SPETTROSCOPIA NMR BASI TEORICHE E PRINCIPALI APPLICAZIONI. Cronologia NMR Prima osservazione di un segnale NMR

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1 SPETTROSOPIA NMR BASI TEORIHE E PRINIPALI APPLIAZIONI H 0 ronologia NMR 1945 Prima osservazione di un segnale NMR Bloch e coll. Stanford Un. (1H in H2O) Purcell e coll. Harvard Un. (1H in paraffina) (nobel 1952) 1950 Scoperta del hemical Shift 1961 Primo spettrometro commerciale W 1970 Primo spettrometro commerciale FT 1976 Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel) 1980 Spettrometri NMR di II generazione 1

2 SPETTROSOPIA NMR Punti fondamentali La spettroscopia NMR e una spettroscopia di assorbimento. Permette di rivelare l assorbimento di radiazione elettromagnetica da parte di una molecola. Quindi con l NMR si esaminano direttamente i nuclei atomici e non gli elettroni. Ogni informazione sull intorno chimico viene dedotta osservando il comportamento dei nuclei atomici. Vediamo che succede quando poniamo un nucleo in un campo magnetico statico Bo: Quando un nucleo dotato di spin viene immerso in un campo magnetico, il nucleo, come l ago di una bussola, è sottoposto ad una coppia di forze che lo fanno ruotare per allinearlo con il campo magnetico esterno. 2

3 INTERAZIONE DI ZEEMAN Il metodo si fonda sulla precessione dello spin attorno ad un campo magnetico Ho. S OPPOSTO AL AMPO ALTA ENERGIA N B 0 Z N S B 0 ALLINEATO AL AMPO STATO EITATO BASSA ENERGIA X Y Per un nucleo con I = ½, la differenza tra i livelli energetici adiacenti e : DE = g h/2p B o B 0 B 0 DE = g h 2p Bo 3

4 PRINIPI BASILARI DI UN ESPERIMENTO NMR ome si induce una transizione tra differenti livelli energetici? Nell NMR cio viene realizzato attraverso l irradiazione del nucleo con un campo elettromagnetico B 1, con una frequenza n 1 tale che avvenga l interazione tra la componente magnetica della radiazione e i dipoli nucleari. La transizione avverra quando hn 1 = DE, e comportera un assorbimento di energia (per transizioni che vadano dal livello inferiore a quello superiore). In pratica la n 1 dovra essere eguale alla frequenza di Larmor Ogni transizione comporta un cambiamento di spin. Qualora un nucleo abbia un numero di spin I 1 (ossia piu livelli energetici), quali saranno le transizioni permesse? Secondo le regole di selezione, saranno permesse solo le transizioni single quantum, ossia transizioni in cui il numero m (numero quantico magnetico) vari di 1: Dm = 1 PRINIPI BASILARI DI NMR: Spostamento himico Tanto più grande è la densità elettronica, tanto maggiore sarà questa schermatura, così i nuclei che si trovano in un intorno ricco di elettroni, sentiranno un campo magnetico più basso e quindi subiranno la transizione ad una frequenza applicata più bassa rispetto ai nuclei situati in intorni poveri di elettroni. Lo spostamento risultante nel segnale NMR per un dato nucleo è detto spostamento chimico e, in generale, protoni o carboni adiacenti ad atomi elettronegativi risultano deschermati quindi sentono un campo magnetico applicato più intenso e subiscono transizione a frequenze maggiori e, nello spettro, si trovano ad uno spostamento chimico più alto reference signal tetramethylsilane Si(H 3 ) 4 = 0.00 d d increasing deshielding increasing shielding TMS 4

5 Perché introduciamo lo Spostamento himico? 5

6 Il campo magnetico Magnete a 900 MHz Magnete a 400 MHz n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10 Il campo magnetico osa è, per esempio, uno spettrometro a 500 MHz? E uno strumento che, per creare la differenza di energia tra i due livelli di spin nucleare, utilizza un campo magnetico B tale per cui la differenza di energia, calcolata per lo spin 1 H, tra il livello fondamentale e quello eccitato DE=hn è pari a 500X10 6 Hz 6

7 400 MHz NMR Spectrometer Per un esperimento NMR servono circa nuclei, equivalente a circa 1 cm 3 di materiale. Unix computer 400 MHz Avance System superconducting magnet 7

8 APPARATO STRUMENTALE DI UN ESPERIMENTO NMR campo magnetico 9.4 Tesla (94,000 gauss) Frequenza 400 MHz L'elio liquido si trova nella parte centrale della cella refrigerante, e serve a mantenere a questa bassissima temperatura una bobina in cui circola della corrente elettrica. NMR sample tube and holder descend into center of magnet Questa bobina, fatta di un materiale che alla temperatura dell'elio liquido è un superconduttore, crea un campo magnetico. NMR MONTAGGIO DEL AMPIONE 5 mm NMR sample tube RF energy upper level of NMR solution NMR sample positioned at top of probe Liquid Nitrogen -196 (77.4 K) Liquid Helium -269 (4.2 K) Superconducting magnets require continuous cooling. 8

9 APPARATO STRUMENTALE DI UN ESPERIMENTO NMR Quando il campione entra nella macchina, un getto d'aria fa ruotare il campione per poter ottenere una misura uniforme su tutto il campione. Dapprima un generatore RF (frequenza radio) "emette impulsi" verso il campione con una breve raffica di onde radio.. Queste onde vengono assorbite dal campione, il quale invia al ricevitore i segnali dovuti alla sua interazione con queste onde. Il ricevitore rileva il segnale dal campione e questa informazione viene poi trasmessa al computer vicino all'nmr dove viene tradotto ed analizzato: il computer, attraverso la trasformata di Fourier, elabora i dati Multinuclear NMR MHz 9

10 Strumenti a scansione Gli strumenti a scansione possono avere modalità costruttive molto diverse, a seconda del tipo di spettroscopia (IR, UV, etc.) alla quale sono dedicati e all' utilizzo (strumenti di routine, di ricerca, etc.) al quale sono destinati, ma tutti possono essere ricondotti al seguente schema semplificato: ELEMENTO DISPERDENTE che divide il fascio in tanti fasci monocromatici, ciascuno contenente solo fotoni della stessa frequenza UNA FENDITURA di uscita che lascia passare un solo fascio monocromatico cella con il solvente SORGENTE di un fascio di radiazione policromatica, contenente tutte le frequenze che ci interessano. cella con il campione REGISTRATORE, che registra il segnale in arrivo dall' amplificatore RIVELATORE, che misura l' intensità del fascio trasformandola in un segnale elettrico amplificato da un AMPLIFIATORE 10

11 richiedeva un tempo variabile dai 2-10 minuti, poiché bisognava eseguire più scansioni per accumulare i dati; 11

12 in altre parole In tale metodo tutti i nuclei di una specie sono eccitati SIMULTANEAMENTE da un impulso di radiofrequenza. Immaginiamo di avere un trasmettitore di radiofrequenza con frequenza n 1. Se lo accendiamo per un tempo molto breve t p, otteniamo un impulso che contiene NON SOLO la frequenza n 1, ma tutto un intervallo di frequenze simmetriche intorno al valore n 1. Ma solo una parte (approssimativamente proporzionale a t p -1 ) di tale intervallo e adatta ad indurre risonanza 12

13 TRASFORMATE DI FOURIER La trasformata di Fourier e' una operazione che converte le funzioni dal dominio del tempo a quello della frequenza. La trasformata inversa di Fourier converte dal dominio della frequenza al dominio del tempo. Non ci avrete mai pensato, ma il cervello umano e' capace di compiere una trasformata di Fourier. onsiderate una nota e l'onda sinusoidale seguente : Un musicista con una perfetta intonazione vi riconoscerebbe una nota ( Hz) sulla scala musicale. Vi sono persone in grado di riconoscere le singole note nel caso di piu' note suonate contemporaneamente, anche se questo processo diventa piu' difficile all'aumentare delle note. Riuscireste a dire quali frequenze sono state suonate? Bene. La trasformata di Fourier puo' farlo! La trasformata di Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che ascolta una tonalita' (segnale nel dominio del tempo) e ne determina la nota (frequenza). La trasformata inversa di Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che vede le note (frequenze) sullo spartito musicale e le converte in toni (segnali nel domino del tempo). TRASFORMATE DI FOURIER Per passare dal dominio dei tempi a quello delle frequenze e necessaria un operazione matematica, detta trasformata di Fourier: g(v) e lo spettro nel dominio delle frequenze, f(t) e lo spettro nel dominio dei tempi. g(v) ha una parte reale che porta ad un segnale di assorbimento, e una parte immaginaria che porta ad un segnale in dispersione. La parte immaginaria puo essere rimossa tramite la correzione di fase. 13

14 I nuclei che hanno assorbito la radiazione sono saliti al livello eccitato, ma per ritornare al loro stato fondamentale devono ricedere energia proprio in quantità esattamente uguale a quella assorbita. Tale emissione viene registrata da un registratore che evidenzia in un grafico correnti elettriche oscillanti definite Ma tutti i nuclei sono in risonanza quindi avremo una serie di correnti oscillanti che decadono nel tempo; il FID contiene tutte le informazioni relative alle frequenze di risonanza dei nuclei basta eseguire la Trasformata di Fourier! F.I.D. (Free Induction Decay). Tale fenomeno è dovuto ai moto precessionali che creano campi elettrici oscillanti per il moto rotatorio, e decadenti perché i nuclei vanno dallo stato eccitato a quello fondamentale. Tale grafico è di difficilissima interpretazione, così come lo sono le informazioni da estrapolare. Esso, però essendo un grafico nel dominio del tempo, può essere trasformato in un grafico nel dominio della frequenza grazie ad un operazione definita TRASFORMATA DI FOURIER, ottenendo lo spettro che si vede alla fine dell analisi. L operazione dura alcuni secondi, invece che minuti. [1] La frequenza è funzione inversa del tempo (n = 1/t ). 14

15 DESRIZIONE LASSIA DELLA RISONANZA: Produzione del segnale NMR A un certo punto l'impulso di radiofrequenza cessa ed entra in funzione un circuito ricevente L'energia assorbita dai nuclei viene lentamente ceduta agli atomi vicini a causa di fenomeni detti di rilassamento. Il rilassamento porta la magnetizzazione all orientazione originale, ne deriva che il segnale decadra. Se il campione contiene piu nuclei con differenti frequenze di risonanza, si ottengono piu curve che sovrapponendosi portano ad un interferogramma in cui le intensita sono in relazione ai tempi (spettro nel dominio dei tempi), di difficile interpretazione TEMPO DI RILASSAMENTO (Spin relaxation times) Il tempo di rilassamento è una misura del tempo necessario perchè gli spins decadano dagli stati eccitati alla situazione di equilibrio ad es. allo stato fondamentale, per quella determinata temperatura. Il tempo di rilassamento dipende dall'intorno chimico del nucleo e può essere un importante indicatore dell'ambiente locale. Nei silicati varia da qualche microsecondo a diverse migliaia di secondi. Impurezze paramagnetiche riducono in maniera significativa il tempo di rilassamento. 15

16 Esistono due modi in cui un sistema puo rilassare: Rilassamento spin-reticolo (o longitudinale), definito dal tempo T1; esso comporta un trasferimento di energia dai nuclei eccitati all ambiente circostante, detto reticolo, che di conseguenza accresce la sua energia termica. ol termine reticolo intendiamo molecole vicinali, e persino la parete del recipiente. Rilassamento spin-spin (o trasversale), definito dal tempo T2. Da un punto di vista classico, l energia viene trasferita da un nucleo ad un altro attraverso campi magnetici fluttuanti. In questo processo uno dei nuclei passa da uno stato di alta energia ad uno a piu bassa energia, mentre un altro nucleo subisce il processo opposto. Risonanza magnetica imaging (MRI). Nell'MRI medica, i radiologi sono per lo più interessati al segnale NMR proveniente da acqua e grasso, essendo questi i componenti del corpo umano che contengono le maggiori quantità di idrogeno. L energia coinvolta nelle transizioni NMR è minima rispetto alle energie coinvolte nelle emissioni di raggi X e gamma (1-100 Kev). In un campo magnetico di 1 Tesla, il dislivello di energia tra i protoni paralleli e antiparalleli è = x 10-7 ev 16

17 La Risonanza Magnetica Nucleare è emersa come un nuovo strumento non distruttivo e non invasivo per lo studio del metabolismo e della struttura anatomica di sistemi biologici intatti. 17

18 Tempi di rilassamento on la spettroscopia RM del fosforo ( 31 P-MRS): ATP fosfato inorganico (Pi) fosfocreatina (Pr) intermedi metabolici fosforilati (PME e PDE) concentrazione di Mg 2+ ph intracellulare Si valuta la funzionalità di: fosforilazione ossidativa, glicogenolisi, glicolisi.. on la spettroscopia RM del protone ( 1 H-MRS): n-acetilaspartato (NAA) colina (ho) creatina + fosfocreatina (r) glutammato e glutammina (Glx) mio-inositolo (m-i) e acido lattico (LA) Si valuta la funzionalità di: sistema glutamminergico, metabolismo energetico, la osmoregolazione del SN. 18

19 Elements in Organic hemistry There are 4 important elements in Org. hemistry: (frequency at 2.35T) H : Best NMR element 1 H, I = ½ (sharp lines), a = 99.98%, high frequency (n = 100 MHz) 2 H, I =1 (broad lines), a = 0.02%, n = 15.4 MHz, : N : O : 13, I = ½ (sharp lines), a = 1.1%, n = 25.3 MHz 14 N, I =1 (broad lines), a = 99.6%, n = 7.2 MHz, 15 N, I = ½ (sharp lines), a = 0.4%, n = 10.1 MHz 17 O, I =5/2 (broad lines), a = 0.04%, n = 13.5 MHz, Elements in inorganic chemistry: 29 Si 27 Al Fenomeni importanti per la posizione (e la forma) dei picchi in NMR dei solidi B 0 B 0 19

20 INTERAZIONE DI ZEEMAN Interazione tra il nucleo in esame ed il campo magnetico Bo. S OPPOSTO AL AMPO ALTA ENERGIA N B 0 Z N S B 0 ALLINEATO AL AMPO STATO EITATO BASSA ENERGIA X Y Per un nucleo con I = ½, la differenza tra i livelli energetici adiacenti e : DE = g h/2p B o B 0 B 0 Fenomeni importanti per la posizione (e la forma) dei picchi in NMR dei solidi H S =schermo elettronico (chemical shift interaction). Lo spostamento chimico della frequenza di risonanza è dovuto ad un effetto di schermo degli elettroni che indeboliscono il campo magnetico che arriva al nucleo in esame. 20

21 Fenomeni importanti per la posizione (e la forma) dei picchi in NMR dei solidi: hemical shift interaction e hemical shift anisotropy (SA) 21

22 Fenomeni importanti per la posizione (e la forma) dei picchi in NMR dei solidi In genere si considerano, assieme alla interazione Zeeman (H Z, interazione tra il nucleo e il campo magnetico applicato), i seguenti fenomeni espressi in termini di perturbazione: H P =interazione paramagnetica, dovuta ad impurezze paramagnetiche (ad es. Fe 3+ >0.5%) o metalli. ausa uno shift del segnale. H D =interazione dipolare tra il nucleo studiato i e uno vicino j con spin I diverso da zero. rea uno sdoppiamento nei picchi che dipende dal momento magnetico del vicino, m j, e dall angolo q che il vettore r ij forma con H 0. DH=3 m j (3cos 2 q -1)/ r ij 3 H 0 MAS NMR: riduce il tempo di interazione tra i nuclei vicini nel tempo Esistono diverse strategie per migliorare la risoluzione dello spettro ed eliminare l'allargamento dei segnali NMR dovuti all' interazione tra il nucleo studiato i ed uno vicino j (interazione dipolo-dipolo) e all'anisotropia del chemical shift. In particolare, attraverso la MAS NMR (magic angle spinning nuclear magnetic resonance) vengono eliminati i fenomeni di broadening attraverso la rotazione del campione di un angolo teta pari a 54 41', detto angolo magico, rispetto alla direzione del campo magnetico esterno. La scelta di tale angolo rende uguale a zero l'espressione (3cos 2 q - 1) (dove q è l'angolo tra il campo magnetico applicato Ho e il vettore che lega i due nuclei interagenti) e annulla i termini responsabili dell'allargamento dei segnali. 22

23 NMR DELLO STATO SOLIDO: MAGI ANGLE SPINNING (MAS) H 0 Spinning sidebands: modulazioni del segnale di radio-frequenza associate allo spinning NMR DELLO STATO SOLIDO: MAGI ANGLE SPINNING (MAS) 23

24 Fenomeni importanti per la posizione (e la forma) dei picchi in NMR dei solidi. H Q =interazione quadrupolare (I 1) tra il nucleo studiato, se questo possiede un momento quadrupolare, ed il gradiente di campo elettrico locale al nucleo. ausa l allargamento dei picchi In generale, un nucleo con di spin I si splitterà in 2I+1 linee, o livelli energetici. Es:: I=1/2 si splitta in 2 livelli energetici (-1/2 e +1/2);se I=1, ci saranno 3 livelli energetici, ecc. Il gradiente di campo elettrico è diverso da zero quando la distribuzione di carica attorno al nucleo non è in simmetria cubica. Quando I>1 la distribuzione di carica non è sferica Il momento di quadrupolo nucleare è diverso da zero quando la distribuzione di carica si discosta dalla simmetria sferica. Fenomeni importanti per la posizione (e la forma) dei picchi in NMR dei solidi: INTERAZIONE QUADRUPOLARE nuclei ON spin ½ NON SONO QUADRUPOLARI, OSSIA DISTRIBUZIONE DI ARIA SFERIA Levitt 24

25 Fenomeni importanti per la posizione (e la forma) dei picchi in NMR dei solidi H J =accoppiamento spin-spin ( J-coupling) con secondi e terzi vicini legati insieme. A differenza della interazione dipolare H D, si tratta essenzialmente di una interazione scalare o indipendente dalla orientazione del vettore interatomico r ij. L interazione è mediata dagli elettroni leganti e causa uno sdoppiamento dei picchi. H J =accoppiamento spin-spin ( J-coupling) causa una molteplicità dei picchi. iò è dovuto ad un fenomeno noto come accoppiamento spinspin e nasce dal fatto che il protone in esame è soggetto a due tipi di campo magnetico, uno uguale in tutte le molecole, che chiameremo B eff dato dal campo magnetico applicato, schermato dall intorno chimico, l altro è dato dai piccoli campi magnetici prodotti dai nuclei dei protoni vicini, ma poiché questi si possono disporre in modi diversi, questa componente magnetica potrà variare da una molecola all altra. Es.: un solo protone Ha vicino al protone in esame Hx B eff + b Ha Hx Ha B eff - b Hx B eff 25

26 H J =accoppiamento spin-spin ( J-coupling) causa una molteplicità dei picchi. Es.: un solo protone Ha vicino al protone in esame Hx B eff + b B eff - b Ha Hx Ha Hx B eff H J =accoppiamento spin-spin ( J-coupling) causa una molteplicità dei picchi. Ha Hx Ha Hx B eff 50% molecole con B eff + b 50% con B eff - b 26

27 H J =accoppiamento spin-spin ( J-coupling) causa una molteplicità dei picchi. Es.: due protoni vicini al protone in esame Hx H Hx Ha Hx B eff H B eff + b + b H B eff H H B eff - b - b Hx Ha Hx Il risultato è che il segnale viene suddiviso in tre picchi (tripletto) per opera dei protoni adiacenti. H B eff Il risultato è che il segnale viene suddiviso in tre picchi (tripletto) per opera dei protoni adiacenti. 27

28 50% 50% 50% 25% 25% Applicazione della NMR ai solidi Ad esempio, attraverso la spettroscopia 29 Si MAS è possibile stimare il grado di polimerizzazione dei tetraedri SiO 4, e quindi il numero di atomi tetraedricamente coordinati ad una data unità SiO 4, e il tipo. Q 4 = framework di tetraedri Q 3 = strati di tetraedri Q 2 = catene di tetraedri Q 1 = dimeri di tetraedri Q 0 =tetraedro isolato ppm TMS 28

29 Applicazione della NMR ai solidi Ad esempio, attraverso la spettroscopia 29 Si MAS è possibile distinguere la presenza di Al in posizione tetraedrica quale sostituente del Si (~50-80 ppm di chemical shift), Q 4 = framework di tetraedri Q 3 = strati di tetraedri Q 2 = catene di tetraedri Q 1 = dimeri di tetraedri Q 0 =tetraedro isolato Q 4 (4Al) Q 4 (3Al) Q 4 (2Al) Q 4 (1Al) Q 4 (0Al) ppm TMS ppm TMS Applicazione della NMR ai solidi Ad esempio, attraverso la spettroscopia 29 Si MAS è possibile distinguere la presenza di Al in posizione tetraedrica quale sostituente del Si (~50-80 ppm di chemical shift), Al solo tetraedrico Al solo ottaedrico Al tetraedrico e ottaedrico 29

30 Applicazione della NMR ai solidi Attraverso la spettroscopia 27 Al MAS NMR è possibile distinguere la presenza di Al in posizione tetraedrica quale sostituente del Si (~50-80 ppm di chemical shift), oppure, con altrettanta facilità di Al in coordinazione ottaedrica (~ ppm). Spettro 27 Al MAS NMR della mica muscovite Applicazione della NMR ai solidi Inoltre gli spettri 29 Si MAS NMR possono essere usati per calcolare il rapporto Si/Al in accordo con la seguente equazione: 4 dove I I n indica le intensità dei picchi Si(n Al). n Si 0 Al nIn 0 30

31 Applicazione della NMR ai solidi orrelazione tra l angolo T-O-T e il chemical shift in assenza di alluminio tetraedrico SPETTROSOPIA NMR BASI TEORIHE E PRINIPALI APPLIAZIONI H 0 31

32 Dietil etere H 3 -H 2 -O-H 2 -H 3 Per una molecola di questo tipo si può predire che ci saranno solo due tipi di protoni che danno un segnale nello spettro NMR: quelli sul gruppo metile H 3 a circa d=1 e quelli sul gruppo metilene H 2 con un segnale spostato verso campi più bassi attorno a d=4 a causa dell ossigeno più elettronegativo. 32