VEDI CAMBI RISALTATI. Componenti 1. MCPL MICROPIASTRA: 12 x 8 pozzetti ricoperti di antigene CMV inattivato. Pozzetti separabili singolarmente.

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1 VEDI CAMBI RISALTATI CMV IgG tests Test ELISA per la determinazione qualitativa e quantitativa degli anticorpi IgG anti-citomegalovirus nel siero o nel plasma umano. Sommario Il citomegalovirus umano (CMV) fa parte della famiglia degli Herpesvirus. Il CMV è ubiquitario e normalmente infetta individui di diverse aree geografiche ed economiche. La maggior parte della popolazione viene infettata dal virus, prima o poi; fino all'81% degli individui degli Stati Uniti maggiori di 35 anni sono stati esposti al virus. Una caratteristica del CMV consiste nel fatto che, dopo l'infezione primaria, il virus può persistere in forma latente per molto tempo e si può riattivare in un momento determinato. L'infezione, la reinfezione o la riattivazione del CMV in adulti normali e nei bambini hanno carattere generalmente lieve o asintomatico. Tuttavia, le infezioni in pazienti immunodepressi o in bambini infettati congenitamente possono portare a casi clinicamente severi di malattia. Tutti i neonati nati prematuramente sotto peso, riceventi di trapianti, pazienti sottoposti a chemioterapia immunodepressiva e pazienti con sindrome di immunodeficienza acquisita presentano un alto rischio di contrarre una patologia seria da CMV. Le prove sierologiche per il rilevamento di anticorpi anti-cmv sono importanti nella determinazione dell'esistenza di un'infezione precedente, nella diagnosi di un'infezione attiva o recente, e nell'analisi del sangue prima di praticare trasfusioni a neonati e a riceventi affetti da immunodeficienza. Principio CMV IgG è un test ELISA per la determinazione qualitativa e quantitativa di anticorpi IgG anti-cmv nel siero o nel plasma umano. Il test si esegue aggiungendo campioni diluiti nei pozzetti di una micropiastra rivestiti di antigene di CMV ed incubando. Gli anticorpi anti-cmv, se presenti, si legheranno agli antigeni fissati al pozzetto. Si lava successivamente per rimuovere il campione residuo e si aggiungono anticorpi anti-igg umana marcati con un enzima (coniugato). Il coniugato si legherà immunologicamente con gli IgG anti-cmv legati agli antigeni del pozzetto durante la prima incubazione. Dopo un secondo lavaggio per eliminare il materiale non legato, si incuba con substrato enzimatico contenente un cromogeno. Si svilupperà colore blu se il campione contiene IgG anti-cmv. Il colore blu virerà al giallo se si blocca la reazione con l'aggiunta di acido solforico. L'intensità del colore sarà proporzionale alla concentrazione di IgG anti-cmv nel campione. La concentrazione di anticorpi nel campione potrà essere calcolata mediante curva di calibrazione. Componenti 1. MCPL MICROPIASTRA: 12 x 8 pozzetti ricoperti di antigene CMV inattivato. Pozzetti separabili singolarmente. 2. CONJ 51x CONIUGATO CONCENTRATO: 1 x 0,35 ml di anticorpi da coniglio anti-igg umani coniugato con perossidasi. Contiene un colorante rosso, proteine stabilizzatrici, sodio mertiolato allo 0,02% e solfato di gentamicina allo 0,001%. Da diluire 1/51 con il diluente del coniugato prima dell uso. 3. DIL CONJ DILUENTE DEL CONIUGATO: 1 x 15 ml di tampone Tris contenente colorante giallo, additivi, sodio mertiolato allo 0,02% e solfato di gentamicina allo 0,001%. 4. DIL SAMP DILUENTE DEI CAMPIONI: 2 x 50 ml di tampone fosfato contenente Tween 20, colorante verde, e sodio azide < 0,1%. Pronto all uso. 5. WASH SOLN 10x SOLUZIONE DI LAVAGGIO CONCENTRATA: 2 x 50 ml di tampone fosfato concentrato (10x) contenente Tween 20 all 1% e sodio mertiolato all 0,01%. Da diluire 1/10 con acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. 6. SUBS BUF TAMPONE SUBSTRATO: 1 x 14 ml di tampone citrato-acetato contenente perossido d idrogeno e solfato di gentamicina allo 0,002%. 7. SOLN TMB CROMOGENO: 1 x 1,5 ml di 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) diluita in dimetilsulfossido (DMSO).

2 8. CAL + H CALIBRATORE POSITIVO ALTO: 1 x 0,6 ml di siero umano diluito contenente 2,5 UI/ml di IgG anti-cmv. Standardizzato mediante lo standard proposto anti-cmv dell'oms fornito dal Laboratorio Centrale di Trasfusioni Sanguigne (CLB) di Amsterdam, Olanda. Contiene proteine stabilizzatrici, colorante verde e < 0,1% di sodio azide. 9. CAL + L CALIBRATORE POSITIVO BASSO: 1 x 0,6 ml di gammaglobulina umana diluita contenente 0,25 UI/ml di IgG anti-cmv. Standardizzato mediante lo standard proposto anti-cmv dell'oms fornito dal Laboratorio Centrale di Trasfusioni Sanguigne (CLB) di Amsterdam, Olanda. Contiene proteine stabilizzatrici, colorante verde e < 0,1% di sodio azide. 10. CONTROL CONTROLLO NEGATIVO: 1 x 0,6 ml di gammaglobulina umana diluita negativa di IgG anti-cmv. Contiene proteine stabilizzatrici, colorante giallo e < 0,1% di sodio azide. 11. H 2 SO 4 1N SOLUZIONE BLOCCANTE: 1 x 12 ml di acido solforico 1N. Pronto all uso. 12. SEALS FOGLI ADESIVI: Per coprire la micropiastra durante le incubazioni. 13. BAG SACCHETTO DI PLASTICA: Per conservare le strisce non adoperate. 14. GRAPH CARTA SEMILOGARITMICA: Per la determinazione quantitativa. Precauzioni CMV IgG è per uso diagnostico IN VITRO. Solo per uso professionale. ATTENZIONE: MATERIALE POTENZIALMENTE BIOPERICOLOSO. Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione di questo prodotto è risultato negativo per anticorpi dei virus HIV-1/HIV-2 e HCV come pure per l'antigene di superficie dell'epatite B, usando un metodo autorizzato in commercio. Tuttavia, poiché nessun metodo può offrire la totale sicurezza dell'assenza di agenti infettivi, questo prodotto deve essere manipolato con precauzione: - Evitare che i reagenti entrino a contatto con la pelle o con gli occhi; se ciò dovesse accadere, lavare con acqua abbondante. - Usare guanti. - Non pipettare mai i reagenti con la bocca. - Non fumare. - Depositare tutti i materiali utilizzati in recipienti idonei per materiale biocontaminante. I residui di campioni, controlli, reagenti aspirati e puntali di pipette devono essere raccolti in un recipiente apposito e sterilizzati in autoclave per 1 ora a 121 C, oppure trattati con ipoclorito di sodio a una concentrazione finale del 10% per 30 minuti. (I resti contenenti acido devono essere neutralizzati prima di aggiungere l ipoclorito di sodio). - Alcuni reagenti di questo kit contengono sodio azide come conservante. La sodio azide può reagire a contatto con tubature e scarichi in piombo o in rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Far scorrere acqua in abbondanza quando si gettano i residui dei reagenti. Precauzioni per l'uso: - Adattare il lavatore al tipo di piastra utilizzata (a fondo piatto) per realizzare un bon lavaggio. - Non mescolare reagenti provenienti da lotti diversi. - Non usare reagenti scaduti. - Non utilizzare il reagente se si osserva qualche cambio di aspetto di un qualsiasi componente del kit. - Prendere le precauzioni necessarie per evitare la contaminazione microbica e la contaminazione incrociata tra i reagenti. - Utilizzare un nuovo puntale monouso per pipettare ogni campione e ogni reagente. - Eventuali resti di saponi e/o agenti ossidanti presenti nei recipienti utilizzati per la preparazione della soluzione substrato-tmb possono interferire nella reazione. Se si adoperano contenitori di vetro è perciò conveniente lavarli con acido solforico o cloridrico 1N, risciacquarli accuratamente con acqua distillata e asciugarli prima dell uso. Usare preferibilmente materiale plastico monouso.

3 Conservazione e stabilità I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta, se conservati a 2-8 C. Il sacchetto che contiene la micropiastra deve essere portato a temperatura ambiente prima dell'apertura per evitare la formazione di condensa nei pozzetti. Dopo l apertura del sacchetto, la micropiastra rimane stabile per 3 mesi se conservata a 2-8 C nel sacchetto ben chiuso, con la bustina di gel di silice dentro. La soluzione di lavaggio, una volta diluita, è stabile per due settimane se conservata a 2-8 C. Il coniugato diluito è stabile per 15 giorni a 2-8 C. Conservare il cromogeno al riparo dalla luce. Una volta preparata, la soluzione substrato-tmb non rimane stabile, quindi è necessario seguire scrupolosamente le istruzioni per l uso. Materiale necessario non incluso - Acqua distillata o deionizzata. - Pipette multicanale e micropipette (10 µl, 100 µl, 1000 µl), e puntali monouso. - Incubatrice a 37 C +1 C. - Tubi/microtubi per le diluizioni. - Cronometro. - Lettore di micropiastre con filtro a 450 nm. Raccomandabile un filtro di riferimento da 620 o 630 nm. - Sistema di lavaggio manuale o automatico. Raccolta dei campioni Usare siero fresco o plasma (EDTA). Altri anticoagulanti devono essere valutati prima dell'uso. I campioni possono essere conservati per 3 giorni a 2-8 C. Per tempi più lunghi i campioni vanno congelati (-20 C). Non procedere a ripetuti congelamenti e scongelamenti. Eventuali particelle in sospensione vanno eliminate mediante centrifugazione. Il siero o plasma non deve essere inattivato a caldo per evitare risultati erronei. Trattamento automatico Questo test è utilizzabile in modo automatico o semiautomatico con vari strumenti. È molto importante validare qualsiasi sistema automatico per dimostrare che i risultati ottenuti con i campioni sono equivalenti a quelli del test manuale. È raccomandabile validare periodicamente lo strumento. In caso di difficoltà nella programmazione e regolazione dei processori automatici Biokit, contattare il proprio distributore. PROCEDURA (Vedere schema del procedimiento) Operazioni preliminari Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente (20-25 C) prima di cominciare il test. I reagenti liquidi devono essere omogeneizzati delicatamente prima dell'uso. Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 1/10 con acqua distillata o deionizzata. Per una piastra mescolare 50 ml di soluzione di lavaggio concentrata con 450 ml d'acqua. Se non si utilizza una piastra completa, preparare il volume proporzionale di soluzione. Preparare diluizioni 1/101 dei calibratori, controllo negativo e campioni da analizzare aggiungendo, per esempio, 10 µl di siero a 1 ml di diluente dei campioni. Mescolare bene. NOTA: Nel test eseguito in manuale è consigliabile effettuare le diluizioni nei microtubi e trasferire poi il contenuto nella micropiastra con una pipetta multicanale. Diluire il coniugato concentrato 1/51 con il diluente del coniugato, come indicato nella tabella 1. Se si usa la piastra intera, aggiungere 300 µl del coniugato concentrato direttamente nel flacone che contiene 15 ml di diluente del coniugato. Mescolare delicatamente. TABELLA 1 Strisce occorrenti Diluente del coniugato ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Coniugato concentrato µl Esecuzione del test 1. Utilizzare solo il numero di strisce necessarie per il test. Prevedere 7 pozzetti per bianco, calibratori e controlli. I calibratori e il controllo negativo vanno fatti in doppio. Trasferire 100 µl di ogni campione diluito e di ogni calibratore e controllo diluiti nei pozzetti corrispondenti. Lasciare un pozzetto vuoto per il bianco del substrato. 2. Coprire la micropiastra con un foglio adesivo e incubare per 1 ora a 37 C.

4 3. Scartare il foglio adesivo. Aspirare il contenuto dei pozzetti e riempirli completamente (circa 350 µl) con soluzione di lavaggio diluita. Ripetere il processo di aspirazione e lavaggio altre 3 volte. Verificare che ogni colonna di pozzetti stia a bagno per almeno 15 secondi prima del nuovo ciclo di aspirazione. Dopo l'ultimo lavaggio battere sulla piastra capovolta su una carta assorbente, per rimuovere dai pozzetti il liquido in eccesso. 4. Dispensare 100 µl di coniugato in ogni pozzetto, ad eccezione di quello destinato al bianco del substrato. Evitare la formazione di bolle. 5. Coprire la piastra con un foglio adesivo e incubare per 30 minuti a 37 C. 6. Durante gli ultimi 5-10 minuti di questa incubazione, preparare la soluzione di substrato-cromogeno. Per una piastra aggiungere 280 µl della soluzione di cromogeno (TMB) in un flacone di tampone substrato (14 ml) e mescolare bene. Se non si adopera tutta la piastra, preparare la quantità necessaria come indicato nella tabella 2. La soluzione finale deve essere incolore: scartarla se diventa azzurra. TABELLA 2 Strisce occorrenti Tampone substrato ml 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 Cromogeno (TMB) µl NOTA: Il TMB è diluito in DMSO. Dato che la temperatura di fusione del DMSO è di 18 C, il cromogeno deve raggiungere una temperatura di C ed essere agitato bene prima dell'uso. È normale che il cromogeno presenti un colore giallastro. 7. Scartare il foglio adesivo. Aspirare e lavare la piastra come indicato al punto Aggiungere 100 µl di substrato-tmb in tutti i pozzetti, compreso il bianco. 9. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 C). 10. Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante in ogni pozzetto, mantenendo la stessa sequenza e con gli stessi intervalli osservati nell'aggiunta del substrato-tmb. 11. Regolare lo zero del lettore con il pozzetto del bianco a 450 nm e leggere l'assorbanza di ogni pozzetto entro 30 minuti al massimo. Si raccomanda di eseguire la lettura bicromatica utilizzando un filtro di riferimento di nm. Controllo di qualità I risultati di una prova sono validi se sono rispettati i seguenti criteri: 1. Bianco del substrato: Il valore di assorbanza deve essere inferiore o uguale a 0, Controllo negativo: Il valore di assorbanza deve essere inferiore a 0,100 una volta sottratto il bianco. 3. Calibratore positivo alto: assorbanza uguale o superiore a 0,600 una volta sottratto il bianco. 4. Calibratore positivo basso: assorbanza uguale o superiore a 0,150 una volta sottratto il bianco. 5. Rapporto calibratore positivo alto/calibratore positivo basso: uguale o superiore a 2,0. 6. Rapporto controllo negativo/calibratore positivo basso: inferiore o uguale a 0,5. Risultati qualitativi 1. Calcolare l assorbanza media del controllo positivo basso. Questo è il valore di soglia. Valore di soglia = CPBx 2. Dividere l'assorbanza del campione per il valore di soglia. Positivo: rapporto assorbanza/valore di soglia 1,0 Negativo: rapporto assorbanza/valore di soglia 0,9 Dubbio: rapporto assorbanza/valore di soglia 0,9 1,0

5 Risultati quantitativi 1. Calcolare il valore di assorbanza medio del calibratore positivo basso. La concentrazione di IgG anti-cmv del calibratore positivo basso è di 0,25 UI/ml. 2. Calcolare il valore di assorbanza medio del calibratore positivo alto. La concentrazione di IgG anti-cmv del calibratore positivo è di 2,5 UI/ml. 3. Rappresentare in coordinate lineare-log i valori medi di assorbanza dei calibratori nell'asse delle ordinate (asse Y, lineare) rispetto ai loro rispettivi valori di concentrazione in UI/ml nell'asse delle ascisse (asse X, log) servendosi della carta per grafici inclusa nel kit, oppure impiegare la regressione semilogaritmica. 4. Tracciare una linea passante dai 2 punti se si usa la carta per grafici. Un'altra possibilità è quella di fare una regressione semilogaritmica. 5. La concentrazione dei campioni tra 0,25 e 2,5 UI/ml può essere calcolata in base ai rispettivi valori di assorbanza, servendosi del grafico o della regressione semilogaritmica. NOTA: Questo test è stato elaborato per la determinazione di concentrazioni di anticorpi IgG anti-cmv tra 0,25 e 2,5 UI/ml. Oltre questi limiti, la precisione sarà insufficiente. I campioni che danno valori di assorbanza superiori a quello del calibratore positivo alto dovranno essere ritestati, dopo essere stati opportunamente diluiti con il tampone di diluizione. Il risultato ottenuto va moltiplicato per il fattore di diluizione. (p.es. se un campione è sottoposto a una diluizione di 1/500, il risultato deve essere moltiplicato per 5, poiché la diluizione normale del test è di 1/101). Risultato in UI/ml 0,25 0,25 Interpretazione Positivo (immune) Negativo (no immune) Interpretazione dei risultati Una reazione positiva va interpretata come prova della presenza di anticorpi IgG e di infezione da CMV, recente o meno. Un aumento del titolo di anticorpi anti-cmv di 4 volte o più in coppie di campioni prelevati con un intervallo di 3-4 settimane, testati allo stesso tempo in pozzetti adiacenti, può indicare un'infezione recente. Tuttavia, per la diagnosi si raccomanda di associare questo procedimento al rilevamento di anticorpi IgM specifici anti-cmv e al rilevamento del DNA del virus nei globuli bianchi o nel sangue completo, mediante tecniche di amplificazione. Limitazioni della procedura Come per altri test sierologici, i risultati ottenuti con il CMV IgG sono soltanto un aiuto per la diagnosi e devono essere interpretati alla luce della storia clinica del paziente. Per il corretto funzionamento del kit, seguire scrupolosamente le istruzioni indicate. Ogni deviazione può dare origine ad aberrazioni dei risultati. In caso di risultati dubbi si raccomanda di ripetere il test con un nuovo campione del paziente e di usare un altro metodo, se il risultato è ancora dubbio. I valori di assorbanza sono proporzionali al logaritmo della concentrazione di anticorpi (UI/ml). Variazioni minori dei valori di assorbanza possono portare a maggiori variazioni del titolo di anticorpi. Risultati previsti La prevalenza di infezione primaria e ricorrente da CMV in popolazioni adulte varia ampiamente da una zona del mondo all'altra, e perfino tra differenti fasce di età e gruppi socioeconomici di una stessa regione geografica. In uno studio interno è stata rilevata una sieroprevalenza del 70% circa in 642 donatori di sangue non selezionati di Barcellona, Spagna. Nell'Europa Centrale la percentuale di adulti giovani infettati da CMV è del 50% circa. Nella popolazione più anziana la sieropositività è del 70-80%. 10 Caratteristiche di funzionalità Valutazioni Il funzionamento del CMV IgG è stato valutato per mezzo di panel commerciali e interni come pure mediante studi comparativi con altri test commerciali. - È stato testato un panel commerciale di BBI anti-cmv mixed titre panel PTC202 composto di 25 campioni determinati. Il kit ha rilevato correttamente tutti i campioni. 23 campioni hanno dato positivi.

6 - In una valutazione interna, sono stati testati 642 campioni con il e con un altro test in commercio. Di questi campioni, 447 sono risultati positivi e 189 negativi con entrambi i metodi. La concordanza globale tra i test è stata del 99,1% (635/642). Tra i 6 campioni discordanti, 4 hanno dato risultato dubbio con il o con il secondo test. Escludendo dai calcoli i risultati dubbi, la sensibilità relativa del è stata del 99,8% (447/448) e la specificità relativa del 99,5% (189/190). - In uno studio esterno di sensibilità e specificità che comparava altri tests in commercio, 79 sieri prelevati a donatori di organi sono stati provati con 6 tests: due tests ad agglutinazione di lattice, un test ad agglutinazione di particelle e tre ELISA per anticorpi anti-cmv. Complessivamente, 67/79 campioni hanno presentato risultati concordanti in tutti i tests. (34 campioni positivi e 33 negativi). Il CMV IgG ne ha rilevato 40 positivi e 39 negativi. Per quanto riguarda il risultato concordante, è stata ottenuta una specificità del 100% (38/38) e una sensibilità del 97,6% (40/41). Precisione Riproducibilità intra-test: I coefficienti di variazione ottenuti per i valori di assorbanza di un campione positivo testato in 32 repliche sono stati del 3,0%, 5,0% e 4,7% in tre lotti esaminati. Riproducibilità inter-test: Sono stati testati tre campioni positivi di livelli diversi in tre test diversi. I coefficienti di variazione ottenuti per i rapporti assorbanza/valore di soglia dei 3 campioni sono stati del 6,8%, 4,7% e 2,6%. Interferenze Con lo scopo di studiare possibili interferenze sono stati analizzati campioni con rischio potenziale di causare reazioni crociate. Tali campioni includevano sieri positivi per il fattore reumatoide (RF), per anticorpi antinucleari (ANA) e di gestanti. Non sono stati rilevati segni evidenti di interferenza.

7 : Guida alla soluzione dei problemi Problema Cause possibili Soluzione 1. Controlli non convalidanti. 2. Senza colore o con poco colore alla fine della prova. 1a. Temperatura, incubazione o pipettaggio erronei. 1b. Preparazione erronea dei reagenti, errore nelle diluizione. Reagenti non correttamente mescolati. 1c. Inquinamento incrociato dei controlli. Verificare procedimento. Verificare procedimento. Pipettare con attenzione. Non scambiare i tappi dei flaconi. 1d. Filtro di lettura erroneo. Controllare che il filtro di lettura sia di 450 nm. Se non si usa un filtro di riferimento di nm, le assorbanze aumentano di circa 50 milliunità. 1e. Interferenza nella via ottica. Controllare il lettore. Pulire o asciugare il fondo dei pozzetti. Verificare l assenza di bolle d'aria. Ripetere la lettura. 1f. Sono stati usati Non usare componenti di lotti componenti di lotti diversi. diversi, dato che sono dosati per ogni singolo lotto. 1g. Reagenti scaduti. Controllare la scadenza del 2a. Uno o più reagenti non sono stati aggiunti o sono stati aggiunti in una sequenza sbagliata. 2b. Coniugato inattivo: conservazione erronea. 2c. Micropiastra inattiva: conservazione erronea. 2d. Substrato inattivo: errore di conservazione o di diluizione, il contenitore utilizzato influisce sulla stabilità del substrato, inquinamento incrociato con la soluzione bloccante. kit. Non usare kit scaduti. Controllare il procedimento. Controllare se vi è stato inquinamento. Verificare procedimento. Conservare sempre le strisce non utilizzate nel sacchetto ben chiuso, con il deumidificante dentro. Utilizzare sempre una diluizione fresca di TMB nel tampone substrato. Usare contenitori monouso oppure lavati con acido o etanolo e sciacquati con acqua deionizzata. Verificare il procedimento.

8 : Guida alla soluzione dei problemi Problema Cause possibili Soluzione 3. Troppo colore in tutti i pozzetti della micropiastra. 4. Riproducibilità scarsa o elevato numero di campioni reattivi che non si ripetono. 3a. Substrato inquinato od ossidato. 3b. Reagenti inquinati o preparati in modo sbagliato. 3c. Soluzione di lavaggio (1x) inquinata. 3d. Lavaggio insufficiente o non uniforme: riempimento o aspirazione insufficienti o non uniformi, numero di cicli di lavaggio insufficiente. Lavatore inquinato. 3e. È stata adoperata una soluzione di lavaggio di una marca diversa. 3f. Diluizione erronea dei campioni. Controllare che il substrato- TMB di lavoro sia incolore, scartarlo se è azzurro. Verificare che il TMB sia completamente liquido prima di usarlo. Controllare la corretta miscelazione del TMB nel tampone substrato. Utilizzare contenitori monouso oppure lavati con acido o etanolo. Controllare inquinamento (aspetto torbido). Controllare diluizioni. Controllare la qualità dell'acqua distillata/deionizzata utilizzata per preparare la diluizione. Controllare Il lavatore. Riempire i pozzetti fino all'orlo e aspirare completamente. Incrementare il numero di cicli di lavaggio. Battere sulla piastra capovolta su carta assorbente. Ripetere il test. Utilizzare solo la soluzione di lavaggio biokit. Verificare procedimento. 4a. Problemi di lavaggio. Vedere punti 3c, 3d, 3e. 4b. Pipette calibrate male o Usare pipette calibrate con puntali incastrate male. puntali inseriti ben fissati. Tecnica di pipettaggio Pipettare accuratamente erronea. senza fare bolle né schizzi. 4c. Reagenti e/o campioni non a temperatura ambiente o non correttamente mescolati prima dell'uso. 4d. Correnti d'aria sulla micropiastra durante l'incubazione. 4e. Tempi troppo lunghi nell'aggiunta di campioni e/o reagenti. Imprecisione negli intervalli di tempo, bolle d'aria. 4f. Interferenza nella via ottica. Portare a temperatura ambiente i campioni e i reagenti, e miscelarli bene prima dell'uso. Tenere la micropiastra al riparo dalle correnti d'aria. La tecnica deve essere uniforme e riproducibile. Vedere 1e.