UNIVERSITA DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II FACOLTA DI SCIENZE MM.FF.NN. TESI DI LAUREA IN INFORMATICA (MAGISTRALE) Una piattaforma per lo studio e l'analisi di dati sperimentali della cellula e delle sue reti genetiche. Relatori Prof. Adriano Peron Dott. Diego di Bernardo Candidato Gennaro Gambardella matricola 961/103 Correlatore Prof. Salvatore Cuomo ANNO ACCADEMICO

2 Crescere vuol dire avere il coraggio di non strappare le pagine della nostra vita ma semplicemente voltare pagina. Crescere significa riuscire a superare i grandi dolori senza dimenticare. Crescere significa avere il coraggio di guardare il mondo e di sorridere. Crescere significa guardarsi indietro e abbracciare i ricordi senza piangere. Crescere è saper distinguere la realtà dai sogni. Crescere è sapersi rialzare dopo una brutta caduta. Crescere... non tutti hanno voglia di crescere... forse perché sono consapevoli delle difficoltà che incontreranno crescendo... James Douglas Morrison (Jim Morrison)

3 RINGRAZIAMENTI Ed eccomi qui, finalmente!... a scrivere l ultimo capitolo di questa tesi, quello più importante, quello che racconta realmente la tua esperienza, l avventura che hai vissuto. Per mia fortuna sono capitato in un laboratorio pieno di persone che dal primo giorno hanno cercato di mettermi a mio agio facendomi sentire subito parte integrante del gruppo. Da chi partire se non dai capi... il primo ringraziamento va al prof. Peron, che nel momento del bisogno ha saputo comprendere le mie difficoltà e consigliarmi da padre più che da professore. Poi c è l altro boss, il dott. Di Bernardo o più semplicemente Diego, come ha voluto lo chiamassi dal primo giorno... una persona come dico sempre a chi mi chiede, da un dono speciale... quello di riuscire ad essere sempre nei tempi giusti amico dei suoi studenti e capo intransigente e severo che tutti temono. Tolto il pensiero dei boss, posso passare ai ringraziamenti dedicati ai ragazzi (non più tutti oramai, a buon intenditor poche parole ;- ) ). Il primo ringraziamento è dedicato al mio dottorando, che devo dire la verità ha una pazienza infinita visto che mi ha dovuto sopportare e soprattutto spiegare parecchie cose di cui non avevo mai sentito parlare... <<grazie Vinc!>> Un altro ringraziamento speciale, va alla Siciliano, che non smetterò mai di ripetere essere una grande attrice... <<Ve, il web ci ricorderà!>>... detto ciò siccome dici sempre che non ti faccio mai un complimento, oggi ti dico che sei una bellissima persona, allegra e piena di vita... non scordarlo mai... Da Velia non posso far altro che passare a Rossella, spesso dispensatrice di saggi consigli... stacanovista per definizione, alla quale auguro tanta fortuna, per i sacrifici che fa e che presto frutteranno... ha però un grande difetto... è troppo freddolosa! Parlando delle persone del mio cuore (bioinformatico) preferito, non posso non ringraziare Marghe che gli piace uscire dalle torte (o erano porte?)... dolcissima persona (sarà per le torte?), che ringrazio anche perché ha dedicato un intero giorno a calcolare una matrice dei dati normalizzati per me... che poi per mio errore era anche sbagliata e quindi ho dovuto cestinare... ma d altronde se non combino pasticci non sono io (Velia tu ne sai qualcosa vero? Basta solo che ti ricordi le parole chiavi dell auto ).

4 E poi sempre lì, da quelle parti, nel cuore bioinformatico, c è anche Gopu... che pur di scambiare qualche parola con me è stato costretto ad imparare qualche parola in italiano!!... se rassegnato pure lui... ma io non mollo!! Tornando al lab invece, non posso dimenticare i due dell acquario... Francesco e Mario, che poverini quest estate hanno sofferto un bel po li dentro, viste le temperature africane di quella stanza... ricorderò per sempre Francesco come compagno di scarpe a Bologna (o si ricorderanno per sempre di noi quelli che passavano vicino alla finestra dove la sera le poggiavamo?... ai posteri l ardua sentenza...) Un duplice ringraziamento va a Giulia (duplice perché c era anche Iolanda nel pancione), che con la sua allegria è capace di rendere le giornate di lavoro più leggere... <<Giù! Torna presto che Lucia non ce la fa più!!>> Mamma mia quanti ne siamo... ci sono ancora Filippo, Alda e Maria Aurelia... Maria Aurelia, la donna dai dolci squisiti, piccola ma piena di determinazione... Alda alla quale auguro ogni bene... e Filippo l ingegnere oramai californiano. Ora posso passare agli amici quelli storici, Davide e Diego. Amici fin dalle superiori... le strade si sono spesso divise ma poi rincontrate... questa è l ennesima dimostrazione che l amicizia vera non è quella in cui ci si vede o ci si sente tutti giorni... Poi c è Maria, che mi è stata vicina nei momenti difficili... a volte anche con troppa apprensione, ma solo perché si preoccupava per me... grazie. Ringrazio Sara, una persona a cui vorrò sempre un mondo di bene, con la quale sono cresciuto e che mi ha accompagnato per quasi tutto il mio percorso universitario... non dimenticherò mai tutti i bei ricordi che ho... In fine, mi rimane un ultima persona, che giunta a questo punto si starà chiedendo: <<ed io dove so?, quelli del lab già li ha fatti tutti...>>. Eccoti qui... infine ringrazio la montanara Lucia... spirito libero... una persona speciale, che troppo spesso dimentica di esserlo... che mi ha aiutato più di quanto non crede... compagna di forchette bolognesi... <<Sci Sci... grazie Lu!>>. un ringraziamento particolare va alla mia famiglia 4

5 INDICE INTRODUZIONE 7 1. NOZIONI ELEMENTARI DI BIOLOGIA IL DNA L RNA LA TRASCRIZIONE L UTILIZZO DEI MICROARRAYS PER LO STUDIO DEI TRASCRITTOMI LE RETI DI REGOLAZIONE GENETICA ANALISI DEL PROBLEMA INTRODUZIONE INTRODUZIONE ALLE BANCHE DATI BIOLOGICHE DATABASE DI SEQUENZE BASI DI DATI DI ESPRESSIONI GENICHE BASI DI DATI CONTENENTI MUTAZIONI/POLIMORFISMI BASI DI DATI PROTEOMICHE BASI DI DATI DI DOMINI/FAMIGLIE DI PROTEINE BASI DI DATI DI STRUTTURE TRIDIMENSIONALI BASI DI DATI DI PATHWAY BIOLOGICI BASI DI DATI BIBLIOGRAFICHE ALTRO (BASI DI DATI SPECIALIZZATE O BOUTIQUE ) OBIETTIVO DELLA RICERCA I MICROARRAY AFFYMETRIX MINIMUM INFORMATION ABOUT MICROARRAY EXPERIMENT INVESTIGATION DESCRIPTION FORMAT (IDF) FILE SAMPLE AND DATA RELATIONSHIP FORMAT (SDRF) FILE LE INFORMAZIONI MINIME CHE IL SISTEMA DEVE ESSERE IN GRADO DI ESTRARRE REQUISITI FUNZIONALI DEL SISTEMA LA PIATTAFORMA PER LO STUDIO DELLA CELLULA INTRODUZIONE ARCHITETTURA DEL SISTEMA IL PROCESSO DI NORMALIZZAZIONE INTRODUZIONE LA SCELTA DEL FORMATO DEI FILE DA CUI IMPORTARE I DATI I CAMPI D INTERESSE NEI FILE SDRF LA NORMALIZZAZIONE DEI TERMINI LE ONTOLOGIE 59 5

6 4.2 LO STRUMENTO SEMI- AUTOMATICO PER LA COSTRUZIONE DEL VOCABOLARIO DEI TERMINI CONSIDERAZIONI FINALI SULLA FASE DI NORMALIZZAZIONE IL DATABASE DELLE ESPRESSIONI GENICHE INTRODUZIONE L AMBIENTE DI SVILUPPO COSTRUZIONE DEL DATA- SET E STATISTICHE SUI DATI IL CLIENT FTP JAVA STATISTICHE SUL DATASET STRUTTURE DATI PER LA GENERAZIONE DELLE STATISTICHE LO SCHEMA DEL DATABASE TECNICHE PER IL MIGLIORAMENTO DELLE PRESTAZIONI L IMPLEMENTAZIONE DEGLI ALBERI ONTOLOGICI NEL DATABASE LA TECNICA DI PARTIZIONAMENTO DELLE TABELLE IL PARSING DEI FILE PER IL POPOLAMENTO DEL DATABASE IL WAREHOUSE PER L ANALISI DEI DATI INTRODUZIONE LA MISURA DI SIMILARITÀ TRA I GENI LA REGRESSIONE LINEARE L INDICE DI CORRELAZIONE DI PEARSON APPLICAZIONE DEL COEFFICIENTE DI CORRELAZIONE NOZIONI ELEMENTARI SUI DATA WAREHOUSE MODELLIZZAZIONE DEL WAREHOUSE L INSERIMENTO DEI DATI 99 7.RISULTATI E CONCLUSIONI INTRODUZIONE RISULTATI CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI INDICE DELLE FIGURE BIBLIOGRAFIA 108 6

7 INTRODUZIONE In ambito biologico, una delle più importanti sfide per i ricercatori è rappresentata dal cercare di individuare quale possano essere le funzioni svolte da un gene e come insiemi di geni interagiscono tra loro per assolvere a tali funzioni. Per tali scopi gli strumenti più idonei sono rappresentati oggi giorno dai microarray, un punto di riferimento per ricercatori e professionisti che lavorano nel campo della biomedicina e delle scienze biologiche. A differenza dei classici metodi di ricerca, con i microarray si ha la possibilità di identificare centinaia di geni contemporaneamente, fornendo la possibilità ai ricercatori di tutto il mondo di eseguire un analisi genetica su larga scala. Dalla sua nascita negli anni novanta, la tecnologia dei microarray, ha avuto una rapida crescita sia per quanto riguarda le tecniche di sperimentazione vere e proprie che per l analisi statistica dei dati. Questo anche perché molti dei metodi classici possono non portare a risultati significativi in tale campo in quanto studiare le singole componenti (geni) di un sistema biologico è molto diverso dall analizzarlo nel suo insieme. Il dover studiare il comportamento di migliaia di geni contemporaneamente, ha fornito lo stimolo necessario a coinvolgere ricercatori di altre discipline, quali: l informatica, la matematica, la statistica. La multidisciplinarietà richiesta da questa nuova scienza ha portato alla nascita di nuove figure professionale come il bioinformatico o il biostatistico. Le enormi quantità di dati biologici prodotti dai microarray hanno reso necessario l utilizzo delle scienze informatiche, per l analisi ed il modelling dei dati. Il seguente lavoro di tesi è stato svolto presso il TIGEM (Telethon Institute of Genetics and Medicine) con la supervisione del dott. Diego di Bernardo e del Ph.D. Vincenzo Belcastro. Il progetto ha come principale obiettivo quello di costruire un sistema informativo in grado di ospitare dati di espressione genica ottenuti mediante utilizzo della tecnologia dei microarray. Il sistema che si intende sviluppare, deve permettere l analisi dei dati di espressione genica nei diversi tessuti, fornendo informazioni univoche sulla co- regolazione di un insieme di geni in un determinato tessuto sfruttando in maniera intergrata le informazioni attualmente disponibili sotto forma di risorsa pubblica. Nella prima parte del lavoro di tesi si sono ampiamente analizzati i vari standard utilizzati dai biologi per la memorizzazione (presentati in dettaglio nel Capitolo 2 paragrafo 5) dei dati riguardanti un esperimento di espressione genica. Il passo successivo è stato quello di 7

8 recuperare dal database ArrayExpress gli esperimenti di interesse al fine di costruire un database delle espressioni geniche (Capitolo 5) che permettesse il recupero di ibridazioni effettuate su specifici tessuti o tipi cellulari e di effettuare interrogazioni più specifiche rispetto a quelle attualmente risolvibili dagli attuali sistemi di analisi automatica. Affinché fosse possibile utilizzare i dati prelevati dai database pubblici si è resa necessaria (Capitolo 4) una fase di normalizzazione e ri- annotazione dei termini presenti nei dati recuperati dal database di riferimento (ArrayExpress), seguendo specifiche ontologie (Capitolo 4, paragrafo 4.1). La fase di normalizzazione delle annotazioni ha reso possibile catalogare in modo rigoroso le ibridazioni. Ciò ha reso possibile estrarre ibridazioni con particolari caratteristiche (riguardanti uno specifico tessuto, tipo cellulare, etc.) ed analizzarle ottenendo informazioni specifiche riguardanti un particolare tessuto o altre caratteristiche. A partire dalla matrice dei dati normalizzati, possiamo considerare ciascuna riga (ogni riga è un probe set o gene) come una variabile per la quale sono state effettuate! misure (una per ciascuna delle ibridazioni) e calcolare le correlazioni r rispetto a ciascuna delle altre righe, ottenendo così una nuova matrice, che possiamo chiamare matrice delle correlazioni tra geni riguardante un tessuto o tipo cellulare (Capitolo 6, paragrafi 2.1, 2.2, 2.3). Queste misure di similarità tra i geni sono poi state memorizzate in nuovo sistema costruito utilizzando strutture tipiche del data warehousing (Capitolo 6) in modo da manipolarle ed analizzarle al meglio. Il sistema costruito aveva l obbiettivo di rispondere alla seguente forma di query: Dato il gene A e la misura di similarità Z trovare tutti i geni "simili" ad A nel tessuto X della specie Y. Con l implementazione finale del sistema, a partire da un gene è possibile recuperare tutti quelli maggiormente correlati in un tessuto prefissato ed analizzando i suoi vicini tramite la gene ontology enrichment analysis (GOEA) è possibile provare ad inferire la sua funzione (Capitolo 7). Ad esempio supponiamo di prendere un gene le cui funzioni sono conosciute come IGLC1, responsabile del complesso di produzione di immunoglobuline (anticorpi). Estraendo dal sistema i geni correlati (ad esempio nel tessuto sangue) ed applicando la gene ontology 8

9 enrichement analysis su questi si mostra che le funzioni più probabili di tale gene riguardano effettivamente quelle a cui prende parte (Capitolo 7, paragrafo 2). Il seguente elaborato è articolato in sette capitoli più la bibliografia. Nel Capitolo 1 si danno alcune nozioni elementari legate alla biologia, utili per una maggiore comprensione dell elaborato. Il Capitolo 2 è dedicato all introduzione nel mondo dei database biologici ed in particolare degli standard utilizzati per la pubblicazione degli esperimenti effettuati con microarray nelle banche date internazionali. Nel Capitolo 3 si descrive l architettura del sistema da implementare. Nel Capitolo 4 viene presentato il processo di normalizzazione dei termini e la ri- annotazione degli stessi tramite l ausilio di ontologie. Il Capitolo 5 invece è dedicato alla presentazione del database delle espressioni geniche costruito. Il Capitolo 6 invece descrive l utilizzo delle strutture di warehousing per la memorizzazione delle correlazioni tra geni. Il Capitolo 7 in fine è dedicato alla discussione dei risultati ed alle conclusioni e gli sviluppi futuri. 9

10 1. NOZIONI ELEMENTARI DI BIOLOGIA 1. IL DNA Il DNA (acido desossiribonucleico) [1] è la molecola biologica più importante senza la quale la vita non potrebbe né cominciare né continuare, è depositaria dell informazione genetica e trasmette i caratteri ereditari da una cellula all altra e dai genitori ai figli. Il DNA ha il compito importantissimo di dirigere la formazione delle proteine mediante quella serie d operazioni denominate espressione genica; divenendo dunque l architetto che dirige e regola la formazione di ogni essere vivente. Il DNA è organizzato in unità definite geni, responsabili dunque delle caratteristiche principali della maggior parte degli organismi viventi [2]. I geni sono generalmente stabili, poiché sono tramandati di generazione in generazione, seppur soggetti a piccole variazioni, chiamate mutazioni, anch esse ereditate dalle generazioni future. La maggior parte dei geni viene utilizzata come stampo per la sintesi di proteine, costituenti fondamentali di tutte le cellule, che sono molecole molto complesse costituite dalla successione di 20 tipi diversi di aminoacidi che si combinano in vario modo, conferendo a ciascuna molecola proprietà uniche. Le unità di base che costituiscono il DNA sono i nucleotidi, molecole composte da uno zucchero (desossiribosio), un gruppo fosfato ed una base azotata. Le basi azotate comprendono le purine: adenina (A) e guanina (G) e le pirimidine: timina (T) e citosina (C). La disposizione in sequenza di queste quattro basi costituisce l'informazione genetica. I nucleotidi sono legati fra loro con legami covalenti per formare uno scheletro zucchero- fosfato. Il carbonio 3 di uno zucchero è legato al gruppo fosfato in posizione 5 dello zucchero adiacente, costituendo un legame 3 5 fosfodiesterico. In questo modo è quindi possibile formare polimeri di lunghezza indefinita. Qualunque sia la lunghezza della catena, esisterà sempre un carbonio 5 ad una estremità ed un carbonio 3 all altra estremità che non è legato ad un altro nucleotide. La struttura del DNA è costituita da due catene polinucleotidiche, tenute insieme da legami specifici che si formano tra le basi azotate, avvolte a formare una doppia elica. Tale struttura può essere paragonata ad una sottile scala a chiocciola con una ringhiera su 10

11 ciascun lato, dove le ringhiere sono costituite da uno zucchero e da un acido fosforico che si alternano regolarmente ed i sottili gradini che si estendono a migliaia da una ringhiera all altra invece, sono formati ognuno da due basi affiancate. L accoppiamento tra le due basi che formano uno stesso gradino non è casuale, poiché la base A può accoppiarsi soltanto con la base T e la base C con la base G. In tal modo si possono ottenere soltanto due tipi di gradini che la cui successione risulta in infinite combinazioni, specificità che rappresenta il punto centrale della struttura del DNA. Questo tipo d associazione determina la complementarietà delle due eliche, le quali per poter combaciare devono essere orientate in direzioni opposte (una 3 5 e l altra 5 3 ). FIGURA 1 - LA STRUTTURA A DOPPIA ELICA DEL DNA 11

12 2. L RNA L RNA presenta una struttura polinucleotidica simile a quella del DNA. Tre delle quattro basi azotate (adenina, guanina e citosina) che formano i nucleotidi del RNA sono le stesse che per il DNA, la quarta è l uracile (U) che sostituisce la timina non presente nel RNA. Come nelle molecole di DNA, i polinucleotidi di RNA contengono legami fosfodiesterici 3-5, meno stabili di quelli di un polinucletide di DNA; ragione per cui le funzioni biologiche dell RNA richiedono che il polinucleotide sia lungo, al massimo, poche migliaia di nucleotidi. Ogni cellula può contenere diverse molecole di RNA; per comprenderne meglio le loro funzioni possiamo inizialmente suddividerle in due grandi categorie: RNA codificante ed RNA non codificante. L RNA codificate è composto da una sola classe di molecole: gli RNA messaggeri (mrna), sono trascritti dalle informazioni codificate nei geni e danno vita alle proteine al completamento dell ultimo passaggio dell espressione genica (raramente superano il 4% dell RNA totale nella cellula). L RNA non codificante comprende trascritti che hanno varie funzioni e le due categorie principali presenti sia negli eucarioti che nei procarioti sono: gli RNA ribosomiali (rrna), che sono parte integrante dei ribosomi, ossia le particelle dove ha luogo la sintesi proteica; gli RNA transfer (trna), piccole molecole coinvolte nella sintesi proteica che hanno il compito di trasportare gli aminoacidi ai ribosomi in modo tale da permettere che vengano uniti nell ordine specificato dalla sequenza nucleotidica dell mrna. Altre forme di RNA non codificati possono poi essere specifici all interno di organismi differenti (vedi figura 2). 12

13 RNA totale RNA codificante 4% del totale RNA non codificante 96% del totale Pre- mrna (hnrna) Pre- rrna Pre- trna snrna snorna scrn A tmrna e vari altri tipi LEGENDA Tutti gli organismi Soltanto gli eucarioti mrn A rrna trna Soltanto i batteri FIGURA 2 - LE CATEGORIE DI RNA 13

14 3. LA TRASCRIZIONE Il processo mediante il quale l informazione contenuta nei geni è convertita in una macromolecola funzionale, tipicamente proteine, è detto espressione genica. L espressione genica è il processo più frequente e complesso e richiede l intervento di agglomerati proteici quali ribosoma e polimerasi In maniera semplificata il processo di espressione genica può essere suddiviso in due passaggi: 1. trascrizione (conversione del DNA in RNA); 2. traduzione (conversione di RNA in proteine). Il prodotto della prima fase, chiamato trascrittoma, è l insieme di tutte le molecole di RNA ottenute trascrivendo le informazioni codificate nelle sequenze geniche. Il prodotto della seconda parte è il proteoma, l insieme delle proteine presenti all interno della cellula ottenute traducendo le molecole di RNA prodotto della prima fase dell espressione genica. Come anticipato, questo schema è una semplificazione di quello che è uno dei processi più complessi in natura. Più dettagliatamente, l espressione genica comprende le seguenti fasi: l accesso al genoma, poiché il DNA è impacchettato nei cromosomi in maniera complessa, bisogna assicurarsi che i geni interessati siano fisicamente accessibili; l assemblaggio del complesso di inizio della trascrizione, nel quale sono coinvolte un insieme di proteine che lavorano in modo coordinato per copiare i geni in RNA; la sintesi dell RNA, durante la quale il gene è trascritto in RNA; il processamento dell RNA, durante la quale la struttura chimica delle molecole di RNA può essere modificata prima di essere tradotte in proteine; la degradazione dell RNA; l assemblaggio del complesso di inizio della traduzione; la sintesi proteica, ossia la traduzione di una molecola di RNA in proteina; il ripiegamento e la maturazione delle proteine, che possono avvenire o meno contemporaneamente; la degradazione proteica, anche essa parte integrante dell espressione genica. 14

15 Il processo di trascrizione viene avviato tramite il legame di particolari enzimi (RNA polimerasi) a determinate sequenze regolatrici poste di solito al 5 dei geni, chiamate promotori (che non vengono trascritte), le quali fungono da modulatori dell espressione genica. Tramite la trascrizione viene prodotto un altro acido nucleico, l RNA, utilizzato poi come stampo per la sintesi di proteine mediante il processo di traduzione. Prima di essere tradotto, l RNA subisce una serie di modifiche che portano alla sua maturazione. Questo perché in realtà, specialmente negli eucarioti, sono sintetizzate molecole di RNA precursori come il pre- mrna dal quale si ricava poi mrna utile per lo stampo della proteina (vedi figura precedente). Inoltre la maggior parte dei geni sono discontinui, ossia solo alcuni tratti di sequenza sono utilizzati per sintetizzare proteine dette esoni, mentre quelli non codificanti sono dette introni. Il processo di maturazione del pre- mrna può essere effettuato mediante due operazioni: editing dell RNA: gruppi di nucleotidi sono propriamente immessi nella sequenza di RNA, dando luogo ad una nuova sequenza utilizzata poi per lo stampo proteico; splicing alternativo: gli introni vengono eliminati dall RNA precursore, mentre le sequenze esoniche possono essere combinate in qualsiasi ordine. 15

16 FIGURA 3 - L'EDITING DELL' RNA E LO SPLICING ALTERNATIVO La maturazione dell RNA, dunque, fa si che una sequenza proteica possa non corrispondere esattamente alla sequenza del gene da cui deriva. Inoltre come si può notare anche dalla figura precedente, da un precursore di RNA possono essere ricavati anche due o più mrna codificanti. Sebbene il trascrittoma costituisca meno del 4% dell RNA totale di una cellula, esso è il componente più importante poiché contiene l RNA codificante che specifica la composizione del proteoma e determina, quindi, le proprietà biochimiche della cellula. Anche nei più semplici organismi, possono essere attivi diversi geni contemporaneamente, rendendo così i trascrittomi molto complessi, dal momento che possono contenere centinaia se non migliaia di mrna contemporaneamente. 16

17 4. L UTILIZZO DEI MICROARRAYS PER LO STUDIO DEI TRASCRITTOMI Tradizionalmente, la ricerca in biologia molecolare si è occupata dello studio intensivo di uno, o pochi geni alla volta. Quando i progetti di ricerca cominciarono a identificare un enorme numero di geni, si cominciò a pensare di sviluppare tecnologie che permettessero un analisi di geni su vasta scala. A tale scopo è stata messa a punto una nuova tecnologia basata su un supporto fisico chiamato microarray. I microarray permettono di misurare simultaneamente l espressione di migliaia di geni. I microarrays sono piccoli vetrini che contengono una serie ordinata di campioni. Il tipo di microarray dipende dal materiale posizionato sul vetrino: DNA (si parla di DNA microarray), RNA (RNA microarray), tessuto (tissue microarray). Poiché i campioni sono posizionati in modo ordinato (si dice che i geni sul microarray sono indirizzabili), è sempre possibili risalire al gene mappato su una particolare area del vetrino; il numero di campioni sul microarray come detto possono essere nell ordine delle migliaia. Il più comune microarray utilizzato è il DNA microarray (comunemente conosciuto come gene chip, DNA chip, o biochip) che è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida come vetro, plastica, o chip siliconici formanti un array. Il supporto di solito è un vetrino da microscopio che ha le dimensioni, più o meno, di un pollice della mano. Ogni sonda è costituita da un segmento di DNA a singola elica (parte della sequenza di un gene) e nel loro insieme, tutte le sonde di un DNA chip rappresentano tutti o la maggior parte dei geni di un organismo. I microarray possono essere fabbricati usando diverse tecnologie, come la stampa di micro solchi, con un particolare microspillo appuntito su una lastrina di vetro dove verrà attaccata covalentemente la sonda (probe) di materiale genetico ottenuta per clonazione sfruttando la tecnica PCR, (fotolitografia); usando maschere preformate da ditte specializzate come ad esempio da Greiner Bio- One. Un tipico esempio delle attività lavorative [3] svolte durante la realizzazione di un esperimento con microarray è mostrato nella figura successiva. Come esempio di applicazione dei microarray consideriamo l identificazione dei geni specificatamente espressi, o non espressi, in un tessuto tumorale rispetto al relativo tessuto normale. Dato un DNA microarray, il passo successivo è quello di ottenere i campioni necessari per l etichettatura e l ibridazione. L etichettatura dell RNA consiste di tre passi: 1. Isolare l RNA da tessuto o cellule. 17

18 2. Etichettare l RNA tramite una procedura inversa di trascrizione inserendo dei marcatori fluorescenti (solitamente Cy3 e Cy5 per i two- color array, e Cy3 per i one- color array) ottenendo così campioni di cdna (DNA complementare). 3. Purificazione dei prodotti ottenuti. I campioni etichettati ottenuti possono poi essere ibridizzati su due microarrays distinti (one- color array) oppure possono essere miscelati e ibridizzati in un singolo microarray (two- color array), ciò dipende dal tipo di microarray utilizzato. FIGURA 4 - ESEMPIO DI UN TIPICO ESPERIMENTO EFFETTUATO UTILIZZANDO MICROARRAY DI DNA 18

19 Le posizione in cui si ha l ibridazione indicano gli oligonucleotidi che rappresentano i geni i cui trascritti sono presenti nel trascrittoma. La fase di analisi dei risultati consiste nella scansione dei vetrini per la lettura del segnale e della sua normalizzazione; solitamente si utilizzano dei tool commerciali. L operazione di scansione produce in output i seguenti dati: (1) le immagine grezze delle ibridazioni (solitamente in formato tiff); (2) Un insieme di dati grezzi ricavati direttamente dalle immagini. Sui dati grezzi si effettuano opereazioni di normalizzazione al fine di rendere i dati confrontabili tra loro, ottenendo in genere una matrice contenente i livelli di espressioni di ogni probeset (memorizzata in un documento spreadsheet). FIGURA 5 - LA FIGURA MOSTRA COME DA OGNI MICROARRAY SI OTTENGA LA MATRICE DELLE ESPRESSIONI GENICHE. Un classico esperimento può essere così riassunto: più microarray vengono ibridati sotto differenti condizioni sperimentali (heat- shock, somministrazione di un farmaco ecc.) delle popolazioni di cellule osservate. Un tale esperimento da come risultato una matrice di dati, in cui le righe rappresentano i geni monitorati e le colonne corrispondono alle diverse condizioni sperimentali. Ogni elemento della matrice rappresenta quindi il livello di espressione di un singolo probe in una delle ibridazioni. Ciascuna colonna è data dunque da uno dei campioni osservati. 19

20 FIGURA 6 - ESEMPIO DI MATRICE DEI DATI NORMALIZZATI. 20

21 5. LE RETI DI REGOLAZIONE GENETICA I microarray di espressioni geniche forniscono dati quantitativi e semi- quantitativi sullo stato di una cellula in specifiche condizioni e nel tempo, misurando simultaneamente l espressione genica di migliaia di geni. La biologia molecolare sta, dunque, rapidamente evolvendo in una scienza quantitativa. L idea è di inferire (reverse- engineer di sistemi biologici) dai dati riguardanti espressioni geniche le interazioni regolative tra geni utilizzando degli algoritmi computazionali [4], rappresentando tali iterazioni attraverso un grafo in cui ciascun nodo rappresenta un gene ed un arco un legame (un interazione) tra due geni. Le strategie per il reverse- engineering di sistemi biologici, possono essere divise in due categorie: 1. strategie fisiche (physical interaction): nelle quali si identificano le proteine (Fattori di trascrizione) che regolano la trascrizione e le sequenze di DNA sulle quali queste legano per attivare la trascrizione del gene target (promotori); 2. strategie d influenza (influence interaction): nelle quali si cerca di identificare l influenza che esiste tra gli mrna (trascritto da un gene), in modo relazionare l espressione di un gene con tutti gli altri geni che esso regola, o da cui e regolato, nella cellula. Consideriamo soltanto il secondo approccio: l interazione tra due geni in una rete di geni, non necessariamente implica un interazione fisica, ma può anche riferirsi solamente ad una regolazione indiretta (tramite proteine, metaboliti o ncrna che non sono stati misurati direttamente). Si noti che l influence interaction include la physical interaction, in alcuni casi infatti i trascritti che influenzano la trascrizione di altri trascritti, possono codificare per fattori di trascrizione che legano proprio sul promotore dei trascritti stessi. L utilità del modello di rete genetica utilizzando l approccio influence interaction sono varie tra cui: 1. identificare il sottoinsieme di geni che regola ogni altro (tramite interazioni dirette o indirette); 2. predire il comportamento del sistema a seguito di perturbazioni dello stesso. Ciò consiste nel costruire dei modelli di reti di geni utili a predire la risposta di una rete ad una perturbazione esterna e ad identificare il gene direttamente colpito 21