COME SI RIVELANO I RADICALI.

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1 ME SI RIVELAN I RADIALI. ome abbiamo visto c è un gruppo di radicali persistenti che possono essere ottenuti in alta concentrazione in soluzione, o anche come liquidi o solidi puri. Tali specie possono essere studiate per mezzo di tutte le tecniche convenzionali a disposizione del chimico, il loro spettro infrarosso ed ultravioletto può essere determinato ed è possibile effettuare esperimenti per determinare la suscettibilità magnetica che confermino la presenza di elettroni spaiati. Inoltre i loro spettri EPR possono essere rilevati e da questi possono essere ricavate numerose informazioni sulla loro struttura. La maggior parte dei radicali esiste però come intermedio transiente, che non è presente in alta concentrazione. La presenza di intermedi radicalici può spesso essere dedotta dalla natura dei prodotti di reazione o dallo studio della cinetica della reazione. Alternativamente la reazione può essere inibita con un radicale persistente che intrappola il radicale transiente. Tuttavia la conferma della presenza di intermedi radicalici attraverso metodi fisici di solito comporta che si generi un alta concentrazione di radicali per irraggiamento con una luce molto intensa, o che si prepari il radicale per trasferimento elettronico con uno ione di un metallo di transizione che sia presente in alta concentrazione. In questo modo la flash fotolisi (Flash Photolysis) ha permesso lo studio dello spettro elettronico di numerosi radicali. Altri sono stati studiati allo spettrometro EPR, che permette il rilevamento di specie paramagnetiche, usando sorgenti luminose molto intense. LA SPETTRSPIA EPR La spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR electronic spin resonance o EPR electronic paramagnetic resonance) è una tecnica che permette lo studio di radicali liberi stabili o persistenti. Essa permette inoltre lo studio delle specie radicaliche transienti che si formano nel corso di una reazione. NDIZINE DI RISNANZA E RILASSAMENT. Qui di seguito sono descritte succintamente le basi teoriche su cui è fondata questa tecnica. ome sappiamo l'elettrone è una particella subatomica, che possiede una certa massa ed una certa carica, dotata di un movimento di rotazione attorno a se stessa che viene chiamato spin (trottola). Tale spin può essere uguale a ½ o a -½ a seconda del verso in cui ruota l elettrone. A causa della sua rotazione l'elettrone genera inoltre anche un campo magnetico. Nel caso in cui l elettrone venga sottoposto ad un campo magnetico esterno l energia dei due stati di spin che in condizioni normali sono degeneri, viene modificata a causa dell interazione del campo magnetico esterno con quello generato dall elettrone. La differenza di energia che si viene a creare tra i due stati di spin è uguale a: ΔE = g E β E (1) 4-1

2 dove è il campo magnetico applicato, β E è il magnetone di Bohr 1 (9,2733 x erg/gaus) e g E è un numero adimensionale che per l elettrone libero vale 2,0023 e che per gli elettroni in atomi o in molecole (cioè non isolati) ha un valore che dipende dall intorno dell elettrone. Splitting dei livelli di spin di un elettrone in presenza di un campo magnetico. Quando l elettrone è esposto ad una radiazione elettromagnetica appropriata la cui frequenza ν soddisfa la condizione di risonanza: hν = g E β E = E α - E β (2) sono possibili transizioni tra i due livelli energetici cioè gli elettroni possono assorbire energia per passare da uno stato all altro. Allo stesso modo irradiando l elettrone con una radiazione di frequenza ν costante, e variando la forza del campo magnetico applicato si può raggiungere il valore che soddisfa la condizione di risonanza. Quando tale condizione è soddisfatta, le transizioni possono avere luogo in entrambe le direzioni dando luogo ad assorbimento (E β E α ) o ad emissione (E α E β ) di energia. i) Segnale EPR (assorbimento) ottenuto a frequenza costante e intensità del campo variabile; ii) Derivata prima del segnale di assorbimento EPR. Il fatto che il sistema nel suo complesso assorba o emetta energia verrà dunque determinato dalla direzione del maggior numero di transizioni, e poiché le due transizioni hanno la stessa probabilità di avvenire, la popolazione dei due livelli α e β ha 1 Unità fondamentale del momento di dipolo magnetico di un atomo, dato da m b = e(h/2)/2m e, dove e è la carica dell'elettrone, h è la costante di Planck, ed m e la massa dell'elettrone. Il momento di dipolo magnetico è una grandezza vettoriale che esprime quantitativamente le proprietà magnetiche di un atomo dovute al moto orbitale degli elettroni intorno al nucleo. 4-2

3 un importanza determinante. Si avrà così assorbimento solo quando la popolazione del livello più basso (n 1 ) sarà più grande di quella del livello più alto (n 2 ). La legge di distribuzione di Boltzman predice appunto un leggero eccesso di popolazione nel livello più basso, cioè (n 1 n 2 ) > 0 per cui di solito si ha un assorbimento anche se molto piccolo; per aumentare il livello di segnale registrabile, nella tecnica EPR si usa quindi registrare lo spettro di assorbimento come derivata prima. Uno spettrometro EPR consiste essenzialmente di un elettromagnete, il quale permette di variare con continuità il campo magnetico applicato, di un generatore di radiazioni elettromagnetiche che emette microonde in un campo molto ristretto di frequenze, di una cella portacampioni e di un rilevatore che permette di misurare l entità dell assorbimento subito dalla radiazione elettromagnetica. I segnali forniti dal rilevatore vengono registrati in funzione dell intensità del campo magnetico. PARAMAGNETISM DI RADIALI RGANII. Nello stato fondamentale dei composti organici stabili sia gli orbitali interni che quelli di legame sono occupati ognuno da due elettroni che differiscono solo per il valore di M s (gli elettroni si dicono accoppiati e si indicano generalmente con il simbolo ). Lo stato di un sistema è un singoletto in quanto ha molteplicità 2 * 1 ed è diamagnetico. Nel caso in cui una molecola organica abbia un orbitale occupato da un solo elettrone spaiato, allora esso si troverà in uno stato di doppietto e sarà paramagnetica dando luogo ad uno spettro EPR. Il paramagnetismo di tali molecole deriva quasi esclusivamente dallo spin dell'elettrone spaiato, cosicché i loro valori di g e (o più semplicemente g) differiscono solo di poco da quello tipico dell'elettrone libero (2,0023). Il segnale EPR ben risolto di un radicale organico può contenere anche più di cento linee ed è per questo che si parla di spettri EPR. La complessità degli spettri dipende dalla interazione dell'elettrone spaiato con i nuclei con numero quantico di spin non nullo presenti nel radicale. Analogamente al caso dell'elettrone infatti, anche i nuclei degli atomi possono possedere un momento magnetico nucleare che dipenderà dal numero di neutroni e di protoni che contengono che sarà associato al numero quantico di spin nucleare I. Il valore di I vale multipli dispari di ½ per nuclei che possiedono un numero di massa dispari: I = 1/2 per 1, 13, 19 F, 31 P; I = 3/2 per 11 B, 23 Na, 33 S, 39 K, 63 u; I = 5/2 per 55 Mn; I = 7/2 per 51 V, 133 s, etc. multipli interi di 1 per nuclei che possiedono un numero di massa pari e carica nucleare dispari: I = 1 per 2, 14 N; I = 3 per 10 B, etc; 2 La molteplicità di una molecola: Un singoletto è una molecola con un'unica funzione d'onda e che non ha elettroni spaiati. Un doppietto e un tripletto hanno funzioni d'onda che possono essere scritte in due e tre modi, rispettivamente come conseguenza della presenza di uno o due elettroni spaiati. In generale il numero di elettroni spaiati +1 corrisponde alla molteplicità della molecola. 4-3

4 mentre nuclei con numero di massa pari e carica nucleare pari sono privi di momento magnetico nucleare avendo un numero quantico di spin nullo: I = 0 per 12, 16, 32 S, etc. L interazione dell elettrone spaiato con uno o più di questi nuclei sdoppia il segnale che deriva dall elettrone. Il numero di linee che vengono ottenute dall interazione con n nuclei equivalenti sono date dall equazione: numero di linee = 2 n I + 1 dove I è il numero quantico di spin nucleare e n è il numero di nuclei equivalenti che interagiscono. In figura sono riportati i diagrammi che mostrano l'interazione tra l'elettrone spaiato con atomi aventi spin non nulli. Splitting di un segnale ESR originato dall'interazione dell'elettrone spaiato con un nucleo avente numero quantico di spin I = ½ (a sinistra o I = 1 a destra). La separazione tra le righe si chiama costante di accoppiamento ed è caratteristica di ogni nucleo in ogni composto radicalico (in pratica è un indicazione di quanto un particolare nucleo interagisca con l'elettrone spaiato). Lo spettro riportato nella parte sinistra della figura può ben rappresentare la situazione di un atomo di idrogeno: in questo caso la distanza tra le righe è di circa 500 Gauss. Lo spettro nella parte destra della figura potrebbe rappresentare invece quello di un radicale in cui l'elettrone spaiato interagisce con un unico nucleo avente spin I = 1, per esempio un atomo di azoto. osì l interazione dell elettrone con un atomo di idrogeno sdoppia in due il segnale mentre l interazione con tre atomi di idrogeno equivalenti come nel metil radicale produce uno sdoppiamento che risulta in un quartetto. 4-4

5 Per tre nuclei equivalenti aventi spin = ½ infatti lo spettro consiste di quattro righe aventi intensità relative 1:3:3:1, tutte ugualmente separate tra loro. Nel caso particolare del metile, la costante di accoppiamento è di circa 23 Gauss. La notevole differenza di accoppiamento riscontrata in e 3 è da ricercarsi nel fatto che nel metil radicale l'elettrone spaiato è localizzato sull'atomo di carbonio, cioè lontano dagli atomi di idrogeno che ottengono comunque una certa frazione dì densità di spin mediante polarizzazione indiretta. L intensità delle righe si dedurrà dallo sdoppiamento successivo delle stesse; nel caso di n idrogeni equivalenti la situazione sarà quella riportata sotto: N righe e intensità relative N atomi equ con I = 1/ Nel caso in cui gli atomi adiacenti siano atomi di azoto che hanno numero quantico di spin nucleare uguale ad 1 e quindi dividono il segnale in 3, la situazione sarebbe la seguente: N righe e intensità relative N atomi equ. con I = Tale situazione è piuttosto difficile da incontrare in quanto raramente è presente un numero così elevato di atomi di azoto equivalenti ma lo schema può aiutare a far capire il meccanismo con il quale vengono sdoppiati i segnali. Inoltre tale schema è applicabile in ogni caso in cui l atomo abbia I = 1 (ad esempio il deuterio). 4-5

6 Una situazione molto più frequente è quella in cui si abbia la contemporanea presenza di atomi di idrogeno non equivalenti o atomi diversi. In questo caso vale la formula: (2n A I A + 1) (2n B I B +1) etc. = N Totale di righe dove n A sono il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare I A, n B il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare I B, ecc. Vediamo alcuni esempi. ESEMPI 1 Lo spettro EPR del radicale anione del benzochinone risulta composto da 5 righe. Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno equivalenti ed avremo quindi: (2 * 4 * 1/2 + 1) = 5 righe. Gli atomi di idrogeno equivalenti danno cinque righe (intensità 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento di 2.35 Gauss. ESEMPI 2 Lo spettro EPR dei radicale di-tert-butil nitrossido risulta composto da 3 righe. Infatti in questo caso l elettrone sente solamente l influenza dell atomo di azoto N

7 ESEMPI 3 Lo spettro EPR dei radicale N-tert-butil-N-(2,2-dimetil-1-fenilpropil)-nitrossido risulta invece composto di 6 righe. In questo caso l elettrone sente l influenza dell atomo di azoto e dell atomo di idrogeno in α all azoto. Si avrà quindi: (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 1 * 1/2 + 1) = 6 righe. Più precisamente, l atomo di azoto dà origine a tre righe (intensità 1:1:1) con costante di accoppiamento di circa 14 Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un doppietto (intensità 1:1) con costante di accoppiamento di circa 3.2 Gauss. 3 t-bu 3 N 3 ESEMPI 4 Lo spettro EPR del radicale N-metil-N-tert-butil nitrossido risulta invece composto di 12 righe. In questo caso l elettrone sente l influenza dell atomo di azoto e dei tre atomi di idrogeno del metile attaccato all azoto. Si avrà quindi: (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1/2 + 1) = 12 righe. Più precisamente, l atomo di azoto dà origine a tre righe (intensità 1:1:1) con costante di accoppiamento di Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un quartetto (intensità 1:3:3:1) con costante di accoppiamento di Gauss. 3 3 N 3 3 ESEMPI 5 Nel caso in cui gli atomi di idrogeno del metile siano stati sostituiti con atomi di deuterio lo spettro EPR del radicale N-metil-N-tert-butil nitrossido sarà completamente differente. 4-7

8 In questo caso infatti, l elettrone sentirà comunque l influenza dell atomo di azoto e dei tre atomi di deuterio del metile attaccato all azoto che hanno però I = 1 e non ½ come l idrogeno. Si avrà quindi: (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1 + 1) = 21 righe. Più precisamente, l atomo di azoto darà comunque origine a tre righe (intensità 1:1:1) con costante di accoppiamento di Gauss, ma ognuna di esse sarà sdoppiata a sua volta in un eptetto (intensità 1:3:6:7:6:3:1) con costante di accoppiamento di 1.87 Gauss. 3 3 N D 3 3 ESEMPI 6 Lo spettro EPR dell etil radicale risulta composto da 12 righe. Infatti in tale radicale sono presenti due atomi di idrogeno equivalenti di tipo α e tre atomi di idrogeno equivalenti di tipo β. Avremo quindi: (2 * 2 * 1/2 +1) * (2 * 3 * 1/2 +1) = 12 righe. Gli atomi di idrogeno di tipo α danno tre righe (intensità 1:2:1) con costante di accoppiamento di 22.4 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza dei tre atomi di idrogeno di tipo β equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua volta in un quartetto (intensità 1:3:3:1) con costante di accoppiamento 26.9 Gauss. β 3 α 2 ESEMPI 7 Lo spettro EPR del radicale anione della naftalina risulta composto da 25 righe. 4-8

9 Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno equivalenti di tipo α e quattro atomi di idrogeno equivalenti di tipo β. Avremo quindi: (2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 4 * 1/2 +1) = 25 righe. Gli atomi di idrogeno di tipo α danno cinque righe (intensità 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento di 4,95 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza dei quattro atomi di idrogeno di tipo β equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua volta in un quintetto (intensità 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento 1,87 Gauss. α β ESEMPI 8 Lo spettro EPR del butadiene radicale anione risulta composto da 15 righe. Infatti in tale radicale sono presenti quattro atomi di idrogeno terminali equivalenti e due atomi di idrogeno centrali equivalenti. Avremo quindi: (2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 2 * 1/2 +1) = 15 righe

10 Gli atomi di idrogeno di tipo terminali danno origine ad un quintetto (intensità 1:4:6:4:1) con costante di accoppiamento di 7.5 Gauss. Inoltre, a causa della contemporanea presenza dei due atomi di idrogeno centrali equivalenti, ognuna di queste righe viene divisa a sua volta in un tripletto (intensità 1:2:1) con costante di accoppiamento 2.75 Gauss. ESEMPI 9 Lo spettro EPR del radicale 2-fenil-2-metil-indolin-3-on-nitrossido risulta invece composto di 27 righe. In questo caso l elettrone sente l influenza dell atomo di azoto e dei quattro atomi di idrogeno sull anello aromatico. Gli atomi di idrogeno in meta sono pressoché equivalenti come lo sono quelli in orto ed in para. Si avrà quindi: (2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 2 * 1/2 + 1) * (2 * 2 * 1/2 + 1)= 27 righe. Più precisamente, l atomo di azoto dà origine a tre righe (intensità 1:1:1) con costante di accoppiamento di 8.7 Gauss, ognuna delle quali viene sdoppiata a sua volta in un tripletto (intensità 1:2:1) con costante di accoppiamento di 2.8 Gauss (p e o), che viene a sua volta sdoppiato in un tripletto (intensità 1:2:1) più piccolo di 0.9 Gauss (m). m p m N Ph 3 o Riflessione: Spiegare lo spettro EPR del propenil radicale e del butenil radicale. 2 radicale propenilico 3 radicale butenilico 4-10

11 RISNANZA DI SPIN ELETTRNI IN BILGIA La spettroscopia di risonanza di spin elettronica (EPR) ha costantemente trovato applicazioni nella problematica biochimica e biomedica, come un mezzo potente e sensibile per la rivelazione di specie radicaliche. iò si applica tanto al rilevamento (e all identificazione) d intermedi radicalici in reazioni metaboliche, quanto all osservazione di specie paramagnetiche stabili presenti in natura, o al rilevamento di radicali prodotti da radiazioni esterne o, infine, all'analisi di sonde paramagnetiche introdotte in sistemi biologici specifici (spin labeling). Sebbene esista una grande potenzialità per l'osservazione diretta di specie radicaliche associate a specifici fenomeni biochimici, il paramagnetismo si manifesta naturalmente assai di rado in sistemi biologici. Tuttavia grandi vantaggi possono essere ottenuti dalla introduzione di una qualche versatile sonda contenente un centro paramagnetico. Uno "spin label" ideale è un radicale libero stabile (spesso organico) di struttura e/o reattività tali da consentirne l'introduzione in una particolare zona dei sistemi biologici e della macromolecola. Sebbene a prima vista una tale sonda possa sembrare facilmente ottenibile, in realtà non lo è. Infatti la maggior parte degli "spin-labels" usati attualmente sono radicali nitrossidi protetti la cui sintesi è stata perfezionata solo in tempi recenti. 3 3 R N 3 3 Qui di seguito è schematizzata una struttura generale di un tale nitrossido: Sebbene la tecnica dello "spin-labeling" faccia generalmente riferimento all'uso di radicali nitrossidi, si hanno anche altri esempi in cui N 2, Mn 2+, altri ioni paramagnetici di metalli di transizione, ioni di lantanidi, ed altri radicali organici di diversa matura sono stati usati come sonde per lo studio di particolari si temi. Tuttavia, a causa della loro grande versatilità, sensibilità e varietà di informazioni da essi ottenibili, i radicali nitrossidi, hanno trovato un predominante impiego nella tecnica dello Spin-Labeling. 4-11