Helicobacter pylori IgG

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1 DCM017i-1 Ed. 05/2013 Helicobacter pylori IgG per analisi di routine Determinazione immunoenzimatica qualitativa e quantitativa degli anticorpi di classe IgG anti Helicobacter pylori nel siero o plasma umano LOT IVD Vedere etichetta esterna Σ = 96 test REF DKI017 DESTINAZIONE D USO Il kit Diametra Helicobacter pylori IgG fornisce materiale per la determinazione quantitativa e qualitativa degli anticorpi di classe IgG anti Helicobacter pylori nel siero e plasma umano. Il kit Diametra Helicobacter pylori IgG è destinato al solo uso di laboratorio. 1. SIGNIFICATO CLINICO Helicobacter pylori è un batterio Gram-negativo a spirale (dimensioni di 2-6,5 µm, flagellato) che colonizza la mucosa gastrica umana. L'organismo si trova nello strato di muco e aderisce alla superficie dell'epitelio dello stomaco, ma generalmente non penetra la mucosa gastrica direttamente. Tuttavia, vi è una risposta infiammatoria secondaria nella mucosa che porta a gastrite cronica attiva. Helicobacter pylori è l'agente eziologico primario nella maggior parte dei casi di ulcera peptica. Nel 1994 l'oms ha classificato l'helicobacter pylori come un carcinoma di categoria 1. Il tasso di infezione in Europa è di circa il 30-40%, nel mondo circa il 50%. Esiste una relazione inversa tra la presenza di infezione da Helicobacter pylori e lo stato socioeconomico. Nei paesi in via di sviluppo le persone acquisiscono l'infezione in giovane età; ne consegue che in età adulta ben il 90% della popolazione potrebbe avere gastrite da Helicobacter pylori. Nei paesi occidentali sviluppati la prevalenza della gastrite da Helicobacter pylori è molto più bassa. In queste condizioni, la velocità di acquisizione è molto più lenta (circa 1% all'anno) e con l'avanzare dell'età si è più soggetti ad essere infettati con l'organismo. 2. PRINCIPIO DEL TEST Il kit ELISA Diametra Helicobacter pylori IgG è un test immunoenzimatico in fase solida (ELISA). La micropiastra (fase solida) è coattata con l'antigene ricombinante Cag A di Helicobacter pylori. Campioni diluiti di pazienti e controlli pronti all'uso sono pipettati nei pozzetti della micropiastra. Durante l'incubazione gli anticorpi specifici contro l'helicobacter pylori nei campioni positivi e nei controlli si legano agli antigeni immobilizzati. Dopo gli step di lavaggio per rimuovere i componenti non legati dei campioni e dei controlli, vengono aggiunti ai pozzetti anticorpi anti-igg umane coniugati a perossidasi di rafano. Durante una seconda incubazione questo coniugato anti-igg si lega in maniera specifica agli anticorpi IgG, dando luogo alla formazione di complessi immunologici-enzimatici. Dopo un secondo step di lavaggio per rimuovere il coniugato non legato, i complessi immunologici formati (nel caso di risultati positivi) sono evidenziati mediante incubazione con Substrato TMB e conseguente sviluppo di colore blu. Il colore blu vira al giallo dopo l'arresto della reazione enzimatica con acido sulforico. L'intensità di questo colore è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpo IgG anti Helicobacter pylori nel campione del paziente. L'assorbanza a 450 nm viene determinata con un spettrofotometro ELISA per micropiastre. 3. REAGENTI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE 3.1 Reagenti e materiali forniti nel kit 1. Calibrators (3 flaconi, 2 ml ciascuno, pronti all'uso) CAL1 REF DCE002/01707i-0 CAL2 REF DCE002/01708i-0 CAL3 REF DCE002/01709i-0 2. Controlli (2 flaconi, 2 ml ciascuno, pronti all'uso) La concentrazione del Controllo è lotto-specifica ed è indicata sul Certificato di Analisi Controllo Positivo Controllo Negativo REF DCE045/01702i-0 REF DCE045/01701i-0 3. Conjugate (1 flacone, 20 ml) Anticorpi anti IgG umane coniugati a perossidasi di rafano REF DCE002/01702i-0 4. Coated Microplate (1 microplate breakable) Micropiastra coattata con antigeni Helicobacter pylori Cag A ricombinanti REF DCE002/01703i-0 5. TMB Substrate (1 flacone, 14 ml) H 2 O 2 -TMB (evitare il contatto con la pelle) REF DCE004/01704i-0 6. Stop Solution (1 flacone, 14 ml) Acido Solforico 0,2 mol/l (evitare il contatto con la pelle) REF DCE005/01705i X Conc. Wash Solution (1 flacone, 30 ml) Soluzione tamponata a ph 7.2 REF DCE007/01707i-0 8. Sample diluent (1 flacone, 100 ml) Soluzione tamponata a ph 7.2 REF DCE053/01753i-0

2 3.2 Reattivi necessari non forniti nel kit Acqua distillata. 3.3 Materiale e strumentazione ausiliare Dispensatori automatici. Lettore per micropiastre (450 nm) Note Conservare i reattivi a 2 8 C, al riparo dalla luce. Aprire la busta del reattivo 4 (Coated Microplate) solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da utilizzare. Il kit aperto mantiene l'attività per 2 mesi se conservato come descritto sopra. 4. AVVERTENZE Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da parte di personale esperto. Non per uso interno o esterno su esseri Umani o Animali. Usare i previsti dispositivi di protezione individuale mentre si lavora con i reagenti forniti. Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP) per la manipolazione di prodotti derivati da sangue. Tutti i reattivi di origine umana usati nella preparazione dei reagenti sono stati testati e sono risultati negativi per la presenza di anticorpi anti- HIV 1&2, per HbsAg e per anticorpi anti-hcv. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i reagenti devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. Alcuni reagenti contengono piccole quantità di Proclin 300 R come conservante. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. Il TMB Substrato contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. La Stop Solution è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Evitare l esposizione del reagente TMB/H 2 O 2 a luce solare diretta, metalli o ossidanti. Non congelare la soluzione. 5. PRECAUZIONI Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza dei passaggi indicata in questo protocollo. I risultati presentati qui sono stati ottenuti usando specifici reagenti elencati in queste Istruzioni per l Uso. Tutti i reattivi devono essere conservati a temperatura controllata di 2-8 C nei loro contenitori originali. Eventuali eccezioni sono chiaramente indicate. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. Prima dell uso lasciare tutti i componenti dei kit e i campioni a temperatura ambiente (22-28 C) e mescolare accuratamente. Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi. Devono essere osservate le date di scadenza riportate sulle etichette della scatola e di tutte le fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di scadenza. Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. Un lavaggio incompleto o non accurato dei pozzetti può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. Per la riproducibilità dei risultati, è importante che il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso. Per evitare il time shifting durante la dispensazione degli reagenti, il tempo di dispensazione dei pozzetti non dovrebbe estendersi oltre i 10 minuti. Se si protrae oltre, si raccomanda di seguire lo stesso ordine di dispensazione. Se si utilizza più di una piastra, si raccomanda di ripetere la curva di calibrazione in ogni piastra. L addizione del TMB Substrato dà inizio ad una reazione cinetica, la quale termina con l addizione della Stop Solution. L addizione del TMB Substrato e della Stop Solution deve avvenire nella stessa sequenza per evitare tempi di reazione differenti. Osservare le linee guida per l esecuzione del controllo di qualità nei laboratori clinici testando controlli e/o pool di sieri. Osservare la massima precisione nella ricostituzione e dispensazione dei reagenti. Non usare campioni microbiologicamente contaminati, altamente lipemici o emolizzati. I lettori di micropiastre leggono l assorbanza verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti. 6. PROCEDIMENTO 6.1. Preparazione dei Calibratori (C 1 C 3 ) I Calibratori sono pronti all'uso ed hanno le seguenti concentrazioni: C 1 C 2 C 3 AU/mL Preparazione della soluzione di lavaggio Prima dell uso, diluire il contenuto di ogni fiala di "20X Conc. Wash Solution" con acqua distillata fino al volume di 600 ml. Per preparare volumi minori rispettare il rapporto di diluizione di 1:20. La soluzione di lavaggio diluita è stabile a 2 8 C per 30 giorni. Nella wash solution concentrata è possibile osservare la presenza di cristalli, in tal caso riscaldare brevemente a 37 C fino alla completa dissoluzione dei cristalli Preparazione del Campione I campioni devono essere siero o plasma umano. Prima dell'uso diluire i campioni 1:101 con Sample diluent (ad esempio, aggiungere 10 µl di siero a 1 ml di Sample diluent), mescolare bene, lasciare riposare per 15 minuti, mescolare nuovamente prima dell'uso. NB: Calibratori e Controlli sono pronti all'uso e non devono essere diluiti. Per ottenere il siero, raccogliere il sangue per via venosa, far coagulare e separare il siero per centrifugazione a temperatura ambiente; non

3 centrifugare prima che la coagulazione sia completata; il sangue di pazienti sottoposti a terapia anticoagulante può richiedere più tempo per la coagulazione. Per ottenere il plasma, il sangue intero deve essere raccolto in provette contenenti anti coagulante e centrifugati subito dopo la raccolta. Non usare campioni emolitici, itterici o lipemici. Conservazione: i campioni devono essere ben chiusi e possono essere conservati per un massimo di 24 ore a 2-8 C prima di essere analizzati; per periodi di conservazione più lunghi dovrebbero essere congelati a -20 C (solo una volta); i campioni decongelati devono essere miscelati bene prima della prova Procedimento Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-28 C). Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate a 2-8 C. Per evitare potenziali contaminazioni microbiche e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei flaconi originali; utilizzare puntali per pipette usa e getta nuovi per ogni Calibratore, Controllo e campione, e dispensare il coniugato con precisione sul fondo dei pozzetti. Al fine di aumentare l accuratezza dei risultati del test è necessario operare in doppio, allestendo due pozzetti per ogni punto della curva di calibrazione (C 1 -C 3 ), due per ogni Controllo, due per ogni Campione ed uno per il Bianco. Durante le incubazioni coprire la micropiastra con la sheet fornita per eviatre evaporazioni. Reagenti Calibratori Calibratori C 1 -C µl Campioni diluiti Campioni /Controllo 100 µl Controlli 100 µl Coprire i pozzetti con la sheet fornita nel kit. Incubare per 60 minuti a 37 C. Bianco Svuotare il contenuto dei pozzetti. Lavare i pozzetti 5 volte con la Wash Solution diluita (300 µl per pozzetto). Sbattere delicatamente la micropiastra su carta assorbente per eliminare le gocce residue. Nota importante: La sensibilità e la precisione di questo dosaggio sono fortemente influenzate dal corretto svolgimento della procedura di lavaggio. Conjugate 100 µl 100 µl Coprire i pozzetti con la sheet fornita nel kit. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (22-28 C). Non esporre a luce solare diretta! Svuotare il contenuto dei pozzetti. Lavare i pozzetti 5 volte con la Wash Solution diluita (300 µl per pozzetto). Sbattere delicatamente la micropiastra su carta assorbente per eliminare le gocce residue. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Coprire i pozzetti con la sheet. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (22-28 C) al buio. Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Attenzione: campioni altamente positivi possono causare precipitati scuri del cromogeno. Leggere la densità ottica a 450/620 nm entro 30 minuti dopo l'aggiunta della Stop Solution (vedi Misurazione sotto). Misurazione: Regolare il lettore di micropiastra sullo zero usando il Bianco. Se - per motivi tecnici - il lettore ELISA non può essere regolato a zero usando il Bianco, sottrarre il valore di assorbanza del bianco da tutti i valori delle altre assorbanze in modo da ottenere risultati attendibili. Misurare l'assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e inserire tutti i valori di estinzione di ogni controllo e campione dei pazienti nel piano di distribuzione ed identificazione dei risultati. È raccomandata una lettura a doppia lunghezza d'onda utilizzando i 620 nm come lunghezza di riferimento. Laddove applicabile, calcolare la media delle assorbanze di tutti i duplicati. 7. CONTROLLO DI QUALITÀ Si raccomanda di utilizzare i campioni di controllo secondo le norme statali e federali. L'uso di campioni di controllo è consigliato per assicurare il mantenimento della validità dei risultati. Utilizzare controlli sia a livello normale che patologico. Si raccomanda inoltre di utilizzare programmi di valutazione per la qualità nazionali o internazionali, al fine di assicurare l'accuratezza dei risultati. Se i risultati del test non sono in accordo con i range di accettazione dei controlli, il risultato deve essere considerato non valido. In questo caso, si prega di consultare i seguenti fattori tecnici: pipettaggio e apparecchiature di cronometraggio; fotometro, date di scadenza dei reagenti, metodi di conservazione e condizioni di incubazione, metodi di aspirazione e lavaggio. Se dopo il controllo dei suddetti fattori non è rilevabile alcun errore, contattare il proprio distributore o direttamente Diametra.

4 8. RISULTATI 8.1. Validazione del dosaggio Il dosaggio può essere considerato valido se sono soddisfatti i seguenti criteri: Absorbance value Blank lower than Negative Control lower than Positive Control between Calibrator 1 between Calibrator 2 between Calibrator 3 between Calcolo dei risultati quantitativi Al fine di ottenere risultati quantitativi in AU/mL (Unità Arbitrarie) tracciare i valori medi di assorbanza del Controllo Negativo e dei Calibratori 1, 2 e 3 su carta millimetrata in un sistema di coordinate lineare/lineare contro le rispettive concentrazioni (0, 15, 75, 150 AU/mL) e disegnare una curva di calibrazione (valori di assorbanza sulla verticale y, concentrazioni sull'asse orizzontale asse x). Leggere i risultati su questa curva di calibrazione utilizzando le medie dei valori di assorbanza di ciascun campione e controllo. Tutti i programmi per computer disponibili possono essere utilizzati per la lettura automatica ed il calcolo del risultato. Possono essere utilizzate le seguenti funzioni matematiche: "regressione lineare" o "Calcolo Point to Point della curva di calibrazione". Nota: i valori dei campioni dei pazienti ulteriormente diluiti devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione, al fine di ottenere risultati corretti Interpretazione dei risultati quantitativi Gli intervalli di valori normali per questo test ELISA devono essere stabiliti da ciascun laboratorio in base alle proprie popolazioni di pazienti nelle aree geografiche servite. I seguenti valori dovrebbero essere considerati come una linea guida: CUT-OFF Positive Gray Zone (equivocal) Negative Helicobacter pylori IgG 15 AU/mL > 18 AU/mL AU/mL < 15 AU/mL 8.4. Calcolo dei risultati qualitativi Absorbance value of Calibrator 1 (Cut-Off) = CO Example: 0.56 = CO 8.5. Interpretazione dei risultati qualitativi Positivo: valore di assorbenza (media) del paziente oltre il 20% sopra il CO ( paziente media > 1.2 * CO) Zona Grigia: valore di assorbenza (media) del paziente compreso tra CO e il 20% sopra il CO; ripetere il test 2-4 settimane più tardi con un nuovo campione del paziente (CO media paziente 1,2 * CO) Se il risultato della seconda prova è di nuovo nella zona grigia, considerare il test negativo Negativi: valore medio di assorbanza dei pazienti al di sotto di CO ( media paziente < CO) 9. PARAMETRI CARATTERISTICI 9.1. Specificità diagnostica La specificità diagnostica é la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi specifici. Per la valutazione sono stati utilizzati 81 sieri da donatori di sangue. I sieri sono stati testati con il kit Diametra Helicobacter pylori IgG in aggiunta ad un altro kit ELISA disponibile in commercio. La specificità diagnostica è del 92% Sensibilità diagnostica La sensibilità diagnostica é la probabilità del test di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi specifici. Per la valutazione sono stati utilizzati 81 sieri da donatori di sangue. I sieri sono stati testati con il kit Diametra Helicobacter pylori IgG in aggiunta ad un altro kit ELISA disponibile in commercio. La sensibilità diagnostica è > 99% Precisione La variazione inter-assay del kit Diametra ELISA è stato determinato mediante misurazioni ripetute di tre campioni di controllo in tre giorni diversi. Campione 1 Campione 2 Campione 3 media SD CV (%) n La variazione intra-assay del kit Diametra ELISA è stato determinato mediante misurazioni ripetute di tre campioni di controllo. Campione 1 Campione 2 Campione 3 media SD CV (%) n Sensibilità analitica La sensibilità analitica è stata calcolata dalla media meno due deviazioni standard di venti replicati del controllo negativo ed è AU/mL. 10. LIMITI DELLA PROCEDURA La contaminazione batterica o ripetuti cicli di congelamento-scongelamento del campione possono influenzare i valori di assorbanza. Nei pazienti immuno-compromessi e nei neonati i dati sierologici hanno un valore limitato.

5 10.1. Sostanze interferenti Emoglobina (fino a 4 mg/ml), bilirubina (fino a 0,5 mg/ml) e trigliceridi (fino a 30 mg/ml) non influenzano i risultati del saggio. 11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le leggi locali. BIBLIOGRAFIA Stolte, M. Eidt, S. (1993) Healing gastric MALT lymphomas by eradicating H.Pylori Lancet 342:568 Stolte, M. (1992) H.Pylori and gastric MALT lymphoma Lancet 339: Parsonnet, J., Friedman, G.D., Vanderstetten, D.P., Chang, y., Vogelman, J.H., Orentreich, N., Sibley, R.K. (1991) H. Pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: Warren J.R. (1983) Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis, Lancet: Marshall, B.J., Royce, H., D.I., Goodwin, C.S., Taylor, N.S., Edmonds, P., Sly, L.I., Brenner, D.J. (1982) Orginal Isolation of Campylobacter pyloridis from human gastric mucosa. Microbios Letter 25:83 Ed. 05/2013 DCM017i-1 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax info@diametra.com

6 DCM017i-1 Ed. 05/2013 Helicobacter pylori IgG for routine analysis Qualitative and quantitative immunoenzymatic determination of IgG class antibodies to Helicobacter pylori in human serum or plasma. LOT IVD See external label Σ = 96 tests REF DKI017 INTENDED USE Diametra ELISA Helicobacter pylori IgG kit provides materials for the quantitative and qualitative determination of IgG class antibodies to Helicobacter pylori in human serum and plasma. Helicobacter pylori IgG kit is intended for in vitro diagnostic use only. 1. CLINICAL SIGNIFICANCE Helicobacter pylori is a spiral Gram-negative bacterium (2-6.5 µm in size, flagellated) which colonizes the human gastric mucosa. The organism is found in the mucus layer and adheres to the surface mucus epithelium of the stomach but generally does not penetrate the gastric mucosa directly. However, there is a secondary inflammatory response in the mucosa leading to chronic active gastritis. Helicobacter pylori is the primary causative agent in most cases of peptic ulcer disease. In 1994 the WHO classified Helicobacter pylori as a category 1 carcinoma. Infection rate in Europe is about 30%-40%, worldwide about 50%. There is an inverse relationship between the presence of Helicobacter pylori infection and socioeconomicus status. In developing countries, people acquire the infection at an early age such that by young adulthood as many as 90% of the population might have Helicobacter pylori gastritis. In developed western countries the prevalence of Helicobacter pylori gastritis is much lower. Under these conditions, the rate of acquisition is much slower (roughly 1% per annum) and the older one is the more likely one to be infected with the organism. 2. PRINCIPLE OF THE METH Diametra Helicobacter pylori IgG ELISA kit is a solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Microtiter wells as a solid phase are coated with recombinant Helicobacter pylori Cag A antigen. Diluted patient specimens and ready-for-use controls are pipetted into these wells. During incubation Helicobacter pylori-specific antibodies of positive specimens and controls are bound to the immobilized antigens. After a washing step to remove unbound sample and control material horseradish peroxidase conjugated anti-human IgG antibodies are dispensed into the wells. During a second incubation this anti-igg conjugate binds specifically to IgG antibodies resulting in the formation of enzyme-linked immune complexes. After a second washing step to remove unbound conjugate the immune complexes formed (in case of positive results) are detected by incubation with TMB substrate and development of a blue color. The blue color turns into yellow by stopping the enzymatic indicator reaction with sulfuric acid. The intensity of this color is directly proportional to the amount of Helicobacter pylori-specific IgG antibody in the patient specimen. Absorbance at 450 nm is read using an ELISA microtiter plate reader. 3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION 3.1 Reagents and Materials Supplied in the Kit 1. Calibrators (3 vials, 2 ml each, ready to use) CAL1 REF DCE002/01707i-0 CAL2 REF DCE002/01708i-0 CAL3 REF DCE002/01709i-0 2. Controls (2 vial, 2 ml each, ready to use) Control concentration is Lot-specific and it is indicated on the Certificate of Analysis Positive Control Negative Control REF DCE045/01702i-0 REF DCE045/01701i-0 3. Conjugate (1 vial, 20 ml) Antibody to human IgG conjugated to horseradish peroxidase REF DCE002/01702i-0 4. Coated Microplate (1 breakable microplate) Microplate coated with recombinant Helicobacter pylori Cag A antigen REF DCE002/01703i-0 5. TMB Substrate (1 vial, 14 ml) H 2 O 2 -TMB (avoid any skin contact) REF DCE004/01704i-0 6. Stop Solution (1 vial, 14 ml) Sulphuric acid 0.2 mol/l (avoid any skin contact) REF DCE005/01705i X Conc. Wash Solution (1 vial, 30 ml) Buffer solution ph 7.2 REF DCE007/01707i-0 8. Sample diluent (1 vial, 100 ml) Buffer solution ph 7.2 REF DCE053/01753i-0

7 3.2 Reagents necessary not supplied Distilled water. 3.3 Auxiliary materials and instrumentation Automatic dispenser. Microplates reader (450 nm) Note Store all reagents at 2 8 C in the dark. Open the bag of reagent 4 (Coated Microplate) only when it is at room temperature and close it immediately after use. Opened kit retains activity for two months if stored as described above. 4. WARNINGS This kit is intended for in vitro use by professional persons only. Not for internal or external use in Humans or Animals. Use appropriate personal protective equipment while working with the reagents provided. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products. All human source material used in the preparation of the reagents has been tested and found negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and HCV. No test method however can offer complete assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious agents are absent. Therefore, the reagents should be handled in the same manner as potentially infectious material. Some reagents contain small amounts of Proclin 300 R as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa. The TMB Substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The Stop Solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Avoid the exposure of reagent TMB/H 2 O 2 to directed sunlight, metals or oxidants. Do not freeze the solution. 5. PRECAUTIONS Please adhere strictly to the sequence of pipetting steps provided in this protocol. The performance data represented here were obtained using specific reagents listed in this Instruction For Use. All reagents should be stored refrigerated at 2-8 C in their original container. Any exceptions are clearly indicated. The reagents are stable until the expiry date when stored and handled as indicated. Allow all kit components and specimens to reach room temperature (22-28 C) and mix well prior to use. Do not interchange kit components from different lots. The expiry date printed on box and vials labels must be observed. Do not use any kit component beyond their expiry date. If you use automated equipment, the user has the responsibility to make sure that the kit has been appropriately tested. The incomplete or inaccurate liquid removal from the wells could influence the assay precision and/or increase the background. It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than 10 minutes are needed, follow the same order of dispensation. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve in each plate Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction. Observe the guidelines for performing quality control in medical laboratories by assaying controls and/or pooled sera. Maximum precision is required for reconstitution and dispensation of reagents. Samples microbiologically contaminated, highly lipemeic or haemolysed should not be used in the assay. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. 6. PROCEDURE 6.1. Preparation of the Calibrators (C 1 C 3 ) The Calibrators are ready to use and have the following concentration: C 1 C 2 C 3 AU/mL Preparation of the Wash Solution Dilute the content of each vial of the "20X Conc. Wash Solution" with distilled water to a final volume of 600 ml prior to use. For smaller volumes respect the 1:20 dilution ratio. The diluted wash solution is stable for 1 month at 2 8 C. In concentrated wash solution is possible to observe the presence of crystals, in this case warm briefly at 37 C in a water bath until complete dissolution of crystals Preparation of the sample The specimens should be human serum or plasma. Prior to assaying dilute each patient specimen 1:101 with Sample diluent (for example, add 10 µl of serum to 1 ml of Sample diluent), mix well, let stand for 15 minutes, mix weel again before use. NB: Calibrators and Controls are ready for use and must not be diluted. To obtain the serum, collect blood by venipuncture, allow to clot and separate the serum by centrifugation at room temperature; do not centrifuge before complete clotting has occurred; patients receiving anticoagulant therapy may require increased clotting time. To obtain the plasma, whole blood should be collected into centrifuge tubes containing anti coagulant and centrifuged immediately after collection.

8 Do not use haemolytic, icteric or lipaemic specimens. Storage: specimens should be well capped and may be stored for up to 24 hours at 2-8 C prior to assaying; specimens held for a longer time should be frozen only once at 20 C prior to assay; thawed samples should be inverted several times prior to testing Procedure Allow all reagents to reach room temperature (22-28 C). Unused coated microwell strips should be released securely in the foil pouch containing desiccant and stored at 2-8 C. To avoid potential microbial and/or chemical contamination, unused reagents should never be transferred into the original vials; use new disposal plastic pipette tips for each Calibrator, Control and sample, and dispense conjugate without splashing accurately to the bottom of wells. As it is necessary to perform the determination in duplicate in order to improve accuracy of the test results, prepare two wells for each point of the calibration curve (C 1 -C 3 ), two for each Control, two for each sample, one for Blank. During incubation cover microtiter strips with foil to avoid evaporation Reagent Calibrators C 1 -C 3 Diluted Sample Calibrator 100 µl Sample/ Control 100 µl Controls 100 µl Blank Cover wells with foil supplied in the kit. Incubate for 60 minutes at 37 C. Briskly shake out the contents of the wells. Rinse the wells 5 times with the diluted Wash Solution (300 µl per well). Strike the wells sharply on absorbent paper to remove residual droplets. Important note: The sensitivity and precision of this assay is markedly influenced by the correct performance of the washing procedure. Conjugate 100 µl 100 µl Cover wells with foil. Incubate for 30 minutes at room temperature (22-28 C). Do not expose to direct sun light! Briskly shake out the contents of the wells. Rinse the wells 5 times with the diluted Wash Solution (300 µl per well). Strike the wells sharply on absorbent paper to remove residual droplets. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Cover wells with foil. Incubate for 15 minutes at room temperature (22-28 C) in the dark. Stop 100 µl 100 µl 100 µl Solution Note: highly positive patient samples can cause dark precipitates of the chromogen. Read the optical density at 450/620 nm within 30 minutes after adding the Stop Solution (see Measurement below). Measurement: Adjust the ELISA microplate or microstrip reader to zero using the Blank. If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the Blank in well, subtract the absorbance value of Blank well from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results. Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record the absorbance values for each control and patient sample in the distribution and identification plan. Dual wavelength reading using 620 nm as reference wavelength is recommended. Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates. 7. QUALITY CONTROL It is recommended to use control samples according to state and federal regulations. The use of control samples is advised to assure the day to day validity of results. Use controls at both normal and pathological levels. It is also recommended to make use of national or international Quality Assessment programs in order to ensure the accuracy of the results. If the results of the assay do not fit to the established acceptable ranges of control materials patient results should be considered invalid. In this case, please check the following technical areas: pipetting and timing devices; photometer, expiration dates of reagents, storage and incubation conditions, aspiration and washing methods. After checking the above mentioned items without finding any error contact your distributor or Diametra directly. 8. RESULTS 8.1. Validation of the test run The test run may be considered valid provided the following criteria are met: Absorbance value Blank lower than Negative Control lower than Positive Control between Calibrator 1 between Calibrator 2 between Calibrator 3 between

9 8.2. Calculation of quantitative results In order to obtain quantitative results in AU/mL (Arbitrary Units) plot the (mean) absorbance values of Negative Control and Calibrator 1, 2 and 3 on (linear/linear) graph paper in a system of coordinates against their corresponding concentrations (0, 15, 75, 150 AU/mL) and draw a calibration curve (absorbance values on the vertical y-axis, concentrations on the horizontal x-axis). Read results from this calibration curve employing the (mean) absorbance values of each patient specimen and control. All suitable computer programs available can be used for automated result reading and calculation. The following mathematical functions can be used: Linear regression or Point to Point calculation of the calibration curve. Note: values of additionally diluted patient samples must be multiplied by the appropriate dilution factor in order to obtain correct results Interpretation of quantitative results Normal value ranges for this ELISA should be established by each laboratory based on its own patient populations in the geographical areas serviced. The following values should be considered as a guideline: Helicobacter pylori IgG CUT-OFF Positive Grey Zone (equivocal) Negative 15 AU/mL > 18 AU/mL AU/mL < 15 AU/mL 8.4. Calculation of qualitative results Absorbance value of Calibrator 1 (Cut-Off) = CO Example: 0.56 = CO 8.5. Interpretation of qualitative results Positive: patient (mean) absorbance values more than 20% above CO (mean patient > 1.2 * CO) Grey Zone: patient (mean) absorbance values from CO to 20% above CO; repeat test 2-4 weeks later with new patient sample (CO mean patient 1.2 * CO) If the result in the second test is again in the grey zone, consider the test negative Negative: patient (mean) absorbance values below CO (mean patient < CO) 9. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS 9.1. Diagnostic Specificity The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific analyte. For the evaluation 81 unselected blood donor sera were used. These sera were tested with Diametra Helicobacter pylori IgG ELISA in addition to another commercially available IgG ELISA. The diagnostic specificity is 92% Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific analyte. For the evaluation 81 unselected blood donor sera were used. These sera were tested with Diametra Helicobacter pylori IgG ELISA in addition to another commercially available IgG ELISA. The diagnostic sensitivity is > 99% Precision The Inter-assay variation of the Diametra ELISA was determined by repeated measurements of three control samples at three different days. Sample 1 Sample 2 Sample 3 Mean SD CV (%) n The Intra-assay (within-run) variation of the Diametra ELISA was determined by repeated measurements of three control samples. Sample 1 Sample 2 Sample 3 Mean SD CV (%) n Analytical Sensitivity The analytical sensitivity was calculated from the mean minus two standard deviations of twenty (20) replicate analyses of Negative Control and was found to be 0,245 AU/mL. 10. LIMITATIONS OF USE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. In immunocompromised patients and newborns serological data only have restricted value Interfering Substances Haemoglobin (up to 4 mg/ml), Bilirubin (up to 0.5 mg/ml) and Triglyceride (up to 30 mg/ml) have no influence on the assay results. 11. WASTE MANAGEMENT Reagents must be disposed off in accordance with local regulations.

10 BIBLIOGRAPHY Stolte, M. Eidt, S. (1993) Healing gastric MALT lymphomas by eradicating H.Pylori Lancet 342:568 Stolte, M. (1992) H.Pylori and gastric MALT lymphoma Lancet 339: Parsonnet, J., Friedman, G.D., Vanderstetten, D.P., Chang, y., Vogelman, J.H., Orentreich, N., Sibley, R.K. (1991) H. Pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 325: Warren J.R. (1983) Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis, Lancet: Marshall, B.J., Royce, H., D.I., Goodwin, C.S., Taylor, N.S., Edmonds, P., Sly, L.I., Brenner, D.J. (1982) Orginal Isolation of Campylobacter pyloridis from human gastric mucosa. Microbios Letter 25:83 Ed. 05/2013 DCM017i-1 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax info@diametra.com