UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea in Genomica Funzionale e Bioinformatica Impiego di una rete neurale artificiale per la decodifica fine in tempo reale dei segnali neurali biologici all'interno di un sistema robotico ibrido biologico/elettronico. Relatore: Correlatori: Prof.ssa Rita PIZZI Dott. Giovanni CINO Tesi di Laurea di: Roberto ROSSONI Matr. n Anno Accademico 2004/2005

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3 Alla mia famiglia

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5 Indice Indice Introduzione 1 Capitolo 1. Neuroni e cellule staminali I neuroni: tra biologia ed informatica Il neurone biologico Il potenziale a riposo di membrana Il potenziale d azione ( PA ) Propagazione del potenziale d azione lungo la fibra nervosa Trasmissione a livello delle sinapsi Le cellule staminali 19 Capitolo 2. Interfacce neuroelettroniche Robotica biomorfa Esperimenti d interfaccia neuroelettronica effettuati sino al Esperimento d interfaccia neuroelettronica del Prof. Fromherz (2002/03) Interfaccia di neuroni-array di microelettrodi ( MEA ) Utilizzo di MEA per i nostri esperimenti 34 Capitolo 3. Tecniche classiche per la codifica dell informazione neurale Il problema della codifica neurale Identificazione e caratterizzazione degli eventi di spike Spike detection Spike burst detection Analisi statistiche classiche per la codifica neurale Fasi di un progetto per la codifica di spike train neurali Problematiche legate all utilizzo di tecniche classiche e algoritmi 54 Capitolo 4. Introduzione alle reti neurali artificiali Intelligenza artificiale classica, non classica e la teoria del connessionismo Architettura delle reti neurali Reti artificiali che apprendono L apprendimento Le regole per l apprendimento Applicazioni generali 80 Capitolo 5. La rete SOM e l evoluzione ad ITSOM Self Organizing Map ( SOM ) ITSOM ( Inductive Tracing Self Organizing Map ) Descrizione della rete neurale artificiale utilizzata nell esperimento 92 Capitolo 6. Esperimento per la strutturazione di un circuito ibrido biologico/elettronico Trasporto del segnale attraverso il circuito ibrido biologico/elettronico Generazione del segnale Elaborazione del segnale da parte della componente biologica, i neuroni umani Decodifica del segnale per mezzo di ITSOM Attuazione del segnale tramite robot Protocollo sperimentale 108 I

6 Indice Capitolo 7. Risultati Risultati sperimentali 113 Capitolo 8. Conclusioni Considerazioni finali Sviluppi futuri 136 Appendice -DSP_system- 138 Software per l analisi dei segnali 138 Bibliografia 148 Ringraziamenti 157 II

7 Introduzione Introduzione. La presente trattazione si colloca all interno di un più ampio progetto di ricerca condotto dal gruppo LNL ( Living Networks Lab ) presso il Dipartimento di Tecnologie dell Informazione dell Università degli Studi di Milano. LNL opera nell ambito delle neuroscienze. In particolare si trattano le applicazioni tecnologiche derivabili dall utilizzo di materiale nervoso ( es. neuroni umani o di ratto ), direttamente connesso a sistemi elettronici. Il lavoro di questa tesi è centrato nel mostrare come una rete neurale biologica sia in grado di apprendere la capacità di classificare pattern d ingresso, in un circuito elettrico ad essa interfacciato, attuando una corretta discriminazione tra le differenti tipologie possibili di input. Lo scopo generale è la strutturazione di un circuito chiuso all interno del quale può essere fatta passare dell informazione. Nel nostro caso l informazione sarà un comando di spostamento, generato per mezzo di un software, al fine di far compiere movimenti ad un robot. Può non essere d immediata comprensione l originalità dell esperimento, in quanto sono diffusi circuiti elettronici in grado di far muovere a distanza parti meccaniche robotiche ( partendo dalle automobili elettriche per bambini fino ad arrivare alla sonda spaziale Spirit ). I circuiti diffusi per il movimento di parti meccaniche a distanza sono circuiti di tipo non misto ( unicamente elettronici ), e pertanto artificiali. Completamente differente è la costituzione di circuiti ibridi ( misti ) con componenti biologiche ed elettroniche contemporaneamente. In tal caso il circuito risulta essere non totalmente artificiale poiché possiede una parte di materiale naturale. Ciò che viene trasmesso tra le varie componenti di un circuito, sotto differenti forme, si può definire informazione. Di tale informazione si conosce tutto per quanto riguarda la parte elettronica dei circuiti, mentre molto diversa è la situazione dell informazione legata al materiale biologico. 1

8 Introduzione I pattern forniti alla rete sono segnali elettrici in onda quadra. La scelta a riguardo della tipologia d onda utilizzata è stata determinata in maniera tale da ottimizzare le capacità di apprendimento della rete biologica, tenendo conto di una serie di parametri che permettono un attività dei neuroni funzionalmente simile a quella in vivo, senza comprometterne vitalità e funzionalità. Il segnale elettrico viene fornito alla rete biologica per mezzo di un interfacciamento neuroelettronico permesso da una tecnologia sviluppata nei primi anni 90: le piastre MEA ( Multi Electrode Array ). Queste piastre sono caratterizzate, sul fondo, da un array di microelettrodi sul il quale è possibile far crescere una coltura cellulare di neuroni. La coltura è costituita da cellule staminali neurali provenienti da feti naturalmente abortiti. Durante la crescita si assiste alla costruzione della rete biologica con la formazione delle classiche strutture sinaptiche e dendritiche di collegamento fra le unità cellulari. La rete di neuroni risulta essere direttamente interfacciata con l array di microelettrodi, attraverso il quale è possibile effettuare esperimenti di stimolazione e registrazione dell attività elettrica della rete biologica. Affermare che una rete biologica sia in grado di apprendere significa aver implicitamente compreso il sistema di decodifica dell informazione contenuta all interno dei segnali elettrici neurali. La tesi prende in considerazione quelli che sono i metodi tradizionali per lo studio delle caratteristiche di segnali elettrici prodotti dai neuroni, considerando le principali analisi statistiche che si effettuano per l individuazione e la caratterizzazione di spike e burst. Gli algoritmi basati su tali analisi hanno come fondamento un modello matematico semplicistico, che porta spesso a risultati con accuratezza discutibile. Il quadro della situazione si complica ulteriormente se a tali algoritmi viene richiesto di funzionare in modalità real-time come è necessario per lo svolgimento dell esperimento di robotica effettuato durante il periodo di tesi. 2

9 Introduzione Per risolvere l incapacità degli algoritmi classici, si è applicata un struttura informatica differente per l analisi dei segnali : le reti artificiali neurali ( ANN ). Le artificial neural networks costituiscono un importante strumento nel campo dell informatica avanzata, che prende a modello meccanismi biologici. Utilizzando una rete neurale artificiale con particolare architettura ( ITSOM), ampiamente descritta all interno della tesi, si è decodificato l insieme dei segnali provenienti dai neuroni biologici ed è stato possibile inviare questa decodifica come input ad un attuatore robotico. Fornendo tramite l array di microelettrodi quattro differenti segnali elettrici ( corrispondenti ai comandi per le direzioni avanti, indietro, destra, sinistra ) il robot è stato in grado di compiere movimenti nelle direzioni stabilite. L intuizione che rende interessanti i risultati ottenuti è stata l applicazione delle reti neurali, che ha significato utilizzare un mezzo informatico ispirato alle reti di neuroni per interfacciare i neuroni stessi con altre componenti elettroniche. Con le reti artificiali si vedrà come nonostante il metodo di decodifica dell informazione rimanga ignoto, sia stato possibile utilizzare segnali elettrici di natura biologica per l indirizzamento di devices elettronici. Per meglio descrivere soluzioni e problematiche a riguardo del progetto presentato, oltre ai risultati ottenuti da questo, si sono rielaborati i risultati di un esperimento precedente, il quale venne effettuato prima della taratura delle rete neurale artificiale e per mezzo di robot simulato. 3

10 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali 1.1 I neuroni: tra biologia ed informatica. Il cervello umano è costituito da neuroni, collegati fra di loro in una rete molto complessa ed articolata. Ogni neurone è costituito da un corpo centrale (soma), da un lunga fibra detta assone e da una serie di ramificazioni di varia grandezza ed estensione dette dendriti ( Nicholls et al ). Un neurone comunica con un altro attraverso dei contatti detti sinapsi ed in questo modo un singolo neurone può essere collegato fino a circa diecimila altri neuroni. Una rete di neuroni interconnessi prende il nome di rete neurale. La zona del cervello che distingue nettamente l uomo da ogni altro essere animale è la corteccia cerebrale, una lamina pieghettata, stretta contro il cranio, di spessore di circa 4.5 mm, che è deputata ai processi mentali. Un impulso elettrico viaggia di solito lungo l assone e, nel momento in cui raggiunge la sinapsi, cioè il collegamento con il dendrite o con il soma di un altro neurone, provoca la secrezione di particolari sostanze chimiche, dette neurotrasmettitori ( se ne conoscono oggi circa una trentina di tipi diversi ), che permettono all impulso di superare la sinapsi e tornare a propagarsi come impulso elettrico lungo il secondo neurone. Il neurone si comporta come un elemento logico binario: acceso (1) se la somma degli impulsi ricevuti attraverso le varie sinapsi è sufficiente per stimolare la partenza di un impulso elettrico lungo l assone e spento (0) nel caso contrario. La rete neurale opera in parallelo, cioè esegue molte operazioni contemporaneamente, a differenza dei computer tradizionali che sono sequenziali, cioè eseguono una operazione alla volta. Questa caratteristica ha 4

11 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali suggerito in campo informatico di progettare computer sempre più potenti basati sul calcolo parallelo. La memoria può essere considerata un sistema che ha il compito di conservare le informazioni che provengono dall ambiente che ci circonda, di organizzarle e di renderle recuperabili in qualsiasi momento. Ogni persona dispone di una memoria diversa che riflette le diverse esperienze che ha avuto nel corso della sua vita. Una prima fondamentale distinzione viene operata fra memoria a breve termine e memoria a lungo termine. La memoria a breve termine dura alcuni secondi o minuti, mentre quella a lungo termine può durare ore, giorni o anni. In una celebre definizione il filosofo latino Seneca paragonò la memoria a breve termine ad una scritta sulla sabbia spazzata via dalle onde e quella a lungo termine ad una scritta scavata sulla pietra. Strettamente associata alla memoria è la funzione del ricordare che significa associare qualcosa proveniente dalla nostra memoria ad un stimolo sensoriale esterno. Quando arriva uno stimolo, la rete neurale incomincia una complessa attività elettrica che la porta ad associare a quello stimolo un determinato ricordo a breve termine, che solitamente avrà una vita molto precaria. Se tuttavia entrano in attività gruppi di neuroni associati alla memoria a lungo termine, allora incominciano ad affluire tutta una serie di ricordi collegati con lo stimolo iniziale. La memoria può anche essere distinta in memoria visiva (ci si ricorda di un viso, della forma di un oggetto, ecc.), uditiva (ci si ricorda una canzone, una particolare voce, ecc.), spaziale (ci si ricorda un luogo e la strada per arrivarci, siamo in grado di orientarci, ecc.), emotiva (ci si ricorda di un certo avvenimento passato piacevole o doloroso, ecc.) e così via. Due tecniche che hanno permesso di conseguire progressi nello studio della memoria e del ricordo sono la PET (tomografia ad emissione di positroni), e la risonanza magnetica funzionale ( fmri ), che consentono di individuare la zona del cervello che entra in funzione quando ricordiamo qualcosa. Il cervello, nel momento in cui ricorda un qualsiasi evento passato, consuma 5

12 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali zucchero ed ossigeno proprio in quella particolare zona che è coinvolta nel ricordo. Il metabolismo del cervello viene quindi registrato con la tecnica del PET ed in questo modo si può ottenere una mappa abbastanza precisa della nostra memoria. Analogamente la fmri sfrutta le proprietà magnetiche dell emoglobina per individuare le zone più o meno ossigenate. Le ricerche di tipo biologico riguardanti il funzionamento del cervello partono dal presupposto che il cervello possa essere schematizzato come un sistema cognitivo auto-organizzato in grado di elaborare l informazione che riceve dall esterno. Il suo comportamento è molto complesso, perché non bisogna pensare ad una semplice legge del tipo che associa ad ogni stimolo ricevuto una ben determinata risposta, ma invece considerare che lo stimolo mette in moto nel cervello una complessa dinamica neurale che associa allo stimolo una rappresentazione particolare, fra le tante archiviate in memoria. Per esempio basta che sentiamo l inizio di una canzone per ripercorrere con la mente non solo tutto il resto del brano, ma anche tutti i ricordi piacevoli o meno che sono associati a quella canzone. Un semplice stimolo uditivo è in grado di mettere in moto un certo numero di aree distinte del cervello e di far nascere nella nostra mente un continuo flusso di ricordi. Le reti neurali sono state studiate mediante il computer per determinare i meccanismi che entrano in gioco quando ricordiamo, vediamo, sentiamo, ecc., partendo dalla constatazione che i neuroni sono elementi logici a due stati (spento o acceso, 0 o 1 come un bit). Questi elementi sono poi collegati fra di loro, ma la forza di questa connessione è ovviamente variabile. Due neuroni possono avere una forte connessione, cioè se un impulso arriva nel primo riuscirà quasi sicuramente a passare nel secondo, o viceversa una connessione molto debole. Secondo l approccio biologico la natura della mente umana è strettamente collegata alle proprietà fisico-chimiche dei neuroni e quindi la rete neurale che simula il funzionamento del cervello deve comunque tener conto del fatto che l uomo è un computer fatto di carne. 6

13 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali I fautori dell intelligenza artificiale sostengono invece che ci si può sempre ricondurre al livello di semplici interazioni fra unità logiche elementari, essendo il cervello solo un hardware particolare fra i tanti possibili, perché per un programma è assolutamente inessenziale l hardware che viene utilizzato, sia esso costituito da cellule o chip di silicio, come negli ordinari computer. 1.2 Il neurone biologico. Fig.1.1 Struttura della cellula nervosa e relativa connessione per mezzo di un bottone sinaptico ad un'altra cellula neurale. Il neurone rappresenta l unità strutturale e funzionale del sistema nervoso. Un tipico neurone possiede un corpo cellulare ( pirenoforo ), neurofibrille, 7

14 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali neurotubuli e, come la maggior parte delle cellule un nucleo, mitocondri ed altri organuli cellulari ( Albert et al ). Il neurone (fig. 1.1) è provvisto di due tipi di prolungamenti cellulari, i dendriti e gli assoni. I dendriti formano di regola numerose ramificazioni che raccolgono i segnali afferenti (di eccitazione e di inibizione ) provenienti da altri neuroni ( spesso migliaia ) e che generano attraverso la membrana cellulare del pirenoforo una somma dei segnali. L assone che si origina in corrispondenza del cono di emergenza del pirenoforo, ha il compito di trasmettere il segnale nervoso efferente ad altri neuroni o agli organi effettori ( cellule ghiandolari o muscolari ), spesso situati a notevoli distanze. Nel suo percorso spesso l assone emana dei rami collaterali che si suddividono ulteriormente in corrispondenza delle loro porzioni distali ( Martinez Martinez 1982 ). Se, a livello del cono di emergenza, la somma dei segnali supera un determinato valore soglia, allora si genera un potenziale d azione che si propaga lungo l assone fino ai bottoni sinaptici. Dall apparato del Golgi localizzato nel pirenoforo fino alle porzioni terminali dei dendriti e dell assone si verifica un trasporto assoplasmatico rapido di vescicole contenenti proteine, lipidi, zuccheri, sostanze di trasmissione ed altro. Questo trasporto anterogrado lungo i neurotubuli avviene grazie ad una proteina simile alla miosina, la chinesina, la cui attività richiede utilizzo di ATP. In senso retrogrado ( dalla periferia al pirenoforo ) vengono invece trasportati fattori di crescita nervosa ( NGF, nerve growth factor ). La membrana plasmatica del pirenoforo continua lungo l assone come assolemma e risulta circondata nel SNC da oligodendrociti e nel sistema nervoso periferico da cellule di Schwann. In alcuni neuroni le cellule di Schwann formano numerosi strati fosfolipidici concentrici intorno all assone, il cosiddetto strato mielinico che funge da isolante per i flussi ionici e risulta interroto lungo l assone ogni 1,5 mm da un cosiddetto nodo di Ranvier. Le fibre nervose mieliniche sono caratterizzate da una maggiore velocità di propagazione dell impulso rispetto alle fibre nervose amieliniche. La velocità di propagazione aumenta inoltre con il diametro della fibra nervosa ( Albert et al ). 8

15 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali La sinapsi rappresenta la zona di contatto tra l assone di una cellula nervosa e un effettore o un altro neurone (fig.1.2). Nei mammiferi in corrispondenza delle sinapsi avviene ( con poche eccezioni ) una trasmissione chimica e non elettrica. In seguito all arrivo del segnale elettrico, a livello della membrana presinaptica vengono liberate mediante esocitosi delle vescicole contenenti un neurotrasmettitore ( Nicholls et al. 1992). Questo diffonde attraverso la fessura sinaptica fino alla membrana post-sinaptica, dove genera nuovamente cambiamenti elettrici della membrana. Fig 1.2 Si evidenzia la natura chimica del segnale a livello delle sinapsi. Questo segnale, originariamente di tipo elettrico, verrà poi commutato nuovamente in segnale elettrico dopo la trasmissione di neurotrasmettitori alla membrana postsinaptica. A seconda del tipo di neurotrasmettitore e del tipo recettoriale inserito nella membrana post-sinaptica questa viene eccitata o inibita. Poichè la membrana post-sinaptica non rilascia neurotrasmettitori, a livello della sinapsi la 9

16 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali trasmissione del segnale è unidirezionale. Le sinapsi possiedono pertanto una funzione valvolare fondamentale per la trasmissione ordinata dell informazione, e rappresentano inoltre il luogo in cui la propagazione neuronale può essere modificata da parte di altri neuroni ( attivazione o inibizione ) ( Nicholls et al. 1992, Albert et al ) Il potenziale a riposo di membrana. Nelle cellule vive la membrana la membrana possiede un potenziale elettrico, E m, che nelle fibre nervose a riposo viene definito potenziale di membrana a riposo. Tale potenziale varia, a seconda del tipo cellulare, tra 50 e 100mV ( versante interno della cellula carico negativamente ). Il potenziale si genera a causa della disomogenea distribuzione degli ioni (fig.1.3) tra liquido intracellulare ( LIC ) e liquido extracellulare ( LEC ) ( Hodgkin et al ). Fig 1.3 Concentrazioni effettive tipiche e potenziali d equilibrio dei principali ioni nel muscolo scheletrico a 37 C. 10

17 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali I seguenti fenomeni sono i principali contribuenti alla formazione del potenziale di riposo: Mantenimento della distribuzione disomogenea degli ioni: grazie all attività della Na + -K + ATPase, ioni Na + vengono continuamente pompati fuori dalla cellula, mentre K + vengono trasportati all interno, cosicché nell ambiente intracellulare la concentrazioni degli ioni K+ risulta circa 35 volte più elevata, mentre quella degli ioni Na + è circa 20 volte più bassa rispetto alla concentrazione di questi ioni nell ambienta extracellulare. Come in ogni altro tipo di trasporto attivo, anche la Na + -K + ATPase, richiede energia, in questo caso ATP. In caso di carenza di energia o in seguito all inibizione della Na + -K + ATPase, il gradiente ionico sui due versanti della membrana diminuisce e il potenziale di membrana crolla. Bassa conduttanza degli ioni Na + a riposo: in condizioni di riposo, la membrana plasmatica risulta estremamente poco permeabile agli ioni Na +, cosicché la differenza di concentrazione di Na + non può essere prontamente annullata con la diffusione passiva degli ioni all interno della cellula. Elevata conduttanza per gli ioni K + : nella cellula a riposo, la membrana è discretamente permeabile agli ioni K + ( circa il 90% della conduttanza complessiva ). A causa dell elevata differenza di concentrazione, gli ioni K + diffondono per tanto dal LIC al LEC. A causa della loro carica positiva, anche lo spostamento di un ridotto numero di ioni provoca uno spostamento di cariche sui due versanti della membrana. Questo potenziale di diffusione continua fino a quasi compensare il gradiente di concentrazione che agisce da forza motrice dell efflusso di ioni K +. 11

18 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali Il potenziale d azione ( PA ). Fig 1.4 Rappresentazione schematica classica del potenziale d azione delle cellule nervose. Il potenziale d azione (fig.1.4) è il segnale ( impulso ) che si propaga attraverso le cellule neurali lungo l assone ( Adrian 1932, Hodgkin et al. 1939, Nicholls 1992 ). L eccitazione si genera quando il potenziale di membrana si allontana dal suo valore riposo per assumere valori meno negativi ( predepolarizzazione ). La causa dell eccitazione può essere l apertura, a opera di un neurotrasmettitore, di canali per i cationi situati nella membrana postsinaptica, oppure un eccitazione proveniente dall ambiente circostante. Se durante l eccitazione il potenziale di membrana si avvicina ad un determinato valore critico, il cosiddetto potenziale soglia, allora vengono attivati canali per gli ioni Na + voltaggio-dipendenti, ovvero la conduttanza agli ioni Na + aumenta e tali ioni intraprendono un flusso in entrata alla membrana. Se il potenziale soglia non viene raggiunto questa eccitazione locale non provoca alcun 12

19 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali ulteriore cambiamento. Se E m supera il potenziale soglia, si forma allora il potenziale d azione che risponde alla regola tutto-o-nulla, ovvero nel modo caratteristico per il tipo cellulare e indipendentemente dall intensità dello stimolo che lo ha generato ( Nicholls 1992 ). Inizialmente viene attivato un numero progressivamente maggiore di canali per gli ioni Na +, e accelerando la depolarizzazione la conduttanza agli ioni sodici aumenta ulteriormente. In questo modo E m crolla molto rapidamente ( fase di depolarizzazione ) e raggiunge temporaneamente persino valori positivi come mv. I canali per gli ioni Na + si inattivano molto velocemente ( 0,1 ms ), in funzione dei quali il potenziale s inverte e viene a ristabilirsi il potenziale a riposo ( fase di ripolarizzazione ). In seguito alla depolarizzazione si sono aperti numerosi canali per gli ioni K +, e la conduttanza per tale ione è aumentata ( abbastanza lentamente ) di modo da favorire la ripolarizzazione (fig. 1.5). Fig 1.5 Si riportano le differenti conduttanze ioniche per gli ioni Na + e K +. Sono illustrate le differenti velocità di variazione delle conduttanze per i due differenti ioni. 13

20 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali Essendo che spesso la conduttanza agli ioni potassici risulta ancora aumentata quando la membrana ha già raggiunto il potenziale a riposo, si può verificare un iperpolarizzazione (fig.1.6). A tale fenomeno può inoltre contribuire un maggiore attività della Na + -K + ATPase. Possono generarsi molti PA in breve tempo, dal momento che la quantità di ioni che fluiscono attraverso la membrana è molto bassa. Poco dopo l inizio di un PA, anche stimoli estremamente intensi non ne possono innescare un altro, perché nella membrana depolarizzata i canali per gli ioni Na + non possono essere attivati ( periodo refrattario ). Fig 1.6 Attività dei canali per gli ioni Na + voltaggio dipendente Propagazione del potenziale nervoso lungo la fibra nervosa. All inizio della propagazione del potenziale d azione si assiste ad un breve afflusso di ioni Na + all interno della fibra nervosa ( Nicholls 1992 ). La membrana cellulare, inizialmente carica negativamente in corrispondenza del 14

21 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali suo versante interno, adesso manifesta una carica opposta ( adesso all interno varia tra +20 e +30 mv ), cosicché si genera una differenza di carica rispetto alle porzioni adiacenti non ancora eccitate (fig. 1.7). Ciò provoca un trasferimento elettrotonico passivo di cariche dalle porzioni adiacenti, generando in tali zone una depolarizzazione. Se in questo modo viene raggiunto il potenziale di soglia, si origina un nuovo potenziale d azione, mentre quello originatosi nella porzione precedente si esaurisce. Normalmente il PA si propaga in un unica direzione, poiché la porzione di fibra nervosa eccitata in precedenza si trova in fase refrattaria. Se nonostante ciò si verifica un eccitazione in senso retrogrado ( ad es. in seguito alla stimolazione della fibra con un elettrodo ) essa termina al più tardi in corrispondenza della sinapsi più prossima ( funzione valvolare ). La progressiva generazione di potenziale d azione nella porzione di fibra di volta in volta più prossima rigenera sempre il segnale, ma richiede tempo : nelle fibre amieliniche, caratterizzate da questo tipo di conduzione, la velocità di conduzione ( θ ) risulta relativamente bassa e corrisponde a 1 m/s. Un valore molto più elevato di θ si osserva nelle fibre nervose mieliniche, ove può raggiungere i 90 m/s ( Nicholls 1992 ). Dato che a livello degli internodi queste fibre risultano isolate dall ambiente circostante dalla guaina mielinica, una depolarizzazione sufficiente per generare un PA può avvenire per distanze maggiori ( circa 1,5 mm) ovvero in corrispondenza dei nodi di Ranvier, dove la fibra è priva di mielina ma ricca di canali per gli ioni Na +. In questo senso il PA si propaga in modo saltatorio da un nodo a quello successivo. La lunghezza del salto è compensata dal fatto che la corrente di compensazione ( 1-2 na ) diminuisce all aumentare della distanza. Prima che tale corrente raggiunga un valore sottosoglia, il segnale deve pertanto essere rigenerato presso un nodo di Ranvier. 15

22 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali Fig 1.7 schematizzazione della propagazione del PA. Nelle figure 1 a e 1 b viene riportata la propagazione continua tipica delle fibre amieliniche. La figura 2 riporta la propagazione saltatoria delle fibre mieliniche Trasmissione a livello delle sinapsi. Le fibre nervose sono connesse tra loro e con cellule sensoriali ed effettori attraverso le sinapsi. Le sinapsi elettriche sono collegamenti diretti tra neuroni adiacenti che permettono il passaggio di ioni attraverso canali ( connessoni ) localizzate a livello delle giunzioni serrate( Hodgkins et al. 1939, Nicholls 1992 ). Tali sinapsi provvedono per esempio alla propagazione dell eccitazione nella muscolatura liscia, nel miocardio, nella retina e nel SNC a livello delle cellule epiteliali e tra cellula della glia. Le sinapsi chimiche provvedono alla conduzione dell informazione per mezzo di sostanze chimiche chiamate neurotrasmettitori. Tali sinapsi non servono soltanto per la semplice trasmissione del segnale, ma rappresentano anche gli elementi del sistema nervoso a livello dei quali la trasmissione dell impulso può venire indirizzata su determinati circuiti, può essere potenziata, inibita ed elaborata con altre informazioni. In corrispondenza della sinapsi chimica (fig. 1.8), il PA proveniente dall assone libera il neurotrasmettitore contenuto nelle terminazione presinaptiche ( bottoni terminali ). Tale sostanza diffonde 16

23 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali attraverso la stretta fessura sinaptica ( circa 30 nm ) e si lega a livello della membrana post-sinaptica a determinati recettori di neurone di una cellula secernente o di una cellula muscolare. A seconda del tipo di neurotrasmettitore e del tipo di recettore, la membrana può essere eccitata o inibita. La liberazione del trasmettitore avviene mediante l esocitosi regolata delle vescicole sinaptiche. Ogni vescicola contiene un determinato quantum di trasmettitore. Un certo numero di vescicole è già legato alla membrana ( zona attiva ) ed il loro contenuto può essere prontamente riversato all interno della fessura sinaptica mediante esocitosi. Fig 1.8 processo di liberazione del neurotrasmettitore a livello della sinapsi chimica. Il segnale per la liberazione del trasmettitore è rappresentato dai potenziali d azione e più è alta la loro frequenza e più è grande il numero di vescicole che libero il proprio contenuto. Un PA provoca, attraverso un aumento della frequenza d apertura dei canali per Ca 2+ voltaggi-dipendenti situati nella membrana presinaptica, un aumento della concentrazione citoplasmatica degli 17

24 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali ioni Ca 2+. Ioni Mg 2+ extracellulari impediscono tale processo. Gli ioni Ca 2+ si legano alla sinaptotagmina, innescando in tal modo l interazione della sintassina e di SNAP25, localizzati nella membrana presinaptica con la sinaptobrevina contenuta nelle vescicole sinaptiche. Ciò provoca l esocitosi delle vescicole già associate alla membrana ( circa 100 per ogni PA ). Gli ioni Ca 2+ stimolano la proteina cinasi II calcio-calmodulina-dipendente ( CAM-cinasi II ), che attiva a livello della terminazione presinaptica l enzima sinapsina ( Nicholls 1992 ). Quest ultima favorisce l avvicinamento di ulteriori vescicole nella zona attiva (fig. 1.9). Fig 1.9 illustrazione dell ancoraggio delle vescicole alla membrana presinaptica che porta all attivazione e alla liberazione del neurotrasmettitore. 18

25 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali 1.3 Le cellule staminali. Una cellula staminale (fig.1.10) viene comunemente definita come una cellula che si divide (di solito raramente) dando origine a due cellule diverse tra loro: una cellula figlia è uguale alla cellula madre ( staminale ) mentre l altra cellula figlia è diversa (progenitore) e, anche se può dividersi numerose volte, non può più farlo indefinitamente ( perdita della staminalità ) e prima o poi tutta la sua progenie differenzierà in un solo tipo ( cellula staminale unipotente ) o in diversi tipi ( cellula staminale multipotente ) di cellule differenziate. Fig.1.10 la parte A illustra la duplicazione delle staminali. Le figure B e C riportano rispettivamente la duplicazione di staminali unipotenti e multipotenti. Questa definizione è teorica poiché non disponiamo di marcatori molecolari che ci permettano di distinguere tra loro le due cellule figlie di una cellula staminale. Possiamo soltanto derivare questa definizione da saggi funzionali retrospettivi. È oggi possibile ricostituire l intero sistema ematopoietico di un topo irradiato letalmente con una singola cellula staminale. Questa procedura è facilitata dall impiego di un topo transgenico che esprime in tutte le sue cellule 19

26 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali una proteina fluorescente (GFP o green fluorescent protein), così che la cellula donatrice e tutta la sua progenie saranno facilmente identificabili perché fluorescenti. Pertanto, se una singola cellula staminale fluorescente (più un certo quantitativo di progenitori non fluorescenti necessari per mantenere l emopoiesi durante il periodo di espansione e colonizzazione midollare da parte della cellula staminale fluorescente ) viene trapiantata in un topo letalmente irradiato, il topo ricevente sopravvivrà e tutte ( o quasi ) le sue cellule del sangue saranno fluorescenti per il resto della sua vita. Inoltre, è possibile trapiantare con il midollo fluorescente del topo trapiantato un secondo topo irradiato e ripetere la procedura alcune volte. Questo dimostra che una singola cellula staminale emopoietica ha la capacità di generare tutti gli elementi figurati del sangue per tutta la vita di uno o più organismi (almeno nei roditori). Al contrario, se viene trapiantato un progenitore, questo sarà in grado di dare origine agli elementi figurati del sangue del topo ricevente per un periodo limitato di tempo (settimane o pochi mesi), trascorso il quale, tutte la progenie differenzierà in cellule mature del sangue e poi il midollo andrà in aplasia. In base alle conoscenze attuali le cellule staminali vengono divise in due gruppi principali: cellule staminali embrionali e cellule staminali adulte. Questa classificazione risulta essere imprecisa in quanto tra le cellule staminali adulte sono comprese quelle fetali, presenti negli abbozzi degli organi, quelle neonatali, isolabili dal cordone ombelicale e quelle propriamente adulte, presenti in molti (o forse tutti) gli organi del nostro organismo (Galli et al ). Le cellule staminali adulte sono presenti in molti e forse in tutti gli organi dei mammiferi, anche se il loro numero si riduce probabilmente con l età. In passato si riteneva che soltanto i tessuti soggetti a continuo ricambio (sangue ed epiteli) possedessero cellule staminali, necessarie per sostituire con nuove cellule differenziate le cellule perdute quotidianamente durante tutta la vita dell individuo. Ciò spiegava come questi tessuti fossero soggetti principalmente a patologie di tipo proliferativo (tumori). Al contrario, i tessuti 20

27 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali le cui cellule non si rinnovano (o si rinnovano con estrema lentezza) nella vita adulta (muscolo scheletrico e cardiaco, tessuto nervoso) erano ritenuti privi di cellule staminali e quindi prevalentemente soggetti a patologie di tipo degenerativo. Le cose sono cambiate con la dimostrazione, oggi incontrovertibile, che il sistema nervoso centrale e quello periferico contengono cellule staminali neurali, capaci di proliferare indefinitamente o quasi nelle opportune condizioni sperimentali e di generare i principali tipi cellulari del sistema nervoso quali neuroni e glia. Inoltre, anche il cuore, finora ritenuto incapace di rigenerazione, probabilmente contiene cellule staminali, capaci di generare nuovi cardiociti e forse anche cellule muscolari lisce ed endoteliali. Le cellule staminali embrionali sono presenti nella massa cellulare interna ( o embrioblasto ) della blastocisti, poco prima dell impianto nella mucosa uterina (fig.1.11). 21

28 Capitolo 1 Neuroni e cellule staminali Fig 1.11 Dopo la gastrulazione le cellule staminali embrionali ( multipotenti ) diventano adulte ( unipotenti ). Tra i vari tessuti in cui si riscontrano cellule staminali adulte in rosso si le cellule neurali cerebrali. Queste cellule possono essere coltivate in opportune condizioni per lunghi periodi e sono quindi in grado di generare un numero elevatissimo di cellule figlie le quali mantengono la capacità di differenziare in tutti i tessuti dell organismo e per tale motivo sono definite totipotenti. Le cellule staminali embrionali o ES ( dall inglese: embryonic stem cells ) possono essere geneticamente modificate in vitro mediante sostituzione di un gene sano con uno mutato o viceversa ( ricombinazione omologa ). Quando iniettate nella cavità (blastocele) di una blastocisti ospite, le ES colonizzano tutti i tessuti dell embrione chimerico ( così definito perché composto dalla mescolanza di due genotipi diversi ) compresa la linea germinale. In riferimento agli esperimenti condotti durante la tesi si precisa che le cellule staminali utilizzate provengono da tessuti di cervelli ottenuti da feti umani abortiti naturalmente dopo dieci settimane di gestazione. Le cellule staminali sono state prelevate dal telencefalo e dal diencefalo e differenziate con apposito protocollo in vitro ( Gritti et al ). 22

29 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche 2.1 Robotica biomorfa. Le ricerche riguardanti campi come la biologia, l informatica, l ingegneria, hanno trovato un comun denominatore. Gli scienziati che si occupano di queste discipline hanno scoperto un modo di unire gli sforzi, applicando le loro conoscenze in ambiti di ricerca comuni. Lo studio che ha unito discipline così apparentemente distanti tra loro, prende il nome di Biomorphic Robotics, un area di ricerca molto attiva negli ultimi anni. Lo scopo di questa disciplina è quello di creare delle interfacce che permettano la comunicazione tra organismi animali ed apparecchiature elettroniche. Quello della robotica biomorfa è un settore molto aperto ad applicazioni pratiche, dato che, oltre a diverse università, anche enti privati e governativi cominciano ad organizzare conferenze e workshop che riguardano queste tematiche. La NASA, per esempio, nell agosto 2000, ha organizzato Workshop on Biomorphic Robotics a Pasadena in California. Lo scopo della conferenza era sia di presentare un visione d insieme di ciò che s intende per robotica biomorfa, che di stabilire una collaborazione tra la NASA e altri istituti di ricerca, e di definire la maniera per sviluppare sistemi artificiali in grado di emulare sistemi biologici o per lo meno comunicare con essi. I maggiori sforzi di chi ricerca in questo campo, sono mirati da un lato a comprendere come avviene il meccanismo dell apprendimento e dell adattamento, cercando di formalizzarlo e riprodurlo sul calcolatore, dall altro a creare dispositivi in grado sia di interpretare correttamente i segnali elettrici generati dal cervello di un essere vivente, che di poterne inviare a sua volta, modificando il comportamento del cervello stesso. 23

30 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche 2.2 Esperimenti d interfaccia neuroelettronica effettuati sino all anno L interfaccia neurone/componente elettronica rappresenta fisicamente il punto di contatto tra due discipline che insieme porteranno a scoperte sicuramente stupefacenti. È possibile sia che il circuito elettronico diventi l accettore di un apparato biologico, sia che il corpo umano subisca un innesto elettronico; certo è che in entrambi i sensi di sviluppo l interesse medico, elettronico e commerciale è elevatissimo. I primi esperimenti significativi d interfacciamento neuroelettronico si sono svolti all inizio degli anni novanta, e sfruttavano le elevate dimensioni dei neuroni di sanguisughe per una maggiore facilità di manipolazione. In questi esperimenti l interfaccia avveniva con transistor applicati su piastre di silicio. Questi esperimenti hanno fatto da apripista nel campo della ricerca neurofisiologica ma anche per i futuri sistemi ibridi biologico/elettronici, protesi biolelettroniche, biorobotica e computazione biologica, individuando quali fossero le due strade da seguire per poter raggiungere risultati importanti. La prima riguarda il perfezionamento del contatto che avviene tra il neurone e la piastra di silicio con il transistor. Questa è una visione di tipo microscopico che punta ad accertare che le proprietà di un fragile elemento come il neurone non vengano in qualche modo modificate rispetto al reale funzionamento biologico, falsando così gli esperimenti effettuati. L altra visione mira alla costruzione di sistemi composti da una fitta rete neurale biologica a contatto con una rete elettrica artificiale non invasiva. Questa tipologia permette studi di apprendimento e memoria da parte delle reti biologiche. Da notare come in quest ultimo caso non ci si preoccupa di come avvengono i contatti tra i neuroni e il materiale elettrico artificiale, bensì s intende valutare un segnale elettrico ( in entrata o uscita ) da parte della rete biologica nel suo complesso ( Egert et al. 1988, Akin et al. 1994, Wilson et al. 24

31 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche 1994, Breckenridge et al. 1995, Bove et al. 1996, Weis et al. 1996, Borkholder et al.1997, Canepari et al. 1997, Jenkner e Fromherz 1997, Schatzthauer e Fromherz 1998, Maher et al. 1999, Jimbo e Robinson 2000 ). Nel 1999 il gruppo di ricerca cui fa capo il professor William Ditto presso l Università di Atlanta ( Georgia ), ha dato quella che può essere considerata la prima vera svolta nell interfaccia computazionale con i neuroni ( Ditto 1998 ) (fig. 2.1). Ditto riuscì a dimostrare che da una rete composta da soli due neuroni interconnessi tra loro è possibile ottenere lo svolgimento di addizioni in modo corretto. Successivamente, grazie ai risultati offerti da questo esperimento, altri gruppi di ricerca s interessarono a questa disciplina e riuscirono a simulare al computer lo svolgimento di sottrazioni, moltiplicazioni, divisioni e altre operazioni logiche da parte di una rete neurale ( Garcia et al. 2003, Potter 2001 ). Esperimenti di maggior complessità vollero testare la capacità di memorizzazione e di addestramento di una rete neurale. Vennero prelevati dei neuroni dall ippocampo di topo, sfruttando la loro capacità di formare rapidamente delle sinapsi anche su un supporto di silicio (Fromherz et al. 1993, Fromherz e Schaden 1994, Maher et al. 1999, Schatzthaeuer et al ). 25

32 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche Fig 2.1 Neuroni dell ippocampo di topo coltivati su di un chip su supporto in silicio. Stimolando la rete neurale con potenziali d azione simulati per mezzo del circuito elettrico esterno, si spera di osservare dei cambiamenti morfologici nelle reti di neuroni così coltivate, che possono indicare come i neuroni, nei cervelli viventi, modificano la disposizione sinaptica in base agli stimoli elettrici cui sono sottoposti. Questi segnali possono indurre, oltre a cambiamenti nel numero o nella grandezza delle sinapsi, anche variazioni nella crescita dendritica, nella formazione di spine dendritiche o nella interazione con le cellule gliali. Studiando i fenomeni base di come l attività elettrica influenza la morfologia neuronale, e come a sua volta questi cambiamenti influenzano le proprietà elettriche della rete stessa, si potranno avere anche preziosi parametri per lo studio delle reti neurali artificiali su computer. Questo permetterà di sviluppare 26

33 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche sistemi di apprendimento artificiali che si avvantaggiano dell adattamento intelligente presente nei sistemi biologici ( Pineda 1988 ). L elaborazione di reti neurali miste potrebbe aprire nuove strade sia nel campo dell informatica che in quello delle protesi. Già oggi esiste un orecchio (coclea) elettronico che registra i suoni, li trasmette a minuscoli elettrodi che attivano il nervo cocleare di una persona affetta da sordità: negli impianti effettuati con successo, il cervello deve rielaborare gli impulsi elettrici e interpretare lo spettro dei suoni digitalizzati attribuendo loro un significato. Ovviamente si è ancora lontani dall ottimizzazione necessaria per l applicazione su larga scala, ma si è dimostrato che reti neurali biologiche opportunamente connesse con apparecchi elettronici possono essere utilizzate per l apprendimento, dimostrando un volta per tutte come i neuroni siano dotati della capacità di associarsi in reti intelligenti e di interfacciarsi con circuiti artificiali purché questi siano in grado di recepire i loro segnali e ritrasmetterli alla rete neurale. La prima creazione di una creatura ibrida costituita da un corpo meccanico controllato dal cervello di un pesce venne messa a punto nel 2000 tramite una collaborazione tra due università statunitensi e un italiana ( Northwestern University of Chicago, Illinois University e Università degli studi di Genova ). Il robot possiede poche neuroni prelevati dalla Lampreda Marina ( Petromyzon marinus ), un vertebrato primitivo simile alle anguille. Per creare questo animale artificiale i ricercatori hanno estratto il cervello e la parte della corteccia con anestesia totale e l hanno mantenuta in una soluzione salina ossigenata e refrigerata; hanno poi isolato un gruppo di poche cellule note con il nome di cellule di Muller. Queste cellule sono responsabili dell interazione tra i segnali provenienti dai sensori e i comandi inviati alle parti meccaniche, oltre che aiutare nell orientamento della Lampreda. I neuroni tuttavia non sono stati posti all interno del corpo meccanico ma sono stati collegati ad esso per mezzo di cavi. Di fronte ad alcuni stimoli luminosi il robot ha presentato diversi comportamenti di movimento ( Reger et al ). 27

34 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche 2.3 Esperimento d interfaccia neuroelettronica del Prof. Fromherz ( 2002/03). Di particolare rilevanza è l esperimento condotto dal Professor Peter Fromherz, neuroscienziato di fama mondiale che opera presso l istituto di biochimica Max Planck di Monaco di Baviera ( Fromherz 2003 ). I risultati ottenuti danno l idea di come in pochi anni si siano fatti passi da gigante nello studio e nell implementazione, tuttavia ancora allo stato embrionale, di interfacce tra neuroni e chip di silicio. Il silicio è un materiale adatto a fungere da substrato elettronicamente conduttivo per due ragioni: 1. Attualmente è disponibile una tecnologia dei semiconduttori molto avanzata e ben stabilita che consente di fabbricare dispositivi elettronici microscopici in silicio. 2. La crescita su uno strato di biossido di silicio sopprime i processi elettrochimici che possono portare alla corrosione e al danneggiamento delle cellule. Le cellule nervose, che hanno un diametro di µm, sono circondate da una membrana elettricamente isolante. Un sottile strato, spesso circa 5 nm, separa l elettrolita intracellulare dall ambiente. La corrente elettrica attraverso la membrana è mediata da specifici canali proteici per il sodio e il potassio ( pompa sodio/potassio) con una conduttanza di circa ps. I neuroni e gli elettroliti sono conduttori di ioni, mentre il silicio è un conduttore di elettroni. Una volta soppressa la corrente di Faraday all interno dell interfaccia del biossido di silicio, l accoppiamento tra le cellule e il chip può essere raggiunto solo attraverso la polarizzazione elettrica. Tuttavia, quando una cellula nervosa cresce su di un supporto solido, non ci si deve aspettare che la membrana lipidica e il biossido di silicio formino un dielettrico coerente che possa perfettamente mediare un interazione capacitiva. Le molecole delle proteine, che si protendono dalla membrana alla cellula e che si depositano sul substrato, 28

35 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche danno vita a una pellicola elettrolitica tra la cellula ed il chip (fig.2.2): questo fenomeno disaccoppia elettricamente il chip e la cellula. Si crea allora una struttura a sandwich in cui un sottile strato conduttivo viene separato dagli ambienti conduttivi di silicio e citoplasma grazie a sottili pellicole isolanti di biossido di silicio e membrane lipidiche. Fig. 2.2 Modello di contatto cellula-semiconduttore La giunzione cellula-semiconduttore ha la natura fisica di un nucleo conduttore isolato. Le correnti elettriche e la diffusione degli ioni in questa struttura a sandwich governano la stimolazione e la registrazione dell attività neuronale sul chip. L eccitazione di una cellula nervosa, come gia detto nel capitolo precedente di questa tesi, è dovuta al potenziale d azione e consiste in una rapida apertura dei canali sodio con un concomitante flusso di corrente all interno della cellula e in una ritardata apertura dei canali per il potassio con un flusso di corrente verso l esterno. Durante un potenziale d azione, le correnti capacitive e ioniche scorrono attraverso la membrana del contatto. La corrente è spinta attraverso la resistenza del nucleo dando così origine nella giunzione ad un voltaggio extracellulare Vj(t) dipendente dal tempo. Se sufficientemente forte, questo stimolo è in grado di influenzare la membrana cellulare, in particolare può aprire i canali di ioni controllati dal voltaggio, in modo tale da ottenere 29

36 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche eventualmente un potenziale d azione. L efficienza dell accoppiamento neurone-silicio dipende dalla resistenza della giunzione e dalla corrente elettrica che attraversa la membrana cellulare collegata alla stessa giunzione, ma non solo: è importante anche capire quale debba essere la distanza che separa il chip dalla cellula e quale sia la sua resistenza elettrica. La misurazione della distanza tra chip e cellula viene fatta attraverso una procedura che viene denominata FLIC ( fluorescence interference contrast ) che si basa su alcune proprietà del silicio, tra le quali quella di riflettere la luce (fig.2.3). Fig. 2.3 Fluorescence interference contrast ( FLIC ) Sono stati fabbricati chip in silicio con piazzole microscopiche di biossido di silicio ( 2,5x 2,5 µm 2, con un altezza di circa 20 nm ) su cui sono state coltivate cellule neurali per studiare il gap che divide la cellula dal chip. Negli esperimenti condotti si è potuto notare che la distanza misurata si attesta attorno ai 109 nm. Questa grande distanza è causata dalle forze entropiche delle molecole proteiche che sono ancorate alla membrana e sono usate per isolare il chip in modo da sviluppare la crescita cellulare. Sono stati utilizzati diversi tipi di cellula e rivestimenti ed il risultato migliore è stato un distanza di 40 nm. Per quanto riguarda invece la resistenza del gap tra cellula e chip, in base ad alcune misurazioni ed anche alla teoria questa si attesta intorno ai 10Mohm. 30

37 Capitolo 2 Interfacce neuroelettroniche È molto affascinate combinare in un singolo esperimento due fondamentali campi della scienza moderna, la biologia e quella dei semiconduttori, osservando la diretta interazione degli elementi fondamentali della dinamica del cervello e dei transistor ( Bels e Fromherz 2002, Fromherz 2002 ). Un potenziale d azione si propaga attraverso la membrana cellulare e il gap che separa la cellula dal chip. Il voltaggio extracellulare Vj(t), che modula la struttura a banda del semiconduttore, nasce da una sovrapposizione di tutte le correnti, ioniche e capacitive, presenti nel contatto. La forma e l ampiezza del segnale è controllata dall accumulo e dal rilascio delle conduttanze di ioni ( nella membrana ) e dalla specifica conduttanza nella giunzione. Monitorando l attività dei neuroni nelle sanguisughe, lumache e topi, si possono osservare una certa varietà dei segnali che possono essere compattati in tre classi (fig. 2.4): 1. il voltaggio extracellulare è proporzionale alla derivata prima del potenziale d azione. Questa risposta di tipo A-type avviene quando tutte le conduttanze di ioni sono rilasciate nella giunzione e le correnti capacitive sono controllate. 2. il voltaggio extracellulare è proporzionale al potenziale d azione stesso. Questa risposta di tipo B-type è stata osservata quando una non specificata conduttanza prevale nel contatto in modo che una corrente ohmica attraverso la membrana e il gap controlli il voltaggio extracellulare. 31