La FLUORESCENZA è un processo di emissione di luce a seguito del rilassamento di uno stato elettronico eccitato generato da un assorbimento di luce.

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1 FLUORESCENZA La FLUORESCENZA è un processo di emissione di luce a seguito del rilassamento di uno stato elettronico eccitato generato da un assorbimento di luce. L assorbimento di luce da parte di una molecola, corrisponde ad un assorbimento di energia che promuove un elettrone da uno stato fondamentale ad uno stato eccitato (singoletto( eccitato). Una volta eccitata elettronicamente una molecola torna al più basso stato eccitato attraverso una serie di rilassamenti vibrazionali e rotazionali che dissipano energia senza emissione di luce ( (conversione interna).

2 Le transizioni elettroniche (Diagramma di Jablonsky) S0 è lo stato fondamentale e S1 e S2 sono gli stati elettronici eccitati, entranbi con 4 stati vibrazionali eccitati. L irradiazione di una specie molecolare ipotetica produce l eccitazione l delle popolazioni elettroniche dal livello S0 a quello eccitato S1 (o S2). Assorbimento Fluorescenza Una volta che la molecola è eccitata a S1 o S2 possono avvenire diversi processi attraverso i quali la molecola perde il suo eccesso di energia. Due dei più importanti meccanismi di questo tipo sono il rilassamento non radiativo (processi di rilassamento vibrazionali e di conversione interna) e il rilassamento attraverso fluorescenza.

3 In altre parole: una volta avvenuta l eccitazione l elettronica, l elettrone l può rilasciare l energia acquisita, o sotto forma di calore,, o attraverso processi dinamici della molecola che coinvolgono assorbimento di energia. Ma l elettrone l può anche cedere l energia l mediante processi radiativi, uno di questi fenomeni è FLUORESCENZA. la Gli elettroni coinvolti nella transizione di fluorescenza sono generalmente g elettroni π. Composti aromatici (con elettroni π delocalizzati) ) spesso sono fluorescenti.

4 Spettri di assorbimento ed emissione I fenomeni di disattivazione non radiativa dissipano l energia accumulata dallo stato eccitato. L emissione avverrà quindi ad energia più bassa (maggiore lunghezza d onda). La differenza in energia è detta Stokes shift. E = hν; h ν = c/λ Fluorescein molecule Stokes Shift is 25 nm 495 nm 520 nm Fluorescence Intensity Wavelength

5 Tutte le molecole assorbenti possono potenzialmente fluorescere,, anche se la maggior parte dei composti non lo fa perché la propria struttura prevede meccanismi non radiativi medianti i quali il rilassamento avviene ad una velocità maggiore dell emissione emissione fluorescente. Generalmente, composti contenenti anelli aromatici o strutture coniugate caratterizzati da una certa rigidità strutturale danno l emissione l di fluorescenza molecolare più intensa.

6 Processi radiativi e non-radiativi Oltre a conversione interna ed intersystem crossing,, altri processi, non radiativi, competono con la fluorescenza ( (processo processo radiativo). In soluzione questi processi impoveriscono lo stato eccitato in modo non radiativo, quindi: IL NUMERO DI FOTONI EMESSI È MINORE DEL NUMERO DI FOTONI ASSORBITI Il quantum yield (Q f, rendimento quantico, efficienza quantica) di una molecola è definito come: Q f = Numero di fotoni assorbiti/numero di fotoni emessi 0 Q f 1 L INTENSITA di Fluorescenza (proporzionale alla Qf) è proporzionale alla concentrazione del fluoroforo (in particolare a bassa concentrazione).

7 Fluorescenza: vantaggi Sensibilità Selettività Relazione semplice tra I f e concentrazione Fluorescenza: svantaggi Non si può prevedere con certezza se una molecola è fluorescente Dipendenza dalle condizioni ambientali Effetto-filtro ad alte concentrazioni Quenching: decadimento dallo stato eccitato mediante fenomeni di conversione interna o per interazione con molecole in soluzione che non porta alla emissione di radiazioni luminose. Photobleaching: se una sonda fluorescente viene esposta al lampo di una radiazione ad alta intensità può essere completamente sbiancata, facendole perdere in modo permanente la capacità di emettere fluorescenza.

8 Alcuni materiali biologici, soprattutto vegetali, come la cellulosa, colpiti da radiazione U.V. emettono naturalmente fluorescenza. Si parla di: fluorescenza primaria o autofluorescenza La maggior parte dei campioni biologici però, emette fluorescenza solo dopo marcatura con fluorocromi. In tal caso si parla di: fluorescenza secondaria o indotta

9 FLUOROFORI INTRINSECI

10 Fluorescenza intrinseca di proteine Triptofano Il più efficiente ed il più usato, A secondo del suo intorno chimico varia il suo spettro. Tirosina Può esistere come tirosinato. Può dare energy transfer con il triptofano (difficile). Fenilalanina -.

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12 La GFP: Green Fluorescent Protein

13 La famiglia della GFP GFP, CFP, YFP sono varianti di colore derivanti da mutazioni nei residui aminoacidici della GFP.

14 Molecole fluorescenti usate in biologia Tradizionali Alexa Fluor Cyanine

15 Sonde per gli ioni calcio Ca 2+ Vecchia generazione: Fura-2, Indo-1, Fluo-3 Nuova generazione: CAMELEON

16 Sonde fluorescenti per proteine Dansile (e derivati: EDANS; IAEDANS) Usato per fare il labelling proteine al gruppo amminico; Usati per FRET. covalente di ANS (1-anilino anilino-naftalen-8-sulfonato) Usato per studiare il moltenglobule state. Si lega in modo non covalente preferibilmente ai domini idrofobici delle proteine. In ambiente idrofobico è più fluorescente che in acqua.

17 MICROSCOPIA IN FLUORESCENZA: applicazioni Colocalizzazione Espressione di proteine fluorescenti (GFP, BFP, YFP, CFP,dsRFP dsrfp ) Photoconversion Funzione, distribuzione e modificazione della proteina di interesse con anticorpi marcati Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) Fluorescence Loss In Photobleaching Recovery After Photobleaching (FRAP) Quenching (FLIP) e Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopia multifotonica Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) Fluorescence

18 Fluorescent Microscope Risoluzione 200nm Arc Lamp La sorgente di luce del microscopio a fluorescenza è di solito una lampada a globo di quarzo contenente vapori di mercurio ad alta pressione, alloggiata in un portalampada che ne permette il raffreddamento. Si possono anche utilizzare lampade allo xenon o ad alogeni. Excitation Diaphragm Excitation Filter Nel microscopio a fluorescenza sono presenti due sistemi di filtri. Il filtro di eccitazione lascia passare solo le lunghezze d onda d utili per l eccitazione della fluorescenza, mentre il filtro di sbarramento (o di emissione) trattiene la radiazione non assorbita e lascia passare solo la luce dovuta alla fluorescenza. Emission Filter Objective Ocular

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20 SPETTRO DI EMISSIONE DELLA LAMPADA A MERCURIO

21 SPECCHI DICROICI Hg A: filtro di eccitazione (luce monocromatica ) B: ripartitore dicroico C: filtro di sbarramento

22 Non sempre è possibile marcare gli oggetti che vogliamo osservare (proteine o altre biomolecole), legandoli direttamente a fluorofori. Uso di molecole sonda costituite da particelle non fluorescenti che a loro volta si legano selettivamente alle molecole da osservare. Immunofluorescenza: La sonda flurescente viene legata a specifici anticorpi, che a loro volta si legano selettivamente al proprio antigene

23 La microscopia in fluorescenza non ha lo scopo di migliorare il potere di risoluzione, ma permette di localizzare,, in cellule o tessuti, molecole marcate con particolari sostanze dette fluorocromi.. Cosa si può vedere con un microscopio a fluorescenza: Blu: Rosso: Verde: DAPI legato al DNA. anticorpo fluorescente legato al centromero. Anticorpo fluorescente legato alla tubulina.

24 MICROSCOPIO A FLUORESCENZA Nuclei DAPI (365 nm) Nuclei FITC (404 nm)

25 MICROSCOPIO A FLUORESCENZA NELLA DIAGNOSTICA CLINICA Fluorescenza nucleare Fluorescenza mitocondriale Fluorescenza ribosomiale Cellule Hep-2 Tubuli renali Cellule Hep-2

26 MICROSCOPIO A FLUORESCENZA Non permette di eccitare in modo distinto due o più fluorocromi presenti contemporaneamente nel preparato Non permette di ottenere informazioni da piani discreti del preparato. L immagine L riprodotta corrisponde alla sovrapposizione degli elementi presenti lungo l intero l asse Z del campo osservato

27 Microscopia Confocale La luce di un laser viene fatta convergere dalle lenti dell'obbiettivo ettivo in un punto estremamente piccolo del campione osservato Laser Excitation Pinhole Excitation Filter Il punto di focalizzazione,, attraverso un sistema di specchi oscillanti,, viene spostato attraverso tutto il campo visivo dell'obbiettivo così da effettuare una scansione completa di tutto il piano focale. PMT Objective La luce emessa dai fluorocromi presenti nel campione viene catturata dalle lenti dell'obbiettivo e deviata da uno specchio dicroico su un fotomoltiplicatore,, che trasforma l'intensità luminosa rilevata in un segnale elettrico di intensità proporzionale. Emission Filter Emission Pinhole Tra lo specchio dicroico e il fotomoltiplicatore,, il fascio luminoso attraversa un diaframma (o pinhole), che impedisce alla luce proveniente dalle zone fuori fuoco di raggiungere il fotomoltiplicatore.

28 Nella MICROSCOPIA CONFOCALE: Solo il segnale luminoso relativo al piano di fuoco viene registrato e utilizzato nella formazione dell'immagine finale. Le caratteristiche della luce laser (estrema coerenza, alta intensit ensità e lunghezza d'onda unica) consentono di evitare fenomeni di aberrazioni e diffrazioni tipiche invece della luce prodotta da tradizionali lampade l a incandescenza. Le lenti dell'obbiettivo fanno sìs che l'intensità della luce laser sia sufficiente a eccitare i fluorocromi soltanto nel punto di massima concentrazione del raggio, corrispondente al piano di messa a fuoco dell'obbiettivo (le aree superiori ed inferiori al piano di fuoco, o, non venendo eccitate, non contribuiscono alla formazione dell'immagine, limitando la formazione di aloni e riducendo il rumore di fondo ).

29 Possibilità di scansionare sequenzialmente il campione per una ricostruzione tridimensionale

30 Ricostruzione 3D dell immagine y # z sections =#images z x L insieme dei dati ottenuti con un microscopio confocale è simile ad un libro. Un libro ha molte pagine ed ogni pagina mostra le informazioni solo se viene letta. Leggere una pagina in un libro è come fare una scansione con un microscopio confocale! Lo spessore piano Z analizzato al microscopio confocale è direttamente proporzionale all apertura del pinhole, tuttavia non è possibile ridurre quest ultima oltre certi limiti. Spessore minimo valutabile = 0,60 1,2 µm

31 Vantaggi della microscopia confocale rispetto alla microscopia convenzionale Permette di eccitare in modo specifico un dato fluorocromo Ridotta profondità di campo vista l alta intensità e coerenza della luce laser Permette di selezionare il fuoco relativo ad una sezione del preparato Migliore risoluzione e contrasto Aumentata risoluzione sui 3 assi XYZ Sezionamento ottico XY e Z (evita la preparazione di sottili sezioni e permette di effettuare una ricostruzione 3D del campione) Permette di lavorare su cellule vive (si evitano gli artefatti di fissazione e inclusione) L attuale velocità dei calcolatori infatti permette di risolvere non soltanto spazialmente ma anche temporalmente il segnale di fluorescenza. Lo stesso strumento adoperato per ottenere immagini ad alta risoluzione può essere anche utilizzato per inseguire le molecole fluorescenti.

32 SCANSIONI SEQUENZIALI LUNGO L ASSE Z

33 MICROSCOPIO CONFOCALE PINHOLE APERTO (~ MICROSCOPIO A FLUORESCENZA) PINHOLE CHIUSO (1 Airy unit)

34 COLOCALIZZAZIONE DI ANTIGENI A livello del fotomoltiplicatore viene riprodotta l immagine del campione analizzato, se ad uno stesso pixel arriva la radiazione luminosa proveniente da due diversi fluorocromi il colore registrato deriverà dalla fusione dei colori appartenenti ai fluorocromi in esame (es: rosso + verde = giallo, blu + rosso = viola ) Tuttavia affinchè la presenza di un colore da fusione rappresenti realmente la colocalizzazione spaziale di due molecole marcate da due diversi fluorocromi e non la semplice sovrapposizione di molecole dotate delle stesse coordinate X Y ma di diverse coordinate Z (sovrapposizione di più piani focali), è indispensabile che venga analizzato un singolo piano focale.

35 COLOCALIZZAZIONE APPARENTE PINHOLE APERTO: SOVRAPPOSIZIONE DI TUTTI I PIANI FOCALI PRESENTI NEL PREPARATO SCANSIONE DI UN SINGOLO PIANO FOCALE A LIVELLO EQUATORIALE (SPESSORE 0,64 µm PER FITC, VERDE SPESSORE 0,81 µm PER PI, ROSSO)

36 COLOCALIZZAZIONE DI MOLECOLE Antigene di membrana Antigene X Antigene di membrana + Antigene X

37 COLOCALIZZAZIONE DI ANTIGENI Intercalante del DNA GATA-3 IL-4

38 COLOCALIZZAZIONE DI ANTIGENI COSTRUTTO GFP CONCANAVALINA SOVRAPPOSIZIONE VARIANTE DI MEMBRANA PROTEINA CLASSICA

39 FRET: FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer OVVERO trasferimento di energia da un composto fluorescente donatore ad uno accettore fenomeno che si verifica quando due distinti cromofori accettore) ) con spettri di assorbimento/emissione (donatore ed accettore parzialmente sovrapposti, sono separati, con un corretto orientamento, da una distanza di Angstroms. I principi della tecnica furono definiti intorno agli anni 50. Solo con l introduzione l delle FP (fluorescent protein) ) e della microscopia in fluorescenza,, la tecnica ha cominciato ad assumere importanza per lo studio delle interazioni proteina-proteina e dei cambiamenti conformazionali delle proteine in vivo.

40 Il trasferimento non è legato ad una emissione di tipo radiativo da parte del donatore, non richiede collisione e non determina produzione di calore. Il TRASFERIMENTO DI ENERGIA avviene per risonanza (accoppiamento dipolo-dipolo), dipolo), purchè vi sia una sovrapposizione tra lo spettro di fluorescenza del donatore e quello di assorbimento dell accettore. Il trasferimento non è influenzato dall effetto dissipativo del solvente in quanto avviene a distanza molto ravvicinata tra i due fluorofori.

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42 Le due molecole devono essere molto vicine (<100 angstroms) ) e il loro orientamento reciproco deve essere appropriato La distanza a cui si ha il 50% di trasferimento energetico, viene definita come: DISTANZA CRITICA DI FORSTER (R 0 ). Ogni coppia di fluorofori ha il suo valore di R 0.

43 Da cosa dipende il trasferimento di energia Sovrapposizione degli spettri di emissione e di assorbimento di donatore e accettore; Distanza tra i due fluorofori rispetto alla distanza critica di Forster R 0 (1 r 10nm); Quantità di energia trasferita ed efficienza di trasferimento (correlate alla vita media dell emissione di fluorescenza del donatore e dell accettore accettore); Orientamento dei dipoli nello spazio; Indice di rifrazione del mezzo; Rendimento quantico (Q( f = n fotoni assorbiti/n fotoni emessi). Il fenomeno di trasferimento può essere evidenziato sia tramite rilevamento dell emissione emissione dell accettore accettore,, dopo aver eccitato il donatore con l opportuna l lunghezza d onda, d sia valutando il decadimento della fluorescenza del donatore in presenza e assenza dell accettore (= = EFFICIENZA DI TRASFERIMENTO).

44 LA QUANTITÀ DI ENERGIA TRASFERITA È DEFINITA COME: K T = (1/τD) [R 0 /r] 6 Quantità di energia trasferita L EFFICIENZA DI TRASFERIMENTO è DEFINITA COME: E T = 1 - (τ DA /τ D ) Efficienza di trasferimento oppure τ(d) vita media della emissione di fluorescenza del donatore τ(da) vita media della emissione di fluorescenza del donatore in presenza dell accettore E T = 1/[ 1+(r/R 0 ) 6 ] Efficienza di trasferimento È FONDAMENTALE CONOSCERE LA DISTANZA CRITICA DI FORSTER R o, OVVERO LA COPPIA DONATORE/ACCETTORE: J(λ) Sovrapposizione degli spettri di emissione e di assorbimento di donatore e accettore R 0 = 2.11 x 10-2 [κ 2 J(λ) η -4 Q D ] 1/6 Distanza critica di Forster K 2 Orientamento dei dipoli nello spazio η Indice di rifrazione del mezzo Q D rendimento quantico del donatore in assenza dell accettore

45 E T = 1/[ 1+(r/R 0 ) 6 ] Efficienza di trasferimento La distanza di Forster è la distanza a cui si ha il 50% di Efficienza di Trasferimento!

46 Donor Tryptophan IAEDANS (1) BFP Dansyl Dansyl CFP CF (3) Fluorescein Alcuni esempi Acceptor Dansyl DDPM (2) DsRFP FITC Octadecylrhodamine GFP Texas Red Tetramethylrhodamine Förster Distance (Nanometers) Cy3 GFP BODIPY FL (4) Rhodamine 6G FITC B-Phycoerythrin Cy5 Cy5 YFP BODIPY FL (4) Malachite Green Eosin Thiosemicarbazide Cy5 Cy5.5 > >8.0 (1) 5-(25 (2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid (2) N-(4N (4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) dinitrophenyl)maleimide (3) carboxyfluorescein succinimidyl ester (4) 4,4-difluoro difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceneindacene

47 La GFP: Green Fluorescence Protein La GFP è stata la prima proteina fluorescente (da Aequorea victoria) ad essere clonata (1992) La sua struttura cristallina fu risolta nel 1996: Barile β con fluoroforo al centro La struttura a barile costituisce una barriera di protezione per il fluoroforo,, che risulta stabile in svariate condizioni. Massimi di eccitazione a 395 e 470 nm (resa( quantica = 0.8) Picco di emissione a 509 nm L applicazione principale è come gene reporter in Biologia Molecolare Non richiede l aggiunta di substrati

48 La GFP: FRET e GFP Può essere espressa in un ampia varietà di cellule; La sua fluorescenza è spontanea e non ha bisogno di cofattori; Può essere fusa con proteine di interesse ; ; le proteine di fusione solitamente mantengono sia la fluorescenza della GFP che le funzioni biochimiche della proteina di interesse; Aggiungendo appropriati peptidi segnale,, le proteine di fusione possono essere direzionate verso specifici organelli; Per mutagenesi sono state prodotte forme della GFP con proprietà spettrali differenti FRET

49 IL fluoroforo della GFP proviene da una modificazione post-trascrizionale trascrizionale della proteina Condensazione di tre amminoacidi (Ser( Ser, Tyr, Gly) GFP, CFP, YFP sono varianti di colore derivanti da mutazioni nei i residui aminoacidici della GFP.

50 L uso di proteine di fusione con la GFP o le sue varianti, ha permesso di visualizzare la localizzazione cellulare simultanea di molte proteine L esistenza delle varianti di colore della GFP ha reso possibile sfruttare il fenomeno FRET per studi in vivo di interazione proteina-proteina. proteina. FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer OVVERO trasferimento di energia da un composto fluorescente donatore ad uno accettore

51 a) Variazione della distanza di due siti della stessa molecola b) Interazione tra molecole diverse (a) Intramolecular FRET can occur when both the donor and acceptor chromophores are on the same host molecule, which undergoes a transition, for example, between open and closed conformations. In each square box corresponding to CFP or YFP (shown in cyan or yellow, respectively), a diagonal line represents the chromophore. The amount of FRET transferred strongly depends on the relative orientation and distance between the donor and acceptor chromophores: the parallel orientation and the shorter distance (<100 Å) generally yield larger FRET. (b) Intermolecular FRET can occur between one molecule (protein A) fused to the donor (CFP) and another molecule (protein B) fused to the acceptor (YFP). When the two proteins bind to each other, FRET occurs. When they dissociate, FRET diminishes. Applicazioni

52 FRET imaging microscopy experiment In FRET experiments,, a single transfection (intramolecular FRET) or co-transfection (intermolecular FRET) of the constructs must first be performed.. The occurrence of FRET can be observed by exciting the sample at the donor excitation wavelengths while measuring the fluorescence intensities emitted at wavelengths peaks corresponding to of the donor versus the emission those of the acceptor. If the acceptor and donor are at a favorable distance and orientation, donor emission intensity decreases (CFP, cyan) while the acceptor emission (YFP, yellow) intensity increases.

53 FRET intramolecolare: BFP- peptide linker con sito di taglio per Fattore Xa-GFP R.D. Mitra et al., Gene (1996) BFP- peptide linker con sito di taglio per tripsina-gfp R. Heim and R.Y. Tsien, Curr Biol (1996) BFP- peptide linker con sito di taglio per caspasi 3-GFP X. Xu, et al., Nucleic Acids Res(1998) CFP- peptide linker con sito di taglio per caspasi 3-YFP K.Q. Luo,et al., Biochem Biophys Res Commun (2001) Altri lavori: studi sul trasporto del Ca 2+ ; sulla segnalazione AMPc-dipendente dipendente; ; sulla segnalazione da TKR..

54 FRET intermolecolare: Più complessa da studiare! La stechiometria fra donatore ed accettore può variare con l efficienza l di trasfezione Le proteine di fusione in vivo possono avere capacità di interazione ridotte La distanza e l orientamento l fra donatore ed accettore possono non essere favorevoli,, indipendentemente dalla capacità delle due proteine di interesse di formare un complesso NON NECESSARIAMENTE DEVONO ESSERE USATE PROTEINE DI FUSIONE CON FP.

55 Un esempio

56 Come si misura: Filtri sul detector che rivelano solo l emissione del donatore o dell accettore (non sempre sono così selettivi) Fattori determinanti Concentrazione del donatore e dell accettore Evitare photobleaching Scelta delle coppie donatore-accettore accettore (sovrapposizione degli spettri, λ di eccitazione dei due fluorofori,, tempo di vita della fluorescenza del donatore ) Sensibilità del detector e dei filtri dello strumento Legame fluoroforo-anticorpo e sua specificità Localizzazione di proteine di fusione con FP

57 Bioluminescence Resonance Energy Transfer - BRET Il primo dei due partner è fuso con la luciferasi da Renilla e il secondo con una proteina fluorescente (YFP). La luciferasi è attivata dal suo substrato naturale (celenterazina). Se le due molecole non interagiscono può essre rilevato solo il segnale emesso dalla luciferasi, mentre se c è interazione può avvenire un trasferimento di energia tra la luciferasi e la YFP portando segnale quest fluorescente all emissione di un da parte di quest ultima.. Il trasferimento di energia avviene se la luciferasi e la YFP si trovano ad una distanza minore di 100Å.

58 FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching Photobleaching: : se una sonda fluorescente viene esposta al lampo di una radiazione ad alta intensità può essere completamente sbiancata, di emettere facendole perdere in modo permanente la capacità di emettere fluorescenza. Donor photobleaching fluorescence resonance energy transfer (pbfret): un fluoroforo è sensibile al photobleaching solo quando è in uno stato eccitato se c e c e trasferimento diminuisce il fenomeno (rispetto all assenza assenza dell accettore accettore). Acceptor photobleaching: : il quenching sull emissione del donatore è valutato in presenza o meno di photobleaching sull accettore accettore.

59 Fluorescence Recovery After Photobleaching Si usa una energia intensa (laser) per eccitare ed esaurire un fluoroforo

60 Si osserva la zona buia (foto-sbiancata) nel tempo...

61 La fluorescenza ricompare nella regione sbiancata

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63 I dati mostrano la velocità di diffusione dei recettori nell area

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