalizzazione e successivo crosslink chimico Il fattore di crescita può essere incapsulato in micro-nano particelle. Tali particelle possono essere inglobate in matrici polimeriche che consentono lo studio di cinetiche di rilascio di questi fattori V V V V V V V V V V PLGA caricate con VEGF Matrice di Collagene Borselli et al., J. Biomed. Material Research A. 2010 A.H. Zisch et al., Cardiuvascular Phatology 2003
Encoding chronoprogrammed biological signals in 3D matrices Scaffold Cells Bioactive Scaffold Cells Bioactive signal Micrometric point sources of bioactive agents interspersed within 3D collagen scaffolds control spatial and temporal distribution of bioactive molecules PLGA microcarriers loaded protein broadcast specific cellular activity F. Ungaro, et al.,. J Contr Rel, 2006
Protein Microcarriers Morphological analysis: SEM and CLSM Degradation and release rate tunable Effective and tunable loading efficiency Diameter distribution Formulation Mean diameter (µm±sd) PLGA10 23.0 ± 0.9 PLGA15 22.1 ± 1.5 PLGA20 20.0 ± 1.3
Release kinetics time PLGA10 PLGA15 PLGA20 BSA-Rhod released (%) 100 80 60 40 20 Coll1.2 CollHA2.5 CollHA5.0 BSA-Rhod released (%) 100 80 60 40 20 CollHA2.5 Coll1.2 CollHA5.0 BSA-Rhod released (%) 100 80 60 40 20 Coll1.2 CollHA2.5 CollHA5.0 0 0 5 10 15 20 25 t [days] 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 t [days] 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 t [days] Protein release depend upon hydrophilic nature of the scaffold and can be modulated by microsphere formulation
VEGF-loaded microcarriers Cumulative release (ng) 60 50 40 30 20 10 0 0.6 ng/mg/day 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 Time (days)
VEGF-activated collagen scaffolds A B C * 120 intersection number 100 80 60 40 20 0 no VEGF VEGF 40ng/ml T=7g T=14g T=21g
VEGF-activated collagen scaffolds A B C D E * Borselli et al, JBMR, 2010