05/11/15 COLTURE CELLULARI MAJOR DEVELOPMENT S IN CELL CULTURE TECHNOLOGY

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1 COLTURE CELLULARI Per colture cellulari si intende il processo mediante il quale cellule procariotiche, eucariotiche animali o vegetali sono cresciute sotto controllo. Colture microbiche - Organismi modello unicellulari: E. coli - S. cerevisiae Animali Vegetali COLTURE CELLULARI 1 COLTURE CELLULARI 2 STORIA DELLE COLTURE CELLULARI MAJOR DEVELOPMENT S IN CELL CULTURE TECHNOLOGY Roux for the first time maintained embryonic chick cells in a cell culture Cell culture was first successfully undertaken by Ross Harrison. He was considered by some as the father of cell culture Development of HeLa cell line by Gey, et al Development of defined cell culture media by Eagle Recognition of importance of mycoplasma by Coriell Demonstration of the finite lifespan of normal human cells by Hayflick and Moorhead Regulation of cell cycle and cycling reported by many Production of cartilage by tissue engineered cell culture by Aigner et al Mapping of the human genome and beyond- Era of induced pluripotent stem cells promises and challenges. First development was the use of antibiotics which inhibits the growth of contaminants. Second was the use of trypsin to remove adherent cells to subculture further from the culture vessel Third was the use of chemically defined culture medium. PREPARAZIONE DI COLTURE CELLULARI ANIMALI Coltura cellulare: gruppo omogeneo di cellule eucariotiche provenienti da tessuti animali; le colture sono mantenute in vita per tempi anche molto lunghi. Protocolli di isolamento: Fase 1: separare i diversi tipi cellulari presenti nel tessuto demolendo la matrice extracellulare e le giunzioni intercellulari che le mantengono unite. Il tessuto viene incubato con enzimi proteolitici (tripsina e/o collagenasi) dissociando le singole cellule meccanicamente. COLTURE CELLULARI 5 Fase 2: separazione dei vari tipi cellulari da una sospensione cellulare mista. Si può procedere in vari modi: a. Separando le cellule in base alle loro dimensioni o al loro peso, centrifugandole con l ausilio di sostanze (es. Percoll, Ficoll o Lymphoprep) che possono anche essere stratificate in gradienti a diversa densità; b. Sfruttando la diversa attitudine dei diversi tipi cellulari ad aderire su superfici di vetro o di plastica; c. Marcando le cellule con anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti, e poi separando le cellule marcate da quelle non marcate; d. Utilizzando terreni di coltura selettivi che favoriscano la crescita solo di alcuni tipi cellulari. COLTURE CELLULARI COLTURE CELLULARI 6 1

2 SEPARAZIONE CELLULARE CON ANTICORPI La sospensione cellulare omogenea ottenuta è messa in coltura, cioè viene trasferita in contenitori appositi (FIASCHE) contenenti miscele di sostanze inorganiche ed organiche necessarie al sostentamento delle cellule. Le cellule crescono adese o in sospensione. Le cellule che aderiscono al supporto su cui sono state seminate (cioè sulla parete della fiasca) crescono formando monostrati (se sono sane, in quanto risentono dell inibizione da contatto) o pluristrati (se sono tumorali e quindi non risentono dell inibizione da contatto). Le cellule che non crescono adese alla parete della fiasca, ma sospese nel terreno di coltura senza aderire ad alcun supporto sono Cellule in sospensione. COLTURE CELLULARI 7 COLTURE CELLULARI 8 TIPI DI COLTURE CELLULARI COLTURA PRIMARIA: coltura preparata a partire dai tessuti di un organismo eucariote. COLTURA SECONDARIA: coltura propagata a partire dalle colture primarie; CLONE: popolazione proveniente da un unica cellula progenitrice. COLTURE CELLULARI 9 TERRENI DI COLTURA Di cosa hanno bisogno le cellule per crescere? Il terreno di coltura viene scelto in base alle caratteristiche e alle esigenze del tipo cellulare utilizzato. Può essere liquido (pronto all uso) oppure in polvere. In ogni caso il terreno di coltura deve avere le seguenti caratteristiche: valori di ph (7.4) e osmolarità (300mOsm/l); non tossico; contenere tutti i composti necessari al metabolismo cellulare, e precisamente: 1. Ioni, per mantenere il bilancio osmotico; 2. Zuccheri, come fonte di energia; 3. Amminoacidi, per la formazione di proteine; 4. Vitamine, cofattori enzimatici. Il terreno di coltura può contenere anche Rosso Fenolo, quale indicatore di ph. Prima dell uso al terreno di coltura vengono aggiunti una miscela di antibiotici (di solito penicillina/streptomicina). COLTURE CELLULARI 10 MATERIALI E SOSTANZE UTILIZZATE SUPPLEMENTS MEM (Minimum Essential Medium): è il terreno di coltura; FBS (Siero Fetale Bovino): contiene numerosi fattori di crescita utili per la crescita delle cellule. PBS (Tampone fosfato salino): un tampone fosfato a ph 7.4 e isotonico. Serve per lavare le cellule allontanando residui di terreno di coltura che contiene inibitori della tripsina. TRIPSINA: enzima proteolitico che rompe i legami peptidici delle proteine extracellulari che costituiscono il substrato su cui le cellule sono ancorate : la temperatura ottimale per il suo funzionamento è 37 C. FIASCHE: sono i contenitori in cui le cellule proliferano. Internamente sono sterili; possono avere un tappo ventilato, cioè con un filtro che permette gli scambi gassosi e contemporaneamente garantisce la sterilità della coltura. L-glutamine Essential amino acid (not synthesised by the cell) Energy source (citric acid cycle), used in protein synthesis Unstable in liquid media - added as a supplement Non-essential amino acids (NEAA) Usually added to basic media compositions Energy source, used in protein synthesis May reduce metabolic burden on cells Antibiotics and Antimycotics Penicillin, streptomycin, gentamicin, amphotericin B Reduce the risk of bacterial and fungal contamination Cells can become antibiotic resistant changing phenotype Preferably avoided in long term culture COLTURE CELLULARI 11 2

3 HOW DO WE CULTURE CELLS IN THE LABORATORY? PASSAGING CELLS Revive frozen cell population Isolate from tissue Maintain in culture (aseptic technique) Sub-culture (passaging) Cryopreservation Count cells Containment level 2 cell culture laboratory Typical cell culture flask Check confluency of cells Remove spent medium Wash with PBS Incubate with trypsin/edta Resuspend in serum containing media Why passage cells? To maintain cells in culture (i.e. don t overgrow) To increase cell number for experiments/storage How? 70-80% confluency Wash in PBS to remove dead cells and serum Trypsin digests protein-surface interaction to release cells (collagenase also useful) EDTA enhances trypsin activity Resuspend in serum (inactivates trypsin) Transfer dilute cell suspension to new flask (fresh media) Most cell lines will adhere in approx. 3-4 hours Transfer to culture flask 70-80% confluence 100% confluence HAYFLICK S PHENOMENON PREPARAZIONE DI COLTURE CELLULARI Cells will continue to grow and divide normally for a limited number of passages When they get to a certain point even if they are given the appropriate nutrients, they simply stop dividing and will eventually die. Cell Number Passage Number Tutto ciò che deve essere utilizzato a diretto contatto con le cellule (vetreria, terreni di coltura, materiale monouso.) deve essere STERILE, cioè privo di qualsiasi forma microbica che potrebbe inquinare le colture durante le fasi di lavoro. STERILIZZAZIONE Per sterilizzazione si intende il risultato finale di procedimenti fisici e/ o chimici che, attraverso metodologie standardizzate, ripetibili e documentabili, hanno come obiettivo la distruzione di ogni microrganismo vivente, sia esso patogeno e non, in fase vegetativa o di spora. Il concetto di sterilità in assoluto non esiste, in quanto non è possibile eliminare tutti i microrganismi: il livello di sicurezza di sterilità deve corrispondere alla probabilità inferiore ad 1/1 milione di trovare un microrganismo sopravvivente all'interno di un lotto di sterilizzazione. COLTURE CELLULARI 16 IL PROBLEMA DELLA STERILITA : CABINA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE Un problema che ha reso difficili i tentativi pionieristici di mantenimento di colture e complica la vita quotidiana dei biologi cellulari è la sterilità: i terreni di coltura ed il siero sono infatti molto appetibili per batteri, lieviti e funghi che possono facilmente inquinare le colture cellulari. Questo problema viene affrontato a vari livelli: 1.Tutte le manipolazioni delle colture cellulari vengono effettuate in CAPPE A FLUSSO LAMINARE provviste di filtri, che limitano la contaminazione occasionale con microrganismi trasportati dall aria. 2. Tutti i materiali utilizzati per la manipolazione (pipette, piastre da coltura) sono sterili e di norma monouso. 3. Ai terreni di coltura vengono spesso aggiunti antibiotici per limitare la possibilità di inquinamento da parte dei più comuni batteri. COLTURE CELLULARI 17 COLTURE CELLULARI 18 3

4 SISTEMI DI STERILIZZAZIONE LE CABINE DI QUESTO TIPO SONO NATE CON L AVVENTO DELLE COLTURE CELLULARI NELL INTENTO DI PROTEGGERE, OLTRE ALL AMBIENTE E ALL OPERATORE, ANCHE IL PRODOTTO, E SFRUTTANO I FILTRI HEPA ED IL PRINCIPIO DEL FLUSSO LAMINARE VERTICALE D ARIA. FILTRI: si utilizzano per sterilizzare i terreni, i tamponi o altre sostanza allo stato liquido. Si tratta di membrane di cellulosa o altre sostanze (nylon, nitrocellulosa, polisulfone, policarbonato; la scelta del tipo di filtro dipende dalla sostanza che dobbiamo filtrare) che differiscono per la porosità,di solito i pori sono da 0,2 µm che permettono di filtrare i possibili contaminanti presenti nella soluzione. I FILTRI HEPA (HIGH-EFFICIENCY PARTICULATE AIR) SONO IN GRADO DI TRATTENERE IL % DI PARTICELLE DI 0.3 µm. ORA SONO ANCHE DISPONIBILI IN COMMERCIO FILTRI PIU EFFICIENTI DETTI ULPA (ULTRA-LOW PARTICULATE AIR), IN GRADO DI TRATTENERE IL % DI PARTICELLE DI 0.12µm. I FILTRI HEPA SONO COSTITUITI DA FOGLI DI FIBRE DI VETRO IDROREPELLENTI AVENTI DIAMETRO MEDIO DI 0.1 µm. COLTURE CELLULARI 19 COLTURE CELLULARI 20 SISTEMI DI STERILIZZAZIONE MEZZI CHIMICI: si usano sostanze dal conosciuto potere germicida, diluite alle concentrazioni opportune. Le sostanze più usate sono l ipoclorito di sodio (concentrazione d uso 2%), lo Zefirol ([c] d uso dall 1% al 5%) e l etanolo ([c] d uso 70%). Si utilizzano per la pulizia degli strumenti, della cappa, dell incubatore, delle mani dell operatore e di tutto ciò che non può essere sterilizzato con altri mezzi. MEZZI FISICI: sono due, le radiazioni ed il calore. L uso dei raggi ultravioletti (non ionizzanti) è possibile grazie all esistenza di particolari lampade (lampade UV) nella cappa sterile e/o nell ambiente in cui è posta la cappa. Tali lampade vanno tenute accese minimo due ore, preferibilmente tutta la notte. I Raggi gamma (ionizzanti) hanno un elevato potere penetrante e vengono utilizzate per sterilizzare materiale monouso per colture cellulari (pipette, fiasche, Petri ) vendute in confezioni monouso che ne preservano la sterilita. La sterilizzazione con il calore è utilizzata per la vetreria e per strumenti di metallo e plastica; si distingue sterilizzazione a secco (in stufe che raggiungono dai 180 C ai 300 C) per la strumentazione in vetro che non ha pezzi di plastica (che non resisterebbero a tali temperature) e sterilizzazione in autoclave (che sterilizza con vapore acqueo a 120 C) dove si possono mettere a sterilizzare strumenti di plastica o bottiglie (compreso il tappo). Con questo metodo e possibile sterilizzare tamponi salini (PBS) che non contengono proteine, ormoni o vitamine che sono termolabili COLTURE CELLULARI 21 COLTURE CELLULARI 22 LAMPADA UV NELLA CAPPA A FLUSSO LAMINARE AUTOCLAVE STERILIZZAZIONE A SECCO COLTURE CELLULARI 23 COLTURE CELLULARI 24 4

5 EFFETTI DELLE CONTAMINAZIONI Competono per i nutrienti La degradazione di arginina e purine inibisce la sintesi degli istoni e degli aicdi nucleici Produzione di ROS tossici per le cellule INDICATORI DELLE CONTAMINAZIONI In general indicators of contamination are turbid culture media, change in growth rates, abnormally high ph, poor attachment, multi-nucleated cells, graining cellular appearance, vacuolization, inclusion bodies and cell lysis Yeast, bacteria & fungi usually shows visible effect on the culture (changes in medium turbidity or ph) Mycoplasma detected by direct DNA staining with intercalating fluorescent substances e.g. Hoechst Mycoplasma also detected by enzyme immunoassay by specific antisera or monoclonal abs or by PCR amplification of mycoplasmal RNA The best and the oldest way to eliminate contamination is to discard the infected cell lines directly CONTAMINANTI BIOLOGICI INCUBATORE Lieviti L incubatore a CO 2 è costituito da una camera chiusa al cui interno sono ricreate, nei limiti del possibile, le condizioni fisiologiche dei tessuti animali in cui le cellule vivevano prima dell isolamento. I parametri che vanno tenuti sotto controllo sono: Funghi Virus Micoplasmi (batteri) TEMPERATURA: il controllo della temperatura (che deve essere mantenuta costante a 37 C) viene assicurato da un termostato che agisce su una resistenza; un sistema di ventole per la circolazione forzata dell aria garantisce che la temperatura sia uniforme in tutti i punti della camera. CONCENTRAZIONE DI CO 2 : il livello di anidride carbonica può variare dallo 0,03% al 40%; per esperimenti in normossia, l aria atmosferica è miscelata con il 5% di CO 2. ph: deve essere di 7,4; dipende dal riequilibrio tra lo ione bicarbonato contenuto nel terreno di coltura e la CO 2. COLTURE CELLULARI 27 COLTURE CELLULARI 28 UMIDITÀ: l ambiente deve essere saturo per evitare evaporazione di acqua dal terreno di coltura; allo scopo nell incubatore è presente un vassoio di umidificazione contenente acqua. CONTA CELLULARE USANDO L EMOCITOMETRO DI BURKER COLTURE CELLULARI 29 COLTURE CELLULARI 30 5

6 CELL COUNTING Automated Cell Counter COLTURE CELLULARI 31 COLTURE CELLULARI 32 HeLa CELLS Who was Henrietta Lacks? She was a black tobacco farmer from southern Virginia who got cervical cancer when she was 30. Why are her cells so important? Henrietta s cells were the first immortal human cells ever grown in culture. They were essential to developing the polio vaccine. They went up in the first space missions to see what would happen to cells in zero gravity. Many scientific landmarks since then have used her cells, including cloning, gene mapping and in vitro fertilization. COLTURE CELLULARI 33 COLTURE CELLULARI 34 Epatociti The image cannot be displayed. mioblasti Your computer may not have enough memory to open the image, or the image may have been corrupted. Restart your computer, and then open the file again. If the red x still appears, you may have to delete the image and then insert it again. Ingrandimento 10x20: 200x Cellule neuronali European Collection of Cell Cultures (ECACC) The image cannot be displayed. Your computer may not have enough memory to open the image, or the image may have been corrupted. Restart your computer, and then open the file again. If the red x still appears, you may have to delete the image and then insert it again. Cosa osservo al microscopio ottico: Mitocondri e cloroplasti (1µm) dovrebbero essere visibili ma tutti i componenti cellulari assorbono luce allo stesso modo quindi non sono sempre distinguibili Fase finale della preparazione di un campione per microscopia ottica: COLORAZIONE COLTURE CELLULARI 35 COLTURE CELLULARI 36 6

7 Colorazione di acidi grassi in cellule epatiche Control 1 µm PAA treated cells Excitation Emission (nm): COLTURE CELLULARI 37 MitoTracker Red CMXRos GFP IN FUSIONE CON UNA PROTEINA MITOCONDRIALE GFP espressa nella medusa Aequorea victoria COLTURE CELLULARI 39 COLTURE CELLULARI 40 DAPI is excited with UV light. When bound to doublestranded DNA its absorption maximum is at 358 nm and its emission maximum is at 461 nm COLTURE CELLULARI METODI ALTERNATIVI COLTURE CELLULARI 41 COLTURE CELLULARI 42 7

8 EU DIRECTIVE 86/609/EEC COLTURE CELLULARI 43 COLTURE CELLULARI 44 VANTAGGI NELL USO DELLE COLTURE CELLULARI LIMITI NELL USO DELLE COLTURE CELLULARI Sistemi semplificati rispetto all organismo in toto Altamente riproducibili Costituite da unità viventi organizzate Consentono di effettuare studi in tossicologia Calo dei costi rispetto alla sperimentazione in vivo Allestimento di molte repliche sperimentali Ottenibili in tempo brevi Ottenibili con l utilizzo di quantità ridotte di xenobiotici Utilizzo di metodiche semplici Riduzione del sacrificio di animali ( Rowan, 1984) Sistemi più semplici rispetto all organismo in toto Le vie di somministrazione degli xenobiotici sono diverse da quelle usate in vivo Le condizioni di coltura possono interferire con le sostanze testate Effetti mediati (ormoni, SNC) difficilmente indagabili Nel tempo possono modificare il loro genoma (fenotipo) COLTURE CELLULARI 45 COLTURE CELLULARI 46 PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLE COLTURE CELLULARI IN TOSSICOLOGIA Test rapidi di sostanze potenzialmente tossiche, a costi contenuti Studi di tossicità, riferiti a particolari strutture e/o funzioni cellulari Studi sul metabolismo e la biotrasformazione degli xenobiotici COLTURE CELLULARI 47 CODICE DI OSSERVAZIONE Normativa ISO :2009 Effetti citotossici trattamento evidenziati da morfologia alterata: vacuolizzazione, distacco, lisi cellulare, Valutazione secondo uno SCORE dei GRADI di DANNO rispetto alle colture di controllo GRADO REATTIVITA CONDIZIONI DELLE COLTURE 0 Nessuna 1 Lieve 2 Leggera 3 Moderata Nessuna lisi cellulare, nessuna riduzione di crescita 80% di cellule ha morfologia normale e si osserva < crescita cellulare Solo il 50% di cellule ha morfologia normale e si osserva < crescita cellulare 70% di cellule ha aspetto globoso e presenta lisi; riduzione crescita del 50% 4 Grave Cellule quasi COLTURE o del CELLULARI tutto distrutte 48 8

9 TEST DI RIDUZIONE DEI SALI DI TETRAZOLIO (MTT) Test quantitativo colorimetrico per determinazione in vitro vitalità e proliferazione cellulare attraverso la valutazione della funzionalità mitocondriale Marcatore indiretto di citotossicità Test di proliferazione cellulare Principio: Enzimi mitocondriali di cellule vitali convertono il SALE DI TETRAZOLIO SOLUBILE 3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il) 2,5- difeniltetrazolio bromuro o MTT in FORMAZANO insolubile precipitato bluvioletto indicatore della vitalità cellulare COLTURE CELLULARI 49 TEST DI RIDUZIONE DEI SALI DI TETRAZOLIO (MTT) L'aggiunta di una SOLUZIONE LISANTE solubilizza le membrane e libera i cristalli anch'essi solubilizzati Dosaggio spettrofotometrico (l = 570 ) dopo incubazione (10 minuti T.A.) con una SOLUZIONE DECOLORANTE % di vitalità= Assorbanza (Abs) Trattato / Abs Controllo negativo (media letture) X 100 COLTURE CELLULARI 50 CO-COLTURE CELLULARI Applicazioni: Interazioni del sistema immunitario Studio su cellule tumorali e microambiente Colture cellule staminali e cellule di supporto COLTURE CELLULARI NUOVI ORIZZONTI COLTURE CELLULARI 51 stromal cells COLTURE CELLULARI 52 CELLULE PLURIPOTENTI INDOTTE 3D-CELL CULTURE COLTURE CELLULARI 53 COLTURE CELLULARI 54 9

10 3D-CELL CULTURE 3D-CELL CULTURE COLTURE CELLULARI 55 COLTURE CELLULARI 56 3D-CELL CULTURE 3D-CELL CULTURE In vivo 3D-cell culture COLTURE CELLULARI 57 COLTURE CELLULARI 58 10