San Camillo e Forlanini

Транскрипт

1 ANNALI DEGLI OSPEDALI San Camillo e Forlanini Volume 11, Numero 4, Ottobre - Dicembre 2009 Direttore FRANCO SALVATI Comitato di Redazione ALFONSO ALTIERI, FRANCESCO BELLI (Redattore capo), MAURO CALVANI, GIUSEPPE CARDILLO, PAOLO MATTIA, GIOVANNI MINARDI (Coordinatore), MAURIZIO MORUCCI, FABRIZIO NESI, BRUNO NOTARGIACOMO, SERGIO PILLON, ELIO QUARANTOTTO, PIETRO SACCUCCI, MICHELE SCOPPIO, GIANDOMENICO SEBASTIANI, ALESSANDRO SEVERINO Segreteria di Redazione: RITA VESCOVO, ALMERINDA ILARIA Comitato Scientifico-Editoriale Coordinatore ROBERTO CANOVA LOREDANA ADAMI, MARIO GIUSEPPE ALMA, CATERINA AMODDEO, DONATO ANTONELLIS, GIANLUCA BELLOCCHI, FRANCO BERTI, FRANCO BIANCO, ELSA BUFFONE, PIO BUONCRISTIANI, ALESSANDRO CALISTI, ILIO CAMMARELLA, ALBERTO CIANETTI, ENRICO COTRONEO, FRANCESCO CREMONESE, ALBERTO DELITALA, FILIPPO DE MARINIS, SALVATORE DI GIULIO, CLAUDIO DONADIO, VITTORIO DONATO, GIUSEPPE MARIA ETTORRE, ALDO FELICI, LAURA GASBARRONE, CLAUDIO GIANNELLI, EZIO GIOVANNINI, LUCIA GRILLO, MASSIMO LENTINI, ANNA LOCASCIULLI, IGNAZIO MAJOLINO, CARLO MAMMARELLA, LUCIO MANGO, EMILIO MANNELLA, LAURO MARAZZA, MIRELLA MARIANI, MASSIMO MARTELLI, ANTONIO MENICHETTI, GIOVANNI MINISOLA, CINZIA MONACO, FRANCESCO MUSUMECI, REMO ORSETTI, PAOLO ORSI, GIOVACCHINO PEDICELLI, VINCENZO PETITTI, LUCA PIERELLI, ROBERTO PISA, LUIGI PORTALONE, GIOVANNI PUGLISI, SANDRO ROSSETTI, ENRICO SANTINI, EUGENIO SANTORO, GIOVANNI SCHMID, CIRIACO SCOPPETTA, CORA STERNBERG, GIUSEPPE STORNIELLO, PIERO TANZI, ROBERTO TERSIGNI, ANNA RITA TODINI, CLAUDIO TONDO, MIRELLA TRONCI, ROBERTO VIOLINI Segreteria: GIOVANNA DE PAOLA ROMA Società Editrice Universo

2 Azienda Ospedaliera San Camillo-Forlanini Roma Direttore Generale: Luigi Macchitella Direttore Sanitario: Diamante Pacchiarini Direttore Amministrativo: Antonino Giliberto ROMA Società Editrice Universo Abbonamenti 2009 Italia: istituzionali 100,00; privati 73,00 Estero: istituzionali 200,00; privati 146,00 Il prezzo di ogni fascicolo (solo per l'italia) è di 20,00, se arretrato 40,00 Per la richiesta di abbonamenti e per la richiesta di inserzioni pubblicitarie rivolgersi a Società Editrice Universo s.r.l., Via G.B. Morgagni, 1, Roma, Italia Tel ; Fax ; [email protected] Garanzia e riservatezza per gli abbonati L editore garantisce la massima riservatezza dei dati forniti dagli abbonati e la possibilità di richiederne gratuitamente la rettifica o la cancellazione scrivendo a: Società Editrice Universo s.r.l., Via G.B. Morgagni, 1, Roma, Italia Le informazioni custodite nell archivio elettronico della Società Editrice Universo s.r.l., verranno utilizzate al solo scopo di inviare agli abbonati vantaggiose proposte commerciali (legge 675/96). Direttore responsabile: Franco Salvati Iscrizione al registro della Stampa n. 176/98 con ordinanza del Tribunale di Roma in data 6/5/1998 Copyright Società Editrice Universo s.r.l., Finito di stampare nel mese di Dicembre 2009 dalla Tipostampa s.rl. - Lama di S. Giustino (PG) I diritti di traduzione, di riproduzione e di adattamento, totale o parziale, con qualsiasi mezzo (compresi i microfilm e le copie fotostatiche), in lingua italiana, sono riservati per tutti i paesi.

3 ANNALI DEGLI OSPEDALI San Camillo e Forlanini Volume 11, Numero 4, Ottobre - Dicembre 2009 Contenuto EDITORIALE Il cammino di una idea ambiziosa "I Primi tre anni " F. SALVATI 195 An ambitious idea in progress "The first three years " ARTICOLI ORIGINALI Basi biologiche ed applicazioni terapeutiche delle cellule "cytokine-induced killer" A. PERILLO, G. BONANNO. G. SCAMBIA, L. PIERELLI 197 Biological bases and therapeutic applications of "cytokine-induced killer cells" Il trapianto di cellule staminali da sangue di cordone ombelicale M.B. PINAZZI, B. MONTANTE, A. LOCASCIULLI, I. MAJOLINO 203 Umbilical cord blood stem cell transplantation Genetica della emocromatosi ereditaria S. MAJORE, F. BINNI, P. GRAMMATICO 214 Genetic hereditary hemochromatosis FOCUS: SARCOIDOSI Introduzione C. RAIMONDI 224 La sarcoidosi: quadri radiologici F. QUAGLIARINI 225 Aspetti istopatologici della sarcoidosi polmonare P. GRAZIANO 229 La sarcoidosi: ruolo della fisiopatologia respiratoria F. ARIENZO 231 Sarcoidosi polmonare: la diagnostica broncoscopica G. GALLUCCIO, G. LUCANTONI, P. BATTISTONI, S, BATZELLA, V. LUCIFORA, R. DELLO IACONO 232 Il BAL nello studio della sarcoidosi R. GASBARRA, A. DI LORENZO, M. BRONZINI 237 Esperienza di un ambulatorio per la sarcoidosi C. RAIMONDI, A.M. ALTIERI, M. CICCARELLI, S. D'ANTONIO, M.G. ALMA 240 Terapia della sarcoidosi con anti-tnfα P. ROTTOLI, C. OLIVIERI, E. BARBAGLI 244 GESTIONE E ORGANIZZAZIONE SANITARIA Salute globale: i determinanti della salute e le conclusioni del rapporto dell'oms a cura della Commissione sui determinanti sociali della salute C. RESTI 250 Global health: health determinants and the final report by who's Commission on social determinants of health

4 La Rivista è stata selezionata da ELSEVIER BV BIBLIOGRAPHIC DATABASES per l indicizzazione nei databases EMBASE, SCOPUS, COMPEDEX, GEOBASE, EMBIOLOGY, ELSEVIER BIOBASE, FLUIDEX E WORLD TEXTILES

5 ANNALI DEGLI OSPEDALI San Camillo e Forlanini Volume 11, Numero 4, Ottobre - Dicembre 2009 Editoriale IL CAMMINO DI UNA IDEA AMBIZIOSA I Primi tre anni AN AMBITIOUS IDEA IN PROGRESS The first three years FRANCO SALVATI* Sotto svariati profili è stato di grande rilevanza per l Azienda Ospedaliera San Camillo- Forlanini il triennio e ben lo delinea il Volume ad esso dedicato, curato da Alberto Bersani (marzo 2009, pagg. 84). Nella Presentazione del Dott. Luigi Macchitella, Direttore Generale, viene resa con grande chiarezza la filosofia e le strategie ispiratrici del percorso che ha portato - tra l altro - alla riformulazione del Atto Aziendale e alla ridefinizione sia degli assetti organizzativi che delle regole e delle procedure. Nel Volume questo percorso si snoda attraverso 16 capitoli in cui vengono illustrati i dettagli relativi ai singoli settori. In particolare nel capitolo Formazione e Governo Clinico: anni viene sottolineato l impegno nel campo dell aggiornamento, della formazione e dell educazione continua ed al riguardo viene rimarcata altresì la funzione della Biblioteca dell Azienda soprattutto per quel che concerne l obbiettivo di creare una rete di servizi che siano di supporto alla ricerca, alla didattica ed alla crescita della vita culturale degli Operatori della Sanità, trattandosi di Biblioteca specializzata in campo biomedico e dotata di materiale periodico con la finalità di facilitare l accesso all informazione scientifica. In questo contesto è da sottolineare che la Biblioteca è sede della Direzione della Rivista Scientifica Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini (nata nel 1999) e del Comitato di Redazione della Rivista stessa la quale nell arco temporale ha ricevuto e pubblicato (attualmente edita dalla prestigiosa Società Editrice Universo S.E.U.) numerosi lavori scientifici molti dei quali nella parte dedicata a Gestione e Organizzazione Sanitaria, lavori tutti provenienti anche da Autori stranieri e da Autori esterni all Azienda operanti in qualificate Istituzioni sia Ospedaliere che Universitarie dislocate per quanto concerne quelle italiane su tutto il territorio nazionale ma anche rivolti con visus internazionale alle attività di Cooperazione Ospedaliera ai Paesi in via di sviluppo. Il percorso degli Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini nel triennio in questione ha in un certo qual modo accompagnato parallelamente, di pari passo, tutte le numerose realizzazioni che sono state puntualmente dettagliate nel Volume, tra le quali quelle relative al Bilancio Sociale (Curare prendendosi cura, Le Giornate dell etica della cura, Dialogo e Solidarietà, ecc.). Un altro capitolo di grande rilievo è quello nel cui ambito va collocato il Numero Unico della Rivista dedicato esclusivamente all istituzione ed all attività del Centro per i Trapianti d Organo. Inserita nel circuito internazionale dell ELSEVIER BV Bibliographic Databases e pertanto indicizzata nei databases EMBASE,SCOPUS,COMPEDEX, GEOBA- SE, EMBRIOLOGY, ELSEVIER BIOBASE, * Primario Pneumologo Emerito, Direttore della Rivista Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini

6 196 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 FLUIDEX, WORLD TEXTILES, la Rivista si integra pienamente con quegli obbiettivi dell Azienda Ospedaliera che hanno come prima sottolineato la finalità di promuovere l aggiornamento e di favorire la crescita culturale in ambito sanitario multiprofessionale corrispondendo in tal modo all auspicio espresso, come pubblicato sulla Rivista stessa, dal Dott. Luigi Macchitella al momento del suo insediamento quale Direttore Generale:realizzare anche attraverso gli Annali e all impegno di quanti vi collaborano la idea ambiziosa di fare dell Azienda un prestigioso edificio, centro propulsore e polo di attrazione. La pubblicazione, che qui segue di articoli sulle cellule staminali, in cui è riportata l esperienza e la progettualità di altrettanti gruppi di ricerca della nostra Azienda, a valenza internazionale, sono una ulteriore testimonianza di quanto sopra auspicato.

7 ANNALI DEGLI OSPEDALI San Camillo e Forlanini Volume 11, Numero 4, Ottobre- Dicembre 2009 Articoli originali BASI BIOLOGICHE ED APPLICAZIONI TERAPEUTICHE DELLE CELLULE CYTOKINE-INDUCED KILLER BIOLOGICAL BASES AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF CYTOKINE-INDUCED KILLER CELLS ALESSANDRO PERILLO 1, GIUSEPPINA BONANNO 1,2, GIOVANNI SCAMBIA 1, LUCA PIERELLI 2* 1 Dipartimento per la Tutela della Salute della Donna e della Vita Nascente, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma; 2 Dipartimento di Medicina Trasfusionale, Laboratorio Cellule Staminali e Terapie Cellulari, Az. Osped. S.Camillo-Forlanini, Roma Parole chiave: Cellule CIK. Terapia cellulare. Immunoterapia Key words: CIK cells. Cell-therapy. Immunotherapy Riassunto Le cellule cytokine-induced killer (CIK) rappresentano una popolazione di cellule T citotossiche con caratteristico fenotipo CD3 + CD56 +, identificata in tessuti sia umani che murini, da Lanier et al. nel Tali cellule sono dotate di notevole attività citotossica contro un ampia varietà di cellule tumorali. La loro azione citotossica non è ristretta per il sistema maggiore di istocompatibilità (MHC) né è il risultato di una citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), ma dipende dal contatto cellula CIK/cellula bersaglio, coinvolgendo le molecole di adesione e l esocitosi del contenuto di granuli citotossici. Le cellule CIK possono essere derivate da sangue periferico umano dopo espansione ex vivo in presenza di interferon-γ, di anticorpi monoclonali diretti contro il CD3, e di interleuchina-2. Le cellule CIK hanno dimostrato in studi preclinici e clinici promettenti effetti antitumorali contro diverse neoplasie, come le leucemie, l epatocarcinoma, il cancro polmonare, renale, gastrico, ovarico e cervicale. Abstract Cytokine-induced killer (CIK) cells are a population of cytotoxic T cells with typical CD3 + CD56 + phenotype, identified in both human and murine tissues by Lanier et al. in These cells are endowed with a high cytotoxic activity against a wide variety of cancer cells. Their cytotoxicity is not major histocompatibility complex (MHC)-restricted, neither antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)-dependent, but is due to CIK cell/target cell contact with the involvement of adhesion molecules and exocytosis of cytotoxic granules. CIK cells can be derived from human peripheral blood after ex vivo expansion with interferon-γ, anti-cd3 antibodies and interleukin-2. CIK cells showed promising antitumor effects against various cancers, including leukemia, hepatic, lung, renal, gastric, ovarian and cervical cancer, in preclinical and clinical studies. Aspetti biologici Negli ultimi 20 anni, sono state esplorate varie strategie per attivare cellule effettrici del sistema immune in grado di distruggere cellule tumorali residue o resistenti dopo trattamenti oncologici convenzionali. In questo contesto, i linfociti con fenotipo CD3 - CD56 + coltivati in presenza di alte con- centrazioni di interleuchina-2 (IL-2) danno origine a cellule lymphokine-activated killer (LAK). Tuttavia le cellule LAK presentano una bassa attività citotossica antitumorale, ed una difficoltà di espansione per poter essere utilizzate in ambito clinico; inoltre la loro attività necessita una somministrazione continua in vivo di IL-2 alla quale è associata tossicità.

8 198 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Un altra possibilità è quella basata sui linfociti che infiltrano le neoplasie, denominati tumor-infiltrating lymphocytes (TIL), con fenotipo CD3 + CD8 + CD56 +, che esercitano una citotossicità contro le cellule tumorali autologhe ristretta per il sistema maggiore di istocompatibilità (MHC). Tali cellule possono essere espanse in vitro con concentrazioni medio-basse di IL-2 per poi essere infuse nel paziente. I TIL riconoscono il tumore attraverso meccanismi mediati dal T-cell receptor (TcR); tuttavia risulta difficile la loro espansione in vitro e non possono essere isolati da tumori di piccole dimensioni. Alte dosi di TIL possono essere infuse senza tossicità, ma la loro efficacia è legata alla contemporanea somministrazione di alte dosi di IL-2 alla quale è invece associata una significativa tossicità 1. Una strategia alternativa è invece basata sulla possibilità di espandere cellule mononucleate di sangue periferico in presenza di interferon-γ (IFN-γ), IL-2 ed un anticorpo monoclonale contro l antigene di superficie CD3 (OKT3). Come risultato, si ottiene una popolazione cellulare con fenotipo e proprietà sia delle cellule T che delle cellule natural killer (NK). Tali cellule sono state denominate cytokine-induced killer (CIK) da Schmidt-Wolf e Negrin 2,3 per distinguerle da quelle NK. Le cellule CIK rappresentano dunque una popolazione di cellule T con caratteristico fenotipo CD3 + CD56 + ; esse costituiscono circa il 3% dei linfociti circolanti e sono state identificate in tessuti sia umani che murini da Lanier et al. nel Tali cellule, alla colorazione di Giemsa, sono morfologicamente simili ai grandi linfociti: hanno un diametro di 16-20μ, abbondante citoplasma e numerosi granuli citoplasmatici. Le cellule CIK sono dotate di notevole attività citotossica e sono in grado di lisare un ampia varietà di cellule tumorali. La loro citotossicità non è MHC-ristretta e, dal momento che non esprimono il CD16 (recettore Fcγ), non sono in grado di attivare una antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). La loro citotossicità è invece mediata dal contatto cellula CIK/ cellula bersaglio, coinvolgendo le molecole di adesione con esocitosi del contenuto di granuli citotossici 5. Tali granuli citotossici contengono: (i) proteine pore-forming, denominate perforine o citolisine; (ii) granzimi (una famiglia di serin-esterasi); (iii) enzimi lisosomiali; (iv) molecole di proteoglicano. Le cellule CIK effettrici riconoscono le cellule tumorali bersaglio e rilasciano i loro granuli citotossici nello spazio extracellulare nel punto di contatto con le cellule bersaglio stesse; a questo punto le perforine lisano le cellule bersaglio e i granzimi ne inducono l apoptosi. Sono stati descritti due meccanismi di degranulazione. Il primo, mediato dal lymphocyte function-associated antigen (LFA-1), determina una citolisi indotta dai granuli. Il secondo, TcR-dipendente, agisce invece attraverso la stimolazione dei recettori CD3 e CD3-simili sulle cellule CIK, determinando una citolisi mediata dai granuli. Entrambi i meccanismi sono sensibili agli aumenti intracellulari dei livelli di cyclic adenosine monophosphate (camp). Il primo meccanismo è dominante; infatti gli anticorpi anti-lfa-1 e anti- intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) bloccano la lisi delle cellule tumorali mediata dalle cellule CIK, mentre gli anticorpi diretti contro le molecole del sistema human leukocyte antigen (HLA) di I e II classe, espresse dalle cellule bersaglio, o quelli diretti contro TcRα/β, CD3, CD4, CD8 e CD56 non bloccano l attività citolitica delle cellule CIK. Le cellule CIK posseggono anche un alto livello di attività citotossica contro linee cellulari tumorali resistenti agli agenti chemioterapici e, per tale motivo, possono essere utili nell aggredire malattie caratterizzate da resistenza farmacologica. Infatti anticorpi monoclonali contro la glicoproteina-p (Pgp), responsabile della multi-drug resistance, non bloccano la lisi, da parte delle cellule CIK, di cellule tumorali resistenti alla chemioterapia. Questo indica che la Pgp, non è direttamente coinvolta nell interazione fra cellula bersaglio tumorale e cellule CIK effettrici. Recentemente è stato dimostrato che l azione citotossica delle CIK è mediata anche dal recettore NK di gruppo 2D (NKG2D); infatti anticorpi che bloccano l espressione del NKG2D inibiscono la citotossicità delle cellule CIK. Le cellule CIK hanno attività antitumorale, sia in vitro che in vivo, nei riguardi di un ampio spettro di linee cellulari neoplastiche: OCI-Ly8, SU- DHL-4 (due differenti linee di linfoma umano a cellule B), K562, blasti di leucemia mieloide cronica di origine sia autologa che allogenica, e linee cellulari multidrug resistant. Nello stesso tempo, non è stato dimostrato alcun effetto tossico delle cellule CIK sui normali progenitori emopoietici CD34 +.

9 A. Perillo et al.: Immunoterapia con cellule CIK 199 Le cellule CIK possono essere espanse in vitro 6000 volte dopo 21 giorni di coltura in presenza di IFN-γ. Quest ultimo stimola i monociti a produrre IL-12, che porta le cellule ad esprimere il fenotipo Th1, e ha un azione sinergica con l anticorpo monoclonale anti- CD3, inducendo la proliferazione delle cellule T. L anticorpo monoclonale anti-cd3 agisce inoltre come stimolo mitogenico per tutte le cellule T, che possono espandersi in presenza di IL-2. Dopo tre settimane di coltura, le cellule T si differenziano in due popolazioni: cellule CD3 + CD56 + e CD3 + CD56 - che possono essere ottenute da pazienti con varie patologie emopoietiche, e, per la loro attività in vivo dopo trapianto, non necessitano di somministrazione esogena di IL-2. Nel contesto allogenico, le cellule CIK, grazie alla produzione di IFN-γ, hanno dimostrato di determinare, a fronte di un attività graft-versus-leukemia (GvL), scarso o assente effetto graft-versus-host disease (GvHD) 6. Applicazioni terapeutiche: l immunoterapia adottiva Per alcune tipologie di tumore, l uso della chemioterapia e della radioterapia convenzionali, insieme alla resezione chirurgica, non sempre garantiscono un efficacia terapeutica. Per tale motivo, nell ultimo decennio, la ricerca oncologica ha concentrato il suo interesse anche sullo studio delle interazioni che intercorrono tra il sistema immunitario e la neoplasia, con l obiettivo di identificare un meccanismo che possa essere adeguatamente sfruttato per eliminare specificamente le cellule neoplastiche, in particolare quelle esprimenti antigeni immunogenici sulla loro superficie. Infatti, nonostante gli straordinari progressi registrati nel trattamento delle malattie tumorali, sia nella chirurgia radicale che nella chemioterapia e radioterapia, l insorgenza della resistenza ad ognuna delle ultime due, o ad entrambe, rappresenta ancor oggi uno dei problemi di più difficile gestione nella cura del paziente oncologico. Uno degli strumenti più efficaci per evitare o attenuare lo sviluppo della farmacoresistenza, oltre a potenziare l attività citotossica di nuovi chemioterapici, e, in ultima analisi, migliorare la risposta terapeutica, è quello di esaltare le competenze del sistema immunitario del paziente che viene così messo in grado di eliminare completamente le cellule tumorali che comunque residuano. Tuttavia, sia a causa della malattia stessa che per l azione di molte delle molecole ad attività antineoplastica, il sistema immunitario del paziente oncologico risulta depresso. Lo sviluppo attuale delle conoscenza della moderna immunologia consente oggi di intravedere la concreta possibilità di prevenire e curare le neoplasie con gli stessi criteri che hanno condotto con successo alla cura e prevenzione delle malattie infettive, sviluppando metodologie terapeutiche in grado di uccidere la cellula tumorale senza indurre effetti collaterali incidenti sulla qualità di vita. È opinione concorde che il sistema immunitario non riesce a combattere efficacemente lo sviluppo dei tumori perché questi ultimi mettono in atto una serie di meccanismi di elusione che solo da poco tempo si riesce a definire e comprendere con sufficiente chiarezza nella loro complessità 7. Infatti, nonostante esista una chiara evidenza che la progressione della malattia nei pazienti neoplastici avvenga sotto il diretto controllo del sistema immunitario, è ugualmente evidente che le cellule neoplastiche sono in grado, a loro volta, di selezionare raffinati meccanismi per sfuggirne il controllo tra cui la crescita del tumore in spazi privilegiati, la secrezione di fattori immunosoppressivi, la selezione di varianti neoplastiche resistenti e l induzione di tolleranza immunitaria. È quindi necessario adottare strategie in grado di aggirare le difese messe in atto dal tumore e rendere quest ultimo suscettibile all azione antitumorale. Una di queste strategie consiste nell utilizzare contro il tumore cellule del sistema immunitario dello stesso paziente educate a combattere le cellule tumorali fuori dall organismo. Questa procedura, variamente definita come immunoterapia adottiva o immunoterapia cellulare fa parte del più vasto quadro delle terapie cellulari. L immunoterapia (cellulare) adottiva (detta anche passiva) si pratica infondendo direttamente nel paziente gli effettori cellulari specifici dell immunità antitumorale generati ex vivo. A differenza di quanto avviene nell immunoterapia attiva, il vantaggio dell immunoterapia adottiva risiede nella possibilità di evitare gli impedimenti generati dalla parziale immuno-incompetenza dei pazienti portatori

10 200 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 di tumore, che potrebbero ostacolare la generazione di una efficace risposta antitumorale in vivo. È noto infatti che nel paziente oncologico la sorveglianza del sistema immunitario sul tumore è stata soppressa o elusa a seguito dell incapacità dell ospite di riconoscere gli antigeni tumorali, della tolleranza verso il self, della produzione di sostanze immunosoppressive, della generazione di varianti da parte del tumore primitivo, od altro. Aspetti critici sono la necessità di isolare ed espandere un numero di cellule effettrici sufficiente ad indurre una risposta efficace e persistente nel tempo, e l adozione di terapie adiuvanti mirate a migliorare la funzione e la sopravvivenza delle cellule reinfuse o a promuovere l induzione di un milieu (es: infiammatorio) favorente l attivazione delle cellule stesse. E comunque, anche l immunoterapia cellulare adottiva non è esente dall influenza negativa di fattori di immunosoppressione (es: le cellule T-regolatorie). In ultima analisi, l immunoterapia cellulare adottiva è una strategia terapeutica che ha come obiettivo il riconoscere le cellule tumorali ed indurre una risposta immune specifica in grado di causare la lisi delle cellule neoplastiche; il suo potenziale effetto antitumorale è stato già ampiamente documentato in studi condotti su modelli animali ed in sperimentazioni cliniche 2,3,8,9. In questo contesto, le cellule CIK hanno dimostrato in studi preclinici e clinici promettenti effetti antitumorali contro diverse neoplasie ematologiche, come le leucemie 10, o solide quali l epatocarcinoma 11, il cancro polmonare 12, renale 13, gastrico 14 e ovarico 15. Un recente studio ha inoltre evidenziato un effetto inibitorio delle cellule CIK sulla crescita del cervicocarcinoma umano sia in vitro che in vivo dopo xenotrapianto nel modello murino 16. Sono inoltre disponibili in letteratura dati clinici preliminari ottenuti utilizzando cellule CIK in casistiche ancora limitate di pazienti. Per quanto riguarda i risultati ottenuti mediante utilizzo di cellule CIK di derivazione allogenica, in pazienti affetti da neoplasie ematologiche recidivanti dopo trapianto allogenico (leucemie, linfomi, mielodisplasie), Introna et al. hanno dimostrato che la produzione di cellule CIK è fattibile e la loro reinfusione ben tollerata ed in grado di contribuire ad una risposta clinica. In particolare, su 11 pazienti arruolati, sono state osservate 1 stabilizzazione di malattia, 1 miglioramento ematologico e 3 risposte cliniche complete 6. Per quanto riguarda invece l uso di cellule CIK autologhe, i risultati di un recente studio pilota di Olioso et al. hanno evidenziato che l immunoterapia adottiva con tali cellule è, anche in questo caso, sicura e dotata di un promettente livello di efficacia terapeutica sia in neoplasie ematologiche avanzate (6 casi di linfoma) che in tumori solidi metastatici (5 casi di carcinoma renale e 1 caso di epatocarcinoma). Su un totale di 12 pazienti arruolati sono state ottenute 3 risposte complete (in 1 linfoma, 1 carcinoma renale e 1 epatocarcinoma) e 2 stabilizzazioni di malattia con una mediana di follow-up di 33 mesi 5. Progetto di studio Nell ambito dei tumori solidi ginecologici, il carcinoma della cervice uterina è caratterizzato, in caso di diagnosi precoce, da una buona prognosi dopo trattamento con chirurgia radicale o radiochemioterapia. La radiochemioterapia concomitante è fortemente consigliata nei casi di carcinoma localmente avanzato; tuttavia, le pazienti con malattia metastatica o recidivante ottengono risultati terapeutici scadenti con opzioni di trattamento limitate. Nelle recidive di cervicocarcinoma, sono ragionevolmente candidate ad un secondo tentativo di cura solo quelle pazienti con malattia a localizzazione centrale nella pelvi e che non mostrino segni clinici di metastatizzazione linfonodale o a distanza. Tranne rare eccezioni, in tutti gli altri casi si può realisticamente parlare solo di terapie palliative. Prescindendo dalla modalità di trattamento, le pazienti con carcinoma cervicale recidivante mostrano globalmente una sopravvivenza a 24 mesi del 10-15%, la quale scende drammaticamente al di sotto del 5% a 5 anni. Il trattamento suggerito per le pazienti con recidiva pelvica dopo chirurgia radicale è la radioterapia o, in particolari circostanze, l eviscerazione pelvica. Globalmente, i risultati terapeutici sono comunque insoddisfacenti con tassi di cura generalmente inferiori al 5%. I migliori risultati si rilevano nei casi di recidiva pelvica isolata di piccolo volume, con sopravvivenze a 5 anni comunque non superiori al 20-30%. Gli studi sull efficacia della chemioterapia nella

11 A. Perillo et al.: Immunoterapia con cellule CIK 201 malattia recidivante o metastatica con farmaci citotossici a dosi standard, da soli o in combinazione, condotti su un numero adeguato di pazienti, sono concordi nell indicare basse percentuali di attività terapeutica e percentuali di risposta molto variabili (10-25%), che solo in alcune casistiche superano il 40%. Raramente si sono registrate risposte complete, che sono comunque di breve durata. Fino ad oggi non è stato ancor identificato un trattamento innovativo in grado di migliorare ulteriormente la sopravvivenza nel cancro metastatico o recidivante della cervice uterina, ed in questo contesto sono necessari nuovi approcci terapeutici per diminuire la mortalità e la morbidità nelle pazienti. A tale scopo, nell ambito di una Convenzione stipulata tra l Azienda Ospedaliera San Camillo-Forlanini e l Università Cattolica del Sacro Cuore, che prevede una diversificata gamma di collaborazioni scientifiche e cliniche tra il Dipartimento di Medicina Trasfusionale (DMT) Roma Ovest Direttore il prof. Luca Pierelli, il Dipartimento Materno Infantile Direttore il prof. Claudio Donadio, dell Azienda Ospedaliera San Camillo-Forlanini e il Dipartimento Tutela della Salute della Donna e della Vita Nascente Direttore prof. Giovanni Scambia dell Università Cattolica del Sacro Cuore è stato elaborato un progetto di studio. Tale progetto di fase I/II si propone di valutare la fattibilità e l attività di una immunoterapia adottiva con cellule CIK autologhe in tumori ginecologici a prognosi molto sfavorevole quali i carcinomi metastatici o recidivanti della cervice uterina non responsivi ai trattamenti convenzionali. La produzione delle cellule CIK avverrà presso il laboratorio Cellule Staminali e Terapie Cellulari sito nel Dipartimento di Medicina Trasfusionale dell Azienda San Camillo-Forlanini, in seguito all autorizzazione ottenuta dall Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA), che ha riconosciuto alla Struttura i requisiti richiesti per la produzione di medicinali per terapia cellulari e al direttore del Dipartimento suddetto i titoli e l esperienza per svolgere tale attività sotto la propria responsabilità e direzione tecnica (in base al Decreto Legislativo 6 novembre 2007, n. 200). L espansione delle cellule CIK verrà effettuata a partire da linfociti raccolti, mediante procedura di leucoaferesi, dalla stessa paziente che riceverà il trattamento. La terapia con cellule CIK verrà effettuata su singole pazienti in mancanza di valida alternativa terapeutica, nei casi di urgenza ed emergenza che pongono la paziente in pericolo di vita o di grave danno alla salute, nonché nei casi di grave patologia a rapida progressione. Tale terapia cellulare sarà effettuata sotto la responsabilità professionale del medico, in esecuzione di una prescrizione medica individuale per un prodotto specifico destinato ad un determinato paziente, in ottemperanza al Regolamento (CE) N. 1394/2007 del Parlamento Europeo e del Consiglio del 13 novembre Le preparazioni cellulari saranno effettuate nel rispetto dei requisiti di qualità farmaceutica approvati dall Istituto Superiore di Sanità. I materiali utilizzati per la produzione ed espansione delle cellule CIK dovranno essere prodotti in good manufacturing practice (GMP); le citochine utilizzate (IFN-γ, IL-2, OKT3) saranno quelle per utilizzo clinico, fornite dalla farmacia ospedaliera di appartenenza della paziente. La procedura di raccolta ed espansione, con relativo cambio di terreno di coltura e aggiunta delle citochine, avverrà in un sistema chiuso mediante l utilizzo di apposite sacche. Ogni settimana verrà effettuata la conta emocromocitometrica, l analisi citofluorimetrica del fenotipo cellulare, i controlli microbiologici per endotossine e batteri, e lo studio citogenetico per la valutazione di alterazioni cromosomiche. Alla paziente verranno somministrate 1x10 7 cellule CIK per kg, ad intervalli di 3 settimane, e verrà valutata la tossicità locale e sistemica durante e dopo il trattamento. Prima del trattamento e durante il follow-up verranno effettuate le opportune valutazioni clinico-strumentali. Bibliografia 1. Leemhuis T, Wells S, Scheffold C, et al. A phase I trial of autologous cytokine-induced killer cells for the treatment of relapsed Hodgkin disease and non-hodgkin lymphoma. Biol Blood Marrow Transplant 2005; 11: Schmidt-Wolf IG, Negrin RS. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine induced killer cells with potent antitumor cell activity. J Exp Med 1991; 174: Schmidt-Wolf IG, Lefterova P, Mehta BA, et al. Phenotypic characterization and identification

12 202 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 of effector cells involved in tumor cell recognition of cytokine-induced killer cells. Exp Hematol 1993; 21: Lanier LL, Phillips JH, Hackett J Jr, et al. Natural killer cells: definition of a cell type rather than a function. J Immunol 1986; 137: Olioso P, Giancola R, Di Riti M, et al. Immunotherapy with cytokine induced killer cells in solid and haematopoietic tumours: a pilot clinical trial. Hematol Oncol 2009; (Epub ahead of print) 6. Introna M, Borleri G, Conti E, et al. Repeated infusions of donor-derived cytokine-induced killer cells in patients relapsing after allogeneic stem cell transplantation: a phase I study. Haematologica 2007; 92: Dunn GP, Bruce AT, Ikeda H, et al. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 2002; 3: Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM. Observations on the systemic administration of autologous Lymphokine-activated killer cells and recombinant IL-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med 1985; 313: Rosenberg SA, Spiess PS, Lafreniere R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor infiltrating lymphocyte. Science 1986; 233: Kornacker M, Moldenhauer G, Herbst M, et al. Cytokine-induced killer cells against autologous CLL: direct cytotoxic effects and induction of immune accessory molecules by interferon-gamma. Int J Cancer 2006;119: Takayama T, Sekine T, Makuuchi M, et al. Adoptive immunotherapy to lower postsurgical recurrence rates of hepatocellular carcinoma: a randomised trial. Lancet 2000; 356: Kim HM, Lim J, Park SK, et al. Antitumor activity of cytokine-induced killer cells against human lung cancer. Int Immunopharmacol 2007;7: Schmidt-Wolf IG, Finke S, Trojaneck B, et al. Phase I clinical study applying autologous immunological effector cells transfected with the interleukin-2 gene in patients with metastatic renal cancer, colorectal cancer and lymphoma. Br J Cancer 1999; 81: Sun S, Li XM, Li XD, Yang WS. Studies on inducing apoptosis effects and mechanism of CIK cells for MGC-803 gastric cancer cell lines. Cancer Biother Radiopharm 2005; 20: Kim HM, Kang JS, Lim J, et al. Inhibition of human ovarian tumor growth by cytokine-induced killer cells. Arch Pharm Res 2007; 30: Kim HM, Lim J, Kang JS, et al. Inhibition of human cervical carcinoma growth by cytokineinduced killer cells in nude mouse xenograft model. Int Immunopharmacol 2009; 9: Corrispondenza e richiesta estratti: Prof. Luca Pierelli, [email protected]

13 ANNALI DEGLI OSPEDALI San Camillo e Forlanini Volume 11, Numero 4, Ottobre- Dicembre 2009 IL TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI DA SANGUE DI CORDONE OMBELICALE UMBILICAL CORD BLOOD STEM CELL TRANSPLANTATION MARIA BEATRICE PINAZZI, BARBARA MONTANTE, ANNA LOCASCIULLI 1, IGNAZIO MAJOLINO Unità Operativa di Ematologia e Trapianto di Cellule Staminali, 1 Unità Operativa di Pediatria ed Ematologia Pediatrica, Azienda Ospedaliera S.Camillo-Forlanini, Roma Introduzione Le cellule staminali emopoietiche (CSE) sono elementi presenti nel midollo osseo capaci di riprodurre interamente l emopoiesi dopo trapianto e dotate pertanto di capacità di auto-rinnovamento e di differenziazione 1. Il trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT: hematopoietic stem cell transplantation) rappresenta il trattamento di scelta per numerose condizioni neoplastiche e non, sia ematologiche che non-ematologiche. Esso consiste nell infondere al ricevente, solitamente per via endovenosa, un numero adeguato di CSE precedentemente prelevate da un donatore sano HLA-compatibile. L HSCT è preceduto da un trattamento immuno-mieloablativo (regime di condizionamento) ed è seguito da una terapia immunosoppressiva che ha il fine di favorire l attecchimento e di prevenire la complicanza più frequente: la graft-versus-host disease (GVHD, malattia da trapianto contro l ospite) nelle sue forme acuta e cronica. Gli scopi del trapianto sono: 1. sostituire con un tessuto ematologicamente ed immunologicamente normale il midollo osseo del paziente 2. sfruttare l effetto graft-versus-leukemia (GvL: reazione del trapianto contro la leucemia), sostenuto dai linfociti T del donatore. L effetto GvL si basa sull alloreattività nei confronti dei tessuti del ricevente e quindi anche della popolazione leucemica e rappresenta la terapia immuno-mediata peculiare del trapianto allogenico. Le cellule staminali sono residenti nel midollo osseo ma possono essere spinte a migrare nel torrente circolatorio sotto appropriati stimoli; si trovano normalmente anche nel cordone ombelicale del neonato come espressione di una fase precoce (fetale) dell emopoiesi. Col tempo si è giunti ad impiegare correntemente le seguenti sorgenti di cellule staminali emopoietiche: a. midollo osseo b. sangue venoso periferico c. sangue di cordone ombelicale caratteristiche e vantaggi sono riassunti nella tabella 1. Le principali indicazioni all HSCT sono rappresentate da: a. Malattie ematologiche acquisite: leucemia acuta, anemia aplastica, leucemia mieloide cronica, mieloma multiplo e patologie linfoproliferative in fase avanzata. b. Malattie congenite ematologiche e non: anemia di Fanconi, anemia di Blackfan- Diamond, talassemia, drepanocitosi, osteopetrosi, errori congeniti del metabolismo. c. Tumori solidi: neuroblastoma e sarcoma dei tessuti molli. Il limite principale che si pone all esecuzione del trapianto è rappresentato dalla disponibilità di un donatore HLA-compatibile. Nella pratica quotidiana, più di un terzo dei pazienti in cui vi sarebbe indicazione al trapianto non

14 204 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Tabella 1. Confronto tra le sorgenti di cellule staminali Midollo Osseo PBSC mobilizzate con G-CSF Cordone Ombelicale raccolta in anestesia generale numero di cellule raccolte: N. medio di MNC: 2 x10^8 /kg N. medio CD34+: 2x10^6 /kg N. medio linfociti T: 2.2x10^7 /kg Raccolta semplice, non anestesia generale Possibili effetti collaterali del fattore di crescita granulocitario (G- CSF) numero di cellule raccolte: N. medio di MNC: 9 x10^8 /kg N. medio CD34+: 7 x10^6 /kg N. medio di linfociti T: 27 x10^7 /kg Raccolta semplice e senza rischi Immediata disponibilità dell unità e basso rischio di malattie trasmissibili Parziale mismatches HLA: consentito numero di cellule raccolte: N. medio MNC: 0.3 x10^8 /kg N. medio CD34+: 0.2x10^6 /kg N. medio di linocitif T: 0.4 x10^7 /kg dispone di un donatore familiare. In questi casi si può ricorrere ai registri internazionali di donatori volontari ma, a causa del polimorfismo del sistema HLA, la ricerca non porta all identificazione di un potenziale donatore in una percentuale dei casi superiore al 30%. Oltre a ciò i tempi di ricerca sono spesso troppo lunghi in rapporto all urgenza del trapianto: la mediana è infatti di 3-4 mesi dall avvio della procedura 2. Per ovviare a questo inconveniente si può ricorrere all impiego di donatori con una compatibilità solo parziale, sia consanguinei che non; tali trapianti sono però gravati da una più elevata mortalità trapianto-correlata (transplant related mortality, TRM). Il trapianto di cellule staminali da cordone ombelicale (UCB, umbilical cord blood) non correlato rappresenta una possibile soluzione ad alcune di queste limitazioni. Le cellule staminali di UCB trapiantate in soggetti di basso peso corporeo, cioè sostanzialmente in età pediatrica, sono in grado di ricostituire l emopoiesi dopo terapia di condizionamento mieloablativo e, essendo immunologicamente meno mature di quelle adulte, rendono accettabile una maggiore disparità HLA tra donatore e ricevente. Con gli anni, dopo i primi successi clinici e le numerose esperienze di laboratorio, l uso del cordone è andato estendendosi da una popolazione costituita esclusivamente da pazienti pediatrici 3 anche a pazienti adulti. Occorre precisare tuttavia che nell adulto l utilizzo di UCB è reso problematico dal basso contenuto di cellule emopoietiche e progenitori staminali in relazione al peso corporeo. Per ovviare a questo problema si è ricorsi a due modalità innovative: 1. l uso di due o più UCB per uno stesso paziente 2. l infusione di UCB direttamente nelle cavità midollari delle creste iliache. Il cordone ombelicale come sorgente di cellule staminali emopoietiche Il primo trapianto di CSE da cordone è stato eseguito con successo nel 1988 in un bambino affetto da anemia di Fanconi utilizzando sangue di cordone ombelicale del neonato fratello HLA-identico 4. Da allora si sono susseguite numerose segnalazioni in letteratura, prevalentemente in ambito pediatrico, che hanno sancito l efficacia e la fattibilità della procedura utilizzando cordoni da donatori familiari HLA-identici, familiari HLA-mismatched e donatori non consanguinei e l utilizzo di questa sorgente di CSE è andato aumentando nel corso degli ultimi anni 5 (Tabella 2). Nel 1992 sono sorte le prime banche di cordone ombelicale a New York, Parigi, Milano e Düsseldorf, ed altre se ne sono aggiunte successivamente. Attualmente vi sono nel mondo 46 banche in 23 paesi, e 33 di queste contribuiscono al data-base mondiale BMDW (Bone Marrow Donors Worldwide). Secondo dati IBMDR (Italian Bone Marrow Donor Tabella 2. Trapianti da donatore non familiare e sorgente di cellule staminali, anni (dati IBMDR Italian Bone Marrow Donor Registry) anno Sorgente di CSE per trapianto Cordone 10% 13% 19% Sangue venoso periferico 4% 42% 49% Midollo osseo 86% 45% 32%

15 M.B. Pinazzi et al.: Il trapianto di cellule staminali da sangue di cordone ombelicale 205 Registry), aggiornati al 31 dicembre 2008, nel mondo le unità cordonali criopreservate sono circa e vengono raccolte circa unità all anno. In Italia abbiamo 18 banche con unità bancate di cui sono state tipizzate ed inserite nel data-base IBMDR. Di queste ne sono state rilasciate 887 a scopo di trapianto, distribuite come segue: Italia 34%, Europa 32%, USA 24%, Sud America 4%, Canada 2%, Australia 2%, Israele 1%, Asia 1%. (Dati IBMDR/istituto Superiore di Sanità 31/12/2008, La ricerca e l identificazione di una UCB per un potenziale trapianto hanno tempi piuttosto brevi dal momento che le unità di cordone vengono sistematicamente tipizzate per i loci HLA -A, -B a bassa risoluzione e -DRB1 ad alta risoluzione prima della criopreservazione: in uno studio è stato calcolato che per l identificazione e la disponibilità di un cordone occorrono in media 13,5 giorni 6. Anche le modalità di consegna delle unità selezionate dal centro richiedente sono veloci e ben programmabili; tutto questo si traduce nel vantaggio di limitare l attesa per il trapianto, fattore di primaria importanza in pazienti senza un donatore familiare HLA-identico e con malattia ad alto rischio di recidiva. Caratteristiche del sangue cordonale I vasi placentari e del cordone ombelicale contengono elementi cellulari staminali con caratteristiche simili a quelle del soggetto adulto, ma con alcune importanti differenze che le rendono del tutto peculiari anche per la finalità del trapianto: il sangue placentare contiene un numero di progenitori sufficienti a determinare la ricostituzione emopoietica nell animale letalmente irradiato; anche nel sangue placentare umano sono presenti progenitori emopoietici capaci di formare colonie in vitro (CFU, CFU-Bl e LTC-IC) 7, 8, esse sono in numero superiore al midollo osseo e al sangue periferico 9 ed hanno una maggiore capacità di auto-rinnovamento ed una maggiore capacità proliferativa 10. Il loro livello di immaturità e la ridotta reattività immunologica comportano una ridotta incidenza e severità della GvHD 11. Le cellule staminali cordonali possono essere considerate delle cellule somatiche unrestricted in quanto non solo sono in grado di ricostituire il compartimento emopoietico ma possono dare origine ad altri tessuti. Infatti il sangue cordonale contiene: cellule staminali mesenchimali, cellule staminali endoteliali, cellule CD34+ CD11b+ che hanno capacità differenziativa verso cellule endoteliali, ed infine cellule VEGF-R3+ CD34+ che hanno elevata capacità di espansione e mantenimento della funzione angiogenetica in vivo 12. Processazione e criopreservazione del sangue cordonale Il sangue placentare e cordonale viene prelevato dalla vena ombelicale, che subito dopo la nascita viene incannulata con apposito ago; viene raccolto in una sacca con anticoagulante, vengono prelevate le aliquote per gli esami di legge e si procede a centrifugazione del campione con separazione del supernatante ricco di leucociti che viene trasferito in una sacca più piccola. I leucociti sedimentati sono risospesi nel plasma ottenendo un volume totale di circa 20 ml che viene sottoposto a criopreservazione in azoto liquido con aggiunta di dimetilsulfossido 13. La procedura non comporta rischi né per la madre né per il neonato (Fig. 1). Selezione dell unità di sangue cordonale Tre importanti caratteristiche distinguono il trapianto di cellule staminali da cordone da quello di cellule staminali da midollo e da sangue periferico (Tabella 3): Fig. 1. Raccolta del sangue del cordone ombelicale

16 206 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Tabella 3. Benefici e limiti del trapianti di CSE da cordone ombelicale Vantaggi Rapida disponibilità Minore compatibilità HLA richiesta GVHD meno frequente e meno severa Nessun rischio per il donatore per le minoranze etniche: maggiore probabilità di trovare UCB con identità HLA almeno 4/6 e con dose cellulare adeguata Svantaggi Bassa cellularità Possibile variabilità nella qualità dell UCB allo scongelamento Ritardato attecchimento Ritardato recupero immunologico Aumentato rischio infettivo 1. il minor grado di compatibilità HLA richiesto; 2. il minor numero di cellule staminali; 3. la disponibilità pressoché immediata dell unità selezionata. La selezione dell unità cordonale avviene in primo luogo sulla base del grado di compatibilità per il sistema HLA. Lo standard attuale per la selezione di un unità è rappresentato dalla tipizzazione a bassa o intermedia risoluzione per i loci A e B e ad alta risoluzione (livello allelico) per il DRB1. Il grado di disparità consentito, che nei trapianti standard di midollo è (massimo) di 1 antigene, in questo caso può essere anche di 3 (consigliato max 2). Secondo gli standard IBMDR una UCB viene considerata utilizzabile quando le disparità antigeniche sono al massimo due in prima classe (HLA A,B) ovvero una in classe I (HLA A,B) e una al locus DRB1 a livello allelico. Ciò consente una maggiore frequenza di assegnazione delle UCB al potenziale candidato rispetto a quanto avviene per i campioni di midollo osseo 6. Il fattore limitante più importante per l assegnazione di un UCB è rappresentato dal numero totale delle cellule mononucleate (CMN): la dose adeguata, calcolata sulla base del peso corporeo, è difficile da raggiungere quando il ricevente è un soggetto adulto 14 o comunque di peso superiore a 40 kg. Sebbene il potenziale rigenerativo e la capacità di ripopolare il compartimento emopoietico da parte delle CSE di cordone siano più spiccati rispetto alle CSE da sangue midollare o periferico, rimane il fatto che il numero totale di CMN di un unita di sangue cordonale è mediamente 10 volte (1 log) inferiore a quello contenuto in un campione di midollo osseo. Gluckman e coll. hanno dimostrato un recupero più rapido della conta dei polimorfonucleati neutrofili quando l UCB infusa conteneva un numero di CMN > 3.7 x 10 7 /kg 5. In generale il numero minimo di CMN per effettuare un trapianto da cordone dovrebbe essere > x 10 7 /kg 15. Anche il numero di progenitori emopoietici CD34+ (cellule staminali emopoietiche pluripotenti determinabili in citometria a flusso) ha un impatto significativo sull attecchimento e sulla sopravvivenza globale (overal survival, OS): OS a 5 anni del 60% nei pazienti che hanno ricevuto una dose di cellule CD34+ >2.3 x 10 5 /kg a confronto con un OS a 5 anni del 30% nei pazienti che hanno ricevuto una dose inferiore (p 0.010) 16. Le raccomandazioni EUROCORD per la scelta di una unità di sangue cordonale sono attualmente: I. nelle malattie neoplastiche: 2 differenze HLA e cellule nucleate >2.5x10 7 /kg o CD34 2x10 5 /kg II. nelle malattie non-neoplastiche (dove è maggiore il rischio di rigetto, la dose cellulare dovrebbe essere incrementata e migliorata la compatibilità HLA) dovrebbero essere escluse le unità con incompatibilità HLA 2 e cellule nucleate < 3.5x10 7 /kg III.se non ci sono singole unità di sangue cordonale con queste caratteristiche ci si può orientare verso l utilizzo di due unità provenienti da donatori diversi che non presentino possibilmente più di 1 differenza HLA tra loro e con il paziente e con una dose totale di cellule nucleate 3x10 7 /kg 17. Effetto della compatibilità HLA Da un analisi delle casistiche emerge che la maggior parte delle unità di sangue cordonale trapiantate presentava delle disparità HLA tra donatore e ricevente di grado variabile da 1 a 2 loci. Non vi è concordanza di opinioni relativamente all effetto di tali disparità su attecchimento ed outcome del trapianto. L analisi del National Cord Blood Program al New York Blood Center (NYCB) che esamina pazienti che hanno ricevuto UCB con grado di compatibilità variabile da 6/6 a 3/6 dimostra un effetto avverso del grado di incompatibilità

17 M.B. Pinazzi et al.: Il trapianto di cellule staminali da sangue di cordone ombelicale 207 su attecchimento, incidenza di GVHD, TRM, e sopravvivenza libera da malattia (DFS: disease free survival) indipendentemente dalla dose cellulare; mentre la dose cellulare non ha nessun impatto nel trapianto con compatibilità 6/6 può significativamente compensare l impatto negativo del mismatch nei trapianti con compatibilità inferiore a 6/ Secondo i dati riportati da Gluckman e coll. 6 nel 2004, l incompatibilità HLA sembra non avere impatto sulla sopravvivenza, mentre ha impatto negativo sull attecchimento in concordanza con i risultati del NYCB L analisi dell Eurocord del dimostra che sebbene una maggiore incompatibilità HLA abbia un effetto avverso sull attecchimento, può comportare una riduzione del rischio di recidiva nelle malattie neoplastiche (effetto GvL). La sopravvivenza al contrario è ridotta nelle malattie non-neoplastiche. Le tabelle 4 e 5 illustrano i risultati riportati relativamente all attecchimento e alla sopravvivenza. Nel trapianto da cordone non correlato l incidenza di GVHD acuta varia complessivamente tra il 33% e il 44% (grado II-IV) e tra l 11% ed il 22% per il grado severo (III-IV), mentre l incidenza di GVHD cronica complessiva (forma limitata + estesa) viene riportata tra lo 0 e il 25% 15. Si consideri che la maggior parte delle UCB trapiantate presenta almeno una singola disparità sui loci HLA. Nello studio pediatrico COBLT 23, l incidenza di GVHD acuta era significativamente superiore nei riceventi di UCB con compatibilità 4/6 a confronto con 5/6 o 6/6. L influenza della disparità HLA sull incidenza di GVHD dopo trapianto con UCB è comunque inferiore rispetto a quanto riportato nel trapianto di cellule midollari da donatore volontario 20. Ricostituzione immunologica e rischio infettivo La ritardata ricostituzione immunologica rimane una delle più importanti cause di morbidità e mortalità del trapianto da cordone ombelicale in quanto associata a rischio infettivo soprattutto nelle prime fasi post-trapianto. In uno studio del gruppo spagnolo 24 di confronto tra CSE da cordone, sangue periferico e midollo si è evidenziato per il cordone una più elevata e significativa frequenza di infezioni severe nei primi 3 anni che giunge all 85% rispetto al 67-69% (p 0.009), con un trend di maggiore incidenza nei primi 30 giorni. Le infezioni sono per il 55% batteriche, 14% fungine, 32% virali. L uso del siero antilinfocitario (ATG) per la profilassi della GVHD e la linfopenia correlano con il maggior rischio di sviluppare infezione da citomegalovirus (CMV), che comunque ha una maggiore incidenza nei pazienti CMVsieropositivi prima del trapianto. La GVHD aumenta il rischio di malattia da CMV in tutti i gruppi, e di infezioni fatali anche dopo i primi 100 giorni. Tuttavia, proprio il basso rischio di GVHD cronica (cgvhd) nel trapianto da cordone può spiegare il minor rischio di infezioni tardive specialmente fungine 24. Tabella 4. HLA: effetto del mismatch sull attecchimento (definito come Neutrofili 500) HLA-A,B,DRB1: grado di compatibilità Attecchimento Rubinstein Gluckman Eapen Kurtzberg /6 100% 83% 85% Favorevole p /6 78% Ridotto 80% 4/6 82% Ridotto 76% Sfavorevole 3/6 69% p % p <0.01 NV Tabella 5. HLA: effetto del mismatch sulla sopravvivenza HLA-A,B,DRB1 match Sopravvivenza Rubinstein 1998 Wagner2002 Gluckman 2004 Eapen 2007 Kurtzberg /6 Ridotto ridotto Nessun effetto ridotto Non valutabile 4/6 Ridotto ridotto Nessun effetto ridotto ridotto

18 208 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 L analisi della ricostituzione immunologica mostra che nelle fasi successive al condizionamento il numero di linfociti-t CD4+ e CD8+ è ridotto ed il normale rapporto CD4+/CD8+ è invertito. Viceversa, il numero assoluto dei linfociti-b (CD19+) è normale ed il numero di linfociti-nk (CD16+/56+) è lievemente aumentato 25. A 30 giorni dal trapianto il numero di CD4+/CD8+ è ancora estremamente basso e tale si mantiene per almeno 6 mesi, dopo di che si assiste ad un aumento del loro numero assoluto fino a valori normali ad 1 anno dal trapianto; tuttavia già dopo i primi 100 giorni vi è la capacità, da parte dei linfociti naive (linfociti che non hanno mai incontrato l antigene) di avviare una precoce risposta immune primaria ai patogeni. Il deficit della timopoiesi caratterizza la ricostituzione immunologica post-trapianto di cordone ed è associato ad un ritardato recupero dell attività T-memoria 26. Pur in presenza di queste alterazioni, l effetto GVL non appare compromesso; non è stato osservato un aumentato rischio di recidiva dopo trapianto di cordone e, come per il trapianto con CSE adulte, l incidenza di recidiva correla più con il tipo e lo stato della malattia al momento del trapianto che con l immaturità immunologia del cordone. Trapianto di CSE da cordone e da midollo a confronto In letteratura non vi sono studi prospettici di confronto tra trapianto di cellule staminali cordonali e trapianto di cellule staminali adulte da donatore non-consanguineo. Gli studi retrospettivi più recenti di confronto sono dell International Bone Marrow Transplant Registry (IBMTR/NYCB) 27 e dell EBMT 28,oltre ad uno studio monocentrico giapponese 29. Il confronto mostra un attecchimento più lento nel gruppo che riceve cordone, mentre non vi sono differenze significative in termini di GVHD acuta (agvhd) nonostante la maggior parte delle unità di cordone trapiantate presenti almeno 1 incompatibilità. Anche l incidenza di recidiva e l OS a 2 anni sono sovrapponibili nei due gruppi (Tabella 6). Una migliore sopravvivenza globale è stata registrata dopo trapianto di cordone nella popolazione giapponese: ciò è verosimilmente in relazione al basso peso corporeo ed alla maggiore omogeneità genetica. Anche nei pazienti pediatrici affetti da leucemia acuta e sottoposti a trapianto di CSE da cordone (N=99 di cui 89% con disparità HLA da 1 a 3 loci) a confronto con quelli di CSE da midollo (N=416, di cui 262 hanno ricevuto midollo non manipolato e 180 midollo T-depleto), i risultati evidenziano un aumento del tempo di attecchimento della linea mieloide e piastrinica nel gruppo cordone. Nello stesso gruppo appaiono ridotte sia l incidenza di GVHD acuta (33% CB vs 56% BM senza T-deplezione) che cronica (25% CB vs 46% BM senza T-deplezione). Inoltre la velocità di recupero di neutrofili e piastrine correla con la dose totale di cellule infuse (cut-off 3.7 x 10 7 /kg) ma non Tabella 6. Studi di confronto: trapianto da cordone e da donatore non correlato nell adulto Autore Laughlin (IBMTR+NYBC) Periodo di osservazione Rocha (Eurocord + EBMT) Takahashi Sorgente di CSE Cordone Midollo Cordone Midollo Cordone Midollo N pazienti Compatibilità 6/6 0 5/6 23 % 4/6 77% No mismatch 100% 6/6 6% 5/6 51% 4/6 39% 3/6 4% No mismatch 100% 6/6 0 5/6 21 % 4/6 54% 3/6 25% No mismatch 87% 1 mismatch 13% CNT x10 7 /kg 2,2 24 2,3 29 2,5 33 PMN 27 (25-18 (18-19) 26 (14-80) 19 (5-72) 22 (16-41) 18 (12-33) >500/mm 3 (giorni) 29) agvhd II-IV 40% 48% 26% 39% 50% 66% cgvhd 50% 35% 30% 46% 77% 74% TRM 63% 46% 44% 2 aa 38% 2aa 9% 1-2 aa 29% 1-2 aa OS 26% 3 aa 35% 3 aa 36% 2 aa 42% 2 aa 74% 2 aa 44% 2 aa Recidiva 2 aa n.a. n.a. 23% 23% 16% 25%

19 M.B. Pinazzi et al.: Il trapianto di cellule staminali da sangue di cordone ombelicale 209 con la disparità HLA, come invece osservato per il trapianto da donatore non correlato di CSE, la sopravvivenza a 2 anni è comparabile fra i diversi gruppi 40.Questi risultati sono stati confermati dal recente studio IBMTR/ NYCB, in cui 503 bambini affetti da leucemia acuta sono stati trapiantati con cordone (221) o con midollo (282). La TRM nel gruppo che ha ricevuto cordone con 1 o 2 differenze indipendentemente dalla dose cellulare, appare maggiore nei pazienti che ricevono meno di 3 x 10 7 /kg cellule mononucleate. La sopravvivenza libera da leucemia (leukemia free survival, LFS) non è significativamente differente nel gruppo che ha ricevuto cordone con 1 o 2 mismatch rispetto al gruppo che ha ricevuto midollo HLA-genotipicamete identico 20. In nessuno degli studi riportati è stato osservato un aumento del rischio di recidiva dopo HSCT con cordone, al contrario è stato ipotizzato che l elevata frequenza di disparità HLA tra donatore e ricevente possa giocare un ruolo, potenziando l attività anti-leucemica delle cellule implicate nell effetto GVL (T-linfociti e NK). Trapianto di CSE da CB nell adulto Il limite principale per l applicazione del trapianto da CB nell adulto è costituito dalla bassa dose di progenitori emopoietici in rapporto al peso corporeo del ricevente. Tuttavia vari studi hanno dimostrato che la procedura è fattibile anche nell adulto. Dati recenti dell Eurocord Registry 30 in 171 pazienti adulti con malattie ematologiche neoplastiche trapiantati dopo il 1997, mostrano che la DFS a 2 anni dal trapianto è significativamente influenzata dalla fase di malattia. La TRM a 2 anni è del 51% ma raggiunge il 68% nei primi 100 giorni. Le principali cause di morte sono rappresentate da infezioni (36%), recidiva (23%) e GVHD (11%). Il numero di cellule mononucleate alla raccolta o al congelamento e l uso del fattore di crescita granulocitario (G-CSF) a partire da una settimana dopo l infusione sono i fattori associati al recupero dei neutrofili. L incidenza cumulativa di agvhd a 100 giorni è 32% (grado I 21%, II 16%, III 9%, IV 7%), mentre la cgvhd è stata rilevata nel 36% dei pazienti a 2 anni. La TRM si è ridotta rispetto al periodo precedente al 1997, verosimilmente a causa di una migliore selezione delle UCB in termini di compatibilità e di cellularità. La TRM elevata nei primi 100 giorni è verosimilmente da attribuire al più lento attecchimento rispetto al trapianto di cellule staminali adulte. I migliori risultati sono stati registrati nei pazienti che hanno ricevuto una dose di cellule mononucleate > 2x 10 7 /kg 6,30. Trapianto di due o più unità di sangue cordonale I risultati sono riportati prevalentemente in studi del gruppo dell Università del Minnesota che per primo ha sperimentato la possibilità di inoculare nello stesso paziente due UCB allo scopo di migliorare l attecchimento. In uno di questi studi 31 venivano selezionate unità di sangue cordonale con una compatibilità 4-6/6 verso il ricevente e con compatibilità 5-6/6 delle UCB tra loro. A confronto con il gruppo storico di controllo che aveva ricevuto una singola unità, l attecchimento era più precoce con doppio cordone, con mediana di 23 giorni (range 15-41) rispetto a 27 giorni del gruppo storico, si osservava una bassa frequenza di fallimento (0-22%), una maggiore incidenza di agvhd (44-65% grado II-IV, 13% III-IV rispetto al 40% grado II-IV del gruppo storico) ma cgvhd sovrapponibile (21-25%). La sopravvivenza libera da malattia ad 1 anno dal trapianto era del 72% nei pazienti trapiantati in remissione completa. È interessante osservare che di regola una delle due unità cordonali infuse predomina sull altra. Con lo studio del chimerismo si osserva come, dopo una fase in cui si evidenzia l attecchimento di ambedue le unità, approssimativamente dal giorno +100 il paziente mostra un emopoiesi che deriva solo da una delle due unità trapiantate; la ragione di questo fenomeno non è nota né si conoscono fattori predittivi della predominanza di una unità sull altra. L unico fattore significativo sembra il numero di linfociti T CD3+: attecchisce definitivamente l unità che ne contiene il maggior numero. Questo avvalora l ipotesi che il meccanismo di prevalenza di un unità sull altra sia di tipo immuno-mediato e che lo stesso meccanismo sostenga nel tempo l attecchimento dell unità predominante 31. La procedura è fattibile e sicura, l attecchimento precoce e la bassa incidenza di GVHD acuta severa (III-IV) comportano una relativa riduzione della mortalità trapianto-correlata.

20 210 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Trapianto di cellule staminali emopoietiche per via intra-ossea Nel trapianto di cellule cordonali la percentuale di fallimenti per mancato o ritardato attecchimento si avvicina al 20%. Dopo inoculazione per via endovenosa una larga parte dei precursori emopoietici viene catturata dai filtri fisiologici (fegato e polmone). Nel topo solo il 20% delle cellule staminali ematopoietiche inoculate si insedia stabilmente nel midollo osseo 32. L inoculo per via intraossea sembra dunque un interessante alternativa a quello per via sistemica. Nel modello NOD/SCID il confronto tra l inoculo di CSE cordonali per via intrafemorale rispetto a quella endovenosa mostra un grado di attecchimento dopo inoculo intraosseo da 6 a 12 volte superiore a quello ottenuto per via endovenosa 33. Le altre sedi di emopoiesi fisiologica presentano un grado di attecchimento di poco inferiore a quello osservato in sede femorale, confermando la capacità delle CSE di migrare attraverso il torrente circolatorio anche dopo infusione per via intraossea. Uno stesso livello di ripopolamento del midollo emopoietico può essere ottenuto con un numero di progenitori emopoietici 10 volte inferiore a quello richiesto per via endovenosa 34. In uno studio pioneristico del Karolinska Institut 35 venivano arruolati pazienti candidati a trapianto allogenico HLA-identico o con un singolo antigene mismatched da donatore familiare dopo condizionamento mieloablativo. Trentotto pazienti con diverse patologie ematologiche venivano randomizzati in tre bracci per ricevere rispettivamente: cellule staminali da midollo osseo di cui metà del volume endovena e metà per via intra-ossea (gruppo 1); l intero volume di midollo osseo per via intra-ossea (gruppo 2); infine l intero volume di midollo osseo endovena (gruppo 3). Il midollo osseo trapiantato per via intra-ossea attecchiva in tutti con tempi e modalità sovrapponibili senza differenze significative in termini di mortalità correlata al trapianto, GVHD acuta e cronica, sopravvivenza libera da malattia e recidiva. In particolare nel gruppo 2 non venivano osservati episodi infettivi locali o sistemici riconducibili alla procedura. La somministrazione di cellule staminali midollari per via intra-ossea si dimostra pertanto fattibile, sicura ed efficace ma non superiore alla convenzionale somministrazione per via endovenosa. Diversi sembrano i risultati se si impiegano cellule cordonali: un recente studio dell Eurocord 36 confronta un gruppo selezionato di adulti trapiantati con cordone per via endovenosa con 50 pazienti che hanno ricevuto cordone per via intraossea. Non vi erano differenze tra i due gruppi in termini di diagnosi, numero di cellule, regime di condizionamento, precedente autotrapianto, stato di malattia. I risultati mostrano un vantaggio della somministrazione intraossea: in particolare un attecchimento delle piastrine più precoce (piastrine >20000/mm 3 a 60 giorni nell 82% vs il 40%), minore incidenza di agvhd grado II-IV (12% vs 38%) e di agvhd grado III-IV (2% vs 18%), mortalità correlata al trapianto a 90 giorni inferiore (27% vs 34%) e migliore sopravvivenza globale a 1 anno (67% vs 43%) (Tabella 7). L attecchimento dei neutrofili tuttavia era sovrapponibile nei due gruppi. Un follow-up più lungo è necessario per valutare con certezza i vantaggi di questa modalità di somministrazione. Impiego delle cellule staminali da cordone nelle malattie non ematologiche Nel sangue cordonale sono presenti anche cellule staminali non emopoietiche. Grazie ad una grande plasticità esse possono differenziare secondo diverse linee maturative dando origine a tessuti diversi. Tuttavia il potenziale terapeutico di queste cellule è tutto da esplo- Tabella 7. Studio comparativo eurocord: confronto tra infusione intraossea ed endovena di cellule staminali cordonali PMN+60 PLT +60 agvhd II-IV agvhd III- IV TRM +90 OS +365 UCB I.O 70% 82% 12% 2% 27% 67% UCB e.v. 80% 40% 38% 18% 34% 43% p 0.27 < < <0.07

21 M.B. Pinazzi et al.: Il trapianto di cellule staminali da sangue di cordone ombelicale 211 rare e può essere collegato principalmente alla loro capacità di riparare il danno tissutale, ad esempio la riparazione del danno neuronale possibilmente attraverso la secrezione di fattori di crescita neurotropi. In studi preclinici è stato valutato il loro utilizzo nel trattamento di malattie neurodegenerative e nella riparazione del danno cerebrale traumatico e ischemico 37. Sono in corso studi in vitro ed in vivo nell animale sull uso delle cellule staminali cordonali nel trattamento del diabete di tipo I. Infatti le cellule cordonali esprimono marcatori dei progentitori pancreatici ed hanno la capacità di generare cellule insulino-secernenti e strutture simili alle isole pancreatiche 38 ; il loro comportamento in vivo rimane tuttavia ancora sconosciuto. In ambito cardiologico sono in corso studi sull uso delle cellule staminali nella riparazione del danno miocardico da infarto. L efficacia della terapia cellulare con cellule staminali adulte è incerta mentre il cordone ombelicale potrebbe rappresentare un alternativa valida essendo una sorgente di cellule giovani, immature e in grado di differenziare. Nell animale il trapianto di cellule cordonali nel tessuto miocardico ischemico porta ad miglioramento funzionale del miocardio sede di infarto legato ad una neo-cardiomiogenesi e vasculogenesi 39. Conclusioni L uso delle cellule staminali da cordone ombelicale rappresenta una valida alternativa per quei pazienti candidati a trapianto che non dispongono di un donatore familiare o volontario compatibile. Il suo principale limite è rappresentato dalla bassa dose di cellule staminali contenute nell unità: ciò comporta, specie nell adulto, un ritardo nell attecchimento, che di conseguenza espone il paziente ad un maggior rischio infettivo. L immaturità del sistema immunitario del cordone consente di infondere unità con un grado variabile di incompatibilità HLA, ma ritarda la ricostituzione immunologica. Questa stessa immaturità riduce il rischio e la severità della GVHD acuta. La sopravvivenza a lungo termine è sovrapponibile a quanto osservato nel trapianto di cellule staminali adulte anche se la mortalità registrata nei primi 100 giorni dal trapianto è superiore. Questi risultati giustificano la contemporanea ricerca di donatore vivente e cellule staminali da cordone a scopo di trapianto ma la scelta sarà poi basata sulla cellularità dell unità cordonale, sul grado di compatibilità HLA e sull urgenza del trapianto. Le prospettive future per migliorare l outcome del trapianto di cordone ombelicale sono rappresentate da incremento del numero di unità bancate per migliorare la probabilità di reperire unità con matching 6/6 (migliore attecchimento, GVHD ridotta, sopravvivenza apparentemente migliore); trapianto con doppio cordone: capace di migliori risultati in termini di attecchimento e minore incidenza di recidiva infusione intra-ossea delle cellule staminali cordonali che mostra migliori risultati in termini di attecchimento piastrinico e minore incidenza e severità dalla GVHD acuta; in corso di studio è l espansione in vitro delle cellule staminali cordonali con l ausilio di citochine e fattori di crescita. L uso delle cellule staminali cordonali nei trapianti non emopoietici rappresenta, inoltre, una possibile novità per il trattamento di varie patologie ma al momento gli studi clinici in corso non consentono di esprimere un giudizio sull efficacia in vivo delle terapie cellulari al di fuori dell ambito ematologico. Bibliografia 1. Weissman I, Shizuru JA. The origin of the identificatio and isolation of hematopoietic stem cells and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat auitoimmune disease. Blood 2008; 112: Brunstein CG, Setubal DC,Wagner JE. Expanding the role of umbelical cord blood transplantation. British J Haemat 2007; 137: Locatelli F, Giorgiani G, Giraldi E, et al. Cord blood transplantation in childhood. Haematologica 2000; 85(11 Suppl): Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi s anemia by means of umbilicalcord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med 1989; 321: Gluckman E, Rocha V, Boyer Chammard A, et al. Outcome of cord blood transplantation from related and unrelated donors. NEJM 1997; 337:

22 212 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, Gluckman E, Rocha V, Arcese W et al. Factors associated with outcomes of unrelated cord blood transplant: guidelines for donor choice. Exp Hematol. 2004; 32: Broxmeyer HE, Douglas GW, Hangoc G, et al. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/ progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86(10): Nakahata T, Ogawa M. Hemopoietic colonyforming cells in umbilical cord blood with extensive capability to generate mono- and multipotential hemopoietic progenitors. J Clin Invest. 1982; 70(6): Wang JC, Doedens M, Dick JE. Primitive human hematopoietic cells are enriched in cord blood compared with adult bone marrow or mobilized peripheral blood as measured by the quantitative in vivo SCID-repopulating cell assay. Blood 1997; 1;89(11): Hao QL, Shah AJ, Thiemann FT, et al. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood 1995; 86(10): Cairo MS, Wagner JE. Placental and/or umbilical cord blood: an alternative source of hematopoietic stem cells for transplantation. Blood Dec 15;90(12): Kögler G, Radke TF, Lefort A, et al. Cytokine production and hematopoiesis supporting activity of cord blood-derived unrestricted somatic stem cells. Exp Hematol 2005; 33(5): Rubinstein P, Dobrila L, Rosenfield R, et al. Processing and cryopreservation of placental/ umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. PNAS 1995; 92: Rubinstein P, Carrier C, Carpenter C, et al. Graft selection in unrelated placental/umbilical cord blood (PCB) transplantation: influence and weight of HLA match and cell dose on engraftment and survival [abstract]. Blood 2000; 96: 588a Schoemans H, Theunissen K, Maertens J, et al. Adult umbelical cord blood transplantation: a comprehensive review. Bone Marrow Transplantation 2006; 38: Kamani N, Spellman S, Hurley C.H, et al. State of the art review: HLA matching and outcome of unrelated donor umbilical cord blood transplantation. Biology of Blood and marrow transplantation 2008; 14: Gluckman E, Rocha V. Cord Bloob Transplantatio: state of art. Haematologica 2009; 94: Wagner JE, Barker JN, DeFor TE, et al. Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant diseases: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival. Blood 2002; 100: Stevens CE, Rubinstein P, Scaradavou A. HLA matching in cord blood transplantation: clinicla outcome and implication for cord blood unit selection and inventory size and ethnic composition. Blood 2006; 108 (abstract 885a) 20. Eapen M, Rubistein P, Zhang MJ, et al. Outcome of transplantation of unrelated donor umbelical cord blood bone marrow in children with acute leukemia: a comparison study. Lancet 2007; 369: 1947: Gluckman E, Rocha V. Donor selection for unrelated cord blood transplant. Curr Opin Immunol 2006; 18: Rubinstein P, Carrier C, Scaradavou A. Outacome among 562 recipients of placental-blood transplant from unrelated donor. N England J Med 1998; 339: Kurtzberg J, Prasad VK, Carter SL, et al. COBLT Steering Committee.Results of the Cord Blood Transplantation Study (COBLT): clinical outcomes of unrelated donor umbilical cord blood transplantation in pediatric patients with hematologic malignancies. Blood 2008; 112: Parody R, Martino R, Rovira M, et al. Severe infections after unrelated donor allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in adults: comparison of cord blood transplantation with peripheral blood and bone marrow transplantation. Biol of Blood and Marrow Transplantation 2006; 12: Krishna V Komanduri, Lisa S St John, Marcos de Lima, et al. Delayed immune reconstitution after cord blood transplantation is characterized by impaired thymopoiesis and late memory T- cell skewing. Blood 2007; 110: Talvensaari K, Clave E, Douay C, et al. A broad T-cell repertoire diversity and an efficient thymic function indicate a favorable long-term immune reconstitution after cord blood stem cell transplantation. Blood 2004; 99: Laughlin MJ,Eapen MRubistein, Wagner JM, et al. Outcome after transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors in adult with leukemia. N Engl J Med 2004; 351: Rocha V, Labopin M, Sanz G, et al. transplant of umbelical cord or bone marrow from unrelated donors in adults with acute leukemia. N Engl J Med 2004; 351: Takahashi S, Iseki T, Ooi J, et al. Single-institute comparative analysis of unrelated bone marrow transplantation and cord blood transplantation for adult patients with hematological malignancies. Blood 2004; 104: Arcese W, Rocha V, Labopin M, et al. Unrelated cord blood transplant in adults with hematologic malignancies. Haematol 2006; 91(2): Barker JN, Weidsorf DJ, DeFor TE, et al. Trans-

23 M.B. Pinazzi et al.: Il trapianto di cellule staminali da sangue di cordone ombelicale 213 platation of 2 HLA-matched umbelical cord units to enahnce engraftment in adults with hematologic malignancy. Blood 2005: 105: Dick JE, Lapidot T. Stem cells take a shortcut to the bone marrow. Blood 2003; 101: Mazurier F, Doedens M, Gan OIet al. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature Med 2003; 9: Castello S, Podesta M, Menditto VG, et al. Intra-bone marrow injection of bone marrow and cord blood cells: an alternative way of transplantation associated with a higher seedin efficiency. Exp Hematol 2004; 32(8): Hagglund H, Ringden O, Agren B, et al. Intraosseous compared to intravenous infusion of allogeneic bone marrow. Bone Marrow Transplantation 1998; 21: Frassoni F, Labopin M, Gualandi F, et al. Intrabone marrow transplantation of cord blood cells is associated with better platelet recovery and decreased acute GVHD as compared with intravenus transplantation: an Eurocord matchedpair analysis. EBMT 2009 (Abstract 106) 37. Sanberg PR Willing AE, Garbuzova-Davis S, et al. Umbelical cord blood-derived stem cells and brain repair. Ann N Y Acad Sci 2005; 1049: Parekh VS, Joglekar MV, Hardikar AA. Differentiation of human umbilical cord blood-derived mononuclear cells to endocrine pancreatic lineage.differentiation Aug 5. [Epub ahead of print] 39. Iwasaki H, Kawamoto A, Willwerth C, et al. Therapeutic Potential of Unrestricted Somatic Stem Cells Isolated From Placental Cord Blood for Cardiac Repair Post Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol Aug 13. [Epub ahead of print] 40. Rocha V, Cornish J, Sievers EL, et al. Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukaemia. Blood 2001; 97(10): Corrispondenza e richiesta estratti: Dott.ssa Maria Beatrice Pinazzi, [email protected]

24 ANNALI DEGLI OSPEDALI San Camillo e Forlanini Volume 11, Numero 4, Ottobre- Dicembre 2009 GENETICA DELLA EMOCROMATOSI EREDITARIA GENETIC HEREDITARY HEMOCHROMATOSIS SILVIA MAJORE, FRANCESCO BINNI, PAOLA GRAMMATICO U.O.C. Laboratorio di Genetica Medica, Sapienza, Università di Roma, Azienda Ospedaliera S. Camillo-Forlanini, Roma Parole chiave: Emocromatosi ereditaria. Eterogeneità genetica. Metabolismo del ferro. Epcidina Key words: Hereditary hemochromatosis. Genetic heterogeneity. Iron metabolism. Hepcidin Riassunto L emocromatosi ereditaria, una delle più frequenti malattie mendeliane, è stata considerata a lungo come un unica entità clinica e genetica. Questa condizione patologica, caratterizzata da sovraccarico di ferro nell organismo conseguente ad alterato assorbimento intestinale di questo metallo, è, di fatto, nella maggior parte degli individui di discendenza nord-europea, associata alla stessa mutazione biallelica del gene HFE. I notevoli avanzamenti delle conoscenze sul metabolismo del ferro compiuti negli ultimi anni hanno permesso di comprendere molti dei meccanismi coinvolti nella regolazione dell omeostasi marziale e, allo stesso tempo, di identificare molteplici nuove forme genetiche di emocromatosi ed iperferritinemie ereditarie. In questo scenario il numero e la complessità delle indagini molecolari che possono essere offerte ai pazienti con alterazione degli indici di sovraccarico del ferro e ai loro familiari hanno subito un drammatico aumento. La programmazione e l interpretazione di questi esami genetici dovrebbe essere affidata allo specialista in Genetica medica nell ambito di una Struttura in grado di effettuare indagini molecolari di II livello. Abstract Hereditary hemochromatosis, one of the most frequent mendelian disorders, has been regarded for a long time as a unique clinical and genetic entity. This affection, characterized by body iron overload due to abnormal absorption of the metal by the intestinal mucosa, in the majority of Northern European ancestry patients, is associated with the same biallelic mutation of the HFE gene. In the latest years, our knowledge of iron metabolism has much improved allowing us to understand many of the mechanisms acting in the regulation of iron homeostasis, and, at the same time, to identify several new genetic forms of hereditary hemochromatosis and hereditary hyperferritnemia. In this scenario, the number and complexity of molecular analysis that can be offered to patients with abnormal iron indices and to their relatives, have dramatically increased. Therefore, the Medical Genetist, operating for a Medical Genetics Department able to perform molecular studies of II level, should be responsible for the planning and interpretation of such these genetic exams.. Introduzione Il ferro è il metallo contenuto in maggiore quantità nell organismo umano. Grazie alle sue proprietà chimiche questo elemento svolge un ruolo unico in una serie di processi metabolici, quali il trasporto dell ossigeno nel sangue, il legame dell ossigeno nella mioglobina e la respirazione cellulare. Catalizza inoltre numerose reazioni ossidative ed è necessario per la crescita e per la proliferazione cellulare 1. Nonostante sia quindi un elemento essenziale

25 S. Majore et al: Genetica della emocromatosi ereditaria 215 per la vita, il ferro può essere dannoso se presente in eccesso. La tossicità del ferro è in gran parte dovuta alla sua capacità di catalizzare la formazione di radicali che danneggiano le macromolecole cellulari promuovendo la morte cellulare ed il danno tessutale 1. Tutti gli esseri viventi hanno perciò sviluppato sistemi più o meno raffinati per assumere il ferro dall ambiente, immagazzinarlo all interno delle cellule e ridistribuirlo nei vari comparti ma anche per controllare il contenuto di ferro dell organismo e rendere tale metallo innocuo. Diviene sempre più evidente che i fattori coinvolti nella regolazione dell omeostasi del ferro sono numerosissimi e che il non corretto funzionamento di ciascuno di questi può avere conseguenze patologiche che si traducono in quadri clinici associati a carenza, eccesso o alterata redistribuzione del metallo 1. Negli ultimi anni le conoscenze sul metabolismo del ferro hanno compiuto notevoli progressi e ciò ha permesso di caratterizzare le basi molecolari di molte di queste condizioni e di comprendere i meccanismi fisiopatologici che le determinano. Tutto ciò ha contribuito ad un migliore inquadramento dell emocromatosi ereditaria (EE) 2, la più frequente patologia associata a sovraccarico di ferro. Assorbimento ed omeostasi del ferro Nell organismo umano il ferro è presente nelle due forme ferrosa (Fe++) e ferrica (Fe+++), entrambe estremamente reattive, per cui in massima parte legate a proteine di trasporto e di deposito. L intestino tenue, ed in particolare il duodeno, è la sede principale dell assorbimento del ferro che avviene con diversa modalità a seconda che questo venga introdotto con la dieta in forma organica oppure inorganica. L uomo ingerisce complessivamente circa mg di ferro al giorno, assorbendone mediamente solo 1,5 mg, ma, a seconda delle necessità dell organismo, in quantità variabile da 0,5 mg a 4 mg. Prima di essere assorbito dalle cellule intestinali, il ferro inorganico presente allo stato ossidato (ferrico) viene ridotto a ione ferroso ad opera di una reduttasi espressa dall orletto a spazzola delle cellule dell epitelio duodenale. Il ferro bivalente viene quindi trasportato attraverso la superficie cellulare apicale dal così detto trasportatore divalente dei metalli 1 (DMT1), proteina in grado di svolgere la sua funzione anche nei confronti di altri metallo-ioni. La maggior parte del Fe++ assorbito dagli enterociti, resta all interno di queste cellule sotto forma di ferritina (ed eliminato con l enterocita senescente), mentre solo quello necessario all organismo viene trasferito alla membrana basolaterale da una proteina denominata ferroportina. Ossidato quindi a ferro trivalente dalla ferro-ossidasi efaestina, il metallo viene immesso nei vasi del sistema portale e legato alla transferrina. L emoglobina, la mioglobina e le altre proteine alimentari caratterizzate dalla presenza di un gruppo ferro prostetico (ferro organico) subiscono, all interno del lume intestinale, scissione enzimatica in anello metallo-porfirinico e globina. La ferro-porfirina viene successivamente veicolata in forma integra all interno della membrana apicale dei duodenociti da uno o più trasportatori ad oggi non noto/i (è ancora ipotetico il possibile ruolo di HCP1 individuato da Shayeghi et al nel 2005) 3. Una volta all interno delle cellule duodenali, l eme viene scisso in ione ferroso e biliverdina dall enzima eme-ossigenasi. In seguito, il ferro derivato dall eme viene, al pari del ferro inorganico, trasportato dalla ferroportina alla membrana basolaterale e riversato nel circolo sanguigno dove, previa ossidazione, viene legato alla transferrina. Dai vasi del circolo portale, il ferro legato alla transferrina, giunge ai vari organi, in primo luogo al fegato, principale sito di deposito di questo metallo (ferritina). Gli epatociti internalizzano il complesso transferrina-ferro tramite il recettore 1 della transferrina (TFR1) ed, in misura minore, per mezzo del recettore 2 della transferrina (TFR2). Il principale sito di utilizzo del ferro è invece il midollo osseo, dove il metallo viene assunto dai precursori eritroidi, tramite il TFR1. Il ferro legato all eme viene riciclato grazie all ingestione degli eritrociti senescenti da parte dei macrofagi reticolo-endoteliali. I macrofagi immagazzinano il ferro sotto forma di ferritina o lo riversano nel plasma, utilizzando il trasportatore ferroportina, dove questo viene ossidato dalla ceruloplasmina e legato dalla transferrina per venire riutilizzato. Il fegato ed il sistema reticoloendoteliale rappresentano quindi i principali siti di deposito mobilizzabile del ferro. L organismo umano contiene complessivamente circa 3-5 g di ferro. Il 50-60% di questo

26 216 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 è contenuto all interno dell emoglobina nei globuli rossi circolanti. Approssimativamente il 20-30% del ferro dell organismo è contenuto negli epatociti e nei macrofagi del sistema reticolo-endoteliale, all interno della ferritina e del suo prodotto di degradazione, emosiderina. I muscoli contengono, all interno della mioglobina, circa 300 mg di ferro. Un individuo sano assorbe mediamente 1,5 mg di ferro introdotto dalla dieta, che compensa le perdite non specifiche che avvengono per desquamazione cellulare nella cute e nelle mucose. Non esiste alcun meccanismo che regoli l eliminazione del ferro dall organismo. L omeostasi del ferro è quindi modulata a livello dell assorbimento e della redistribuzione tessutale e vede in gioco numerosi fattori che hanno come effetto finale quello di segnalare ai duodenociti l entità del fabbisogno marziale del sistema eritropoietico e del contenuto di ferro nei depositi. La principale molecola in grado di modulare l entità dell assorbimento marziale e la sua redistribuzione è un piccolo polipeptide costituito da 25 residui aminoacidici, denominato epcidina 4-5. Alti livelli di epcidina inibiscono l assorbimento enterico del ferro ed il suo rilascio da parte dei macrofagi. Al contrario, l assorbimento intestinale e la fuoriuscita dalle cellule del sistema reticolo-endoteliale subiscono un notevole incremento quando la concentrazione di epcidina è bassa 5,7. Epcidina è in grado di svolgere le sue azioni in quanto interagisce, a livello delle membrane cellulari, con la proteina ferroportina causando l internalizzazione e la degradazione di quest ultima. 6 Epcidina regola quindi l assorbimento di ferro esercitando un controllo post-traduzionale della concentrazione di ferroportina, modulando quindi l esportazione di ferro da parte dell unica molecola in grado di trasportare il ferro al di fuori delle cellule. Le molecole che convergono in questa ed in altre pathway regolative sono numerose (Figura 1) e la lista dei componenti che hanno un ruolo nel metabolismo del ferro soggette a continuo aggiornamento 7. Emocromatosi ereditaria: definizione e cenni storici Fig. 1. Forme alternative dell emocromatosi ereditaria di tipo 4 L emocromatosi ereditaria (EE) è una patologia multisistemica ereditaria del metabolismo del ferro che si trasmette, nella maggior parte dei casi, con modalità autosomica recessiva ed è causata da un eccessivo assorbimento marziale da parte della mucosa intestinale che consegue in un progressivo sovraccarico del metallo nell organismo. Il ferro, a causa del suo ruolo lesivo, può quindi provocare danni, che con il tempo diventano irreversibili, a molti organi e tessuti, quali fegato, cuore, pancreas e articolazioni. Le complicanze della malattia possono però essere prevenute o, se già comparse, in parte trattate, ottenendo una drastica riduzione dell entità dei depositi di ferro dell organismo per mezzo della rimozione periodica di sangue periferico. La prima descrizione dell EE fu di Trousseau che, nel notò, al riscontro autoptico di un soggetto diabetico deceduto per cirrosi epatica, una peculiare colorazione bronzina della cute e la consistenza del fegato notevolmente aumentata. Nel 1889 von Recklinghausen 9 definì emocromatosi l entità morbosa identificata da Trousseau e caratterizzata dalla presenza di cirrosi epatica, diabete e cute bronzina. L eziologia genetica dell emocromatosi idiopatica fu ipotizzata da Sheldon nel a seguito del rilievo di alcuni casi familiari e confermata solo nel 1974 quando ne fu dimostrata la trasmissione autosomica rececessiva 11. Alcuni anni dopo, Simon et al (1976) 12 rilevarono l esistenza di una significativa associazione tra l EE e l allele A3 del sistema maggiore di istocompatibiltà (MHC). Divenne quindi evidente che il gene causativo dell emocromatosi ereditaria mappava sul braccio corto del cromosoma 6 in prossimità del locus HLA-A (6p21) e che nella maggior parte dei soggetti

27 S. Majore et al: Genetica della emocromatosi ereditaria 217 con EE di origine caucasica era presente una regione di linkage disequilibrium associata ad una mutazione ancestrale. Il principale gene responsabile dell EE, inizialmente denominato HLA-H, e poi HFE, venne identificato solo 20 anni dopo da Feder et al (1996) 13. Questi ricercatori isolarono una regione di 250 kb, localizzata 3 Mb circa a valle dal complesso maggiore di istocompatibilita, all interno della quale un segmento trascritto conteneva, nell 85% dei pazienti con EE, una transizione in omozigosi, c.845g A, che produceva una sostituzione aminoacidica (p.c282y) in un dominio fondamentale della proteina codificata. Un' altra mutazione missenso, p.h63d (c.187c G), che converte una istidina in posizione 63 ad aspartato, fu rilevata nel 21% dei cromosomi in cui non era presente la mutazione p.c282y. Fu in seguito confermato che HFE è responsabile dell EE nella maggior parte dei pazienti di origine nord-europea e che p.c282y è la mutazione presente nella quasi totalità di quei soggetti 14. Venne quindi ipotizzato che la variante p.c282y, che è generalmente associata ad un aplotipo comune a tutti i pazienti, sia originata circa 2000 anni prima nella popolazione celtica e si sia diffusa seguendo il flusso migratorio di questa etnia 15. La frequenza della mutazione si rivelò notevolmente inferiore nel sud rispetto al nord dell Europa e praticamente nulla in Africa, Asia, Polinesia e tra gli aborigeni australiani 16. La mutazione p.h63d venne rilevata in una piccola percentuale dei cromosomi dei pazienti con forme attenuate di EE 16-17, mentre altre mutazioni in HFE sono state identificate successivamente, perlopiù in singole famiglie Se da una parte, l identificazione di HFE, della mutazione p.c282y e delle ulteriori varianti patogenetiche fu di grande utilità ai fini diagnostici e di ricerca, divenne progressivamente evidente che EE è, in realtà, una condizione geneticamente eterogenea e che ulteriori geni, oltre ad HFE, sono coinvolti, seppur più raramente, nel determinismo di diversi quadri clinici con sovraccarico primitivo di ferro. Fu inoltre progressivamente compreso che la patologia non viene sempre ereditata con modalità autosomica recessiva e che a volte l emocromatosi non si comporta come pura malattia mendeliana 2,17. Dal 2000 al 2004 sono stati quindi progressivamente identificati 4 nuovi geni coinvolti in altrettante forme di EE, clinicamente distinguibili tra loro Tra queste, una forma atipica della malattia (EE tipo 4), si trasmette con modalità autosomica dominante. La descrizione di alcuni casi con EE che seguono il modello di ereditarietà digenico o di tipo multifattoriale 2,21 ha infine confermato la notevole varietà e complessità eziologica di questa affezione, modificando profondamente l opinione che per molti anni ha visto l emocromatosi come una malattia geneticamente omogenea. Classificazione dell emocromatosi ereditaria Il termine EE è stato a lungo riferito alla forma più comune e per prima caratterizzata di sovraccarico primitivo di ferro causata da mutazioni in omozigosi o in eterozigosi composta nel gene HFE. I progressi scientifici compiuti nell ultimo decennio hanno fatto sì che oggi vengano riconosciuti almeno quattro sottotipi di EE (Tabella 1). Il termine di emocromatosi classica (EE di tipo 1), viene riservato alla forma correlata al gene HFE, mentre per EE di tipo 2, EE di tipo 3 e EE di tipo 4 si definiscono alcuni quadri clinici ad ereditarietà mendeliana, ritenuti rari, associati a mutazioni in geni di più recente individuazione È inoltre noto che esistono anche svariati casi in cui l EE mostra una ereditarietà più complessa, che vede nel suo determinismo l azione combinata di più geni coinvolti nel metabolismo del ferro 2,19, L effetto finale delle mutazioni in tutti geni causativi noti è una diminuzione della sintesi o dell attività di epcidina la cui inadeguata funzione determina un amento dell assorbimento del ferro intestinale È stato infatti dimostrato che i prodotti proteici dei geni responsabili delle EE di tipo 1, di tipo 2A e di tipo 3 operano nella stessa complessa pathway che regola l espressione di quest ultimo polipeptide (codificato dal gene responsabile dell EE di tipo 2B), e che ferroportina (EE di tipo 4) viene invece a sua volta regolata, a livello post-traduzionale, dalla stessa epcidina 5-7. La molteplicità delle molecole coinvolte nell omeostasi del ferro e, al tempo stesso, l esistenza di molti individui con sovraccarico marziale ad eziologia ancora sconosciuta, rendono assai probabile che, nel prossimo futuro, la classificazione delle EE includerà nuove forme causate da geni che giocano un ruolo nel controllo della funzione di epcidina o in cascate regolative alternative.

28 218 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Tabella 1. Classificazione dell emocromatosi ereditaria Classificazione Gene Proteina Trasmissione N Omim Emocromatosi tipo 1 HFE HFE AR Emocromatosi tipo 2A (emocromatosi giovanile) Emocromatosi tipo 2B (emocromatosi giovanile) HJV Emojuvelina AR HAMP Epcidina AR Emocromatosi tipo 3 TFR2 TFR2 AR Emocromatosi tipo 4 SLC40A1 Ferroportina AD HFE/HAMP HFE/Epcidina Digenica HFE/TFR2 HFE/TFR2 Digenica Emocromatosi ereditaria di tipo 1 (forma classica) Rappresenta la forma più comune di EE ed è dovuta a mutazioni del gene HFE, localizzato nella regione 6p21.3. Il prodotto di HFE è una proteina transmembrana, HFE, simile alle molecole MHC di classe I, che, al pari di quest ultime, si lega alla β2-microglobulina (B2-M) 13. Si riteneva, fino a qualche tempo fa, che la funzione di questa proteina fosse quella di inibire l assorbimento di ferro e che questa funzione si espletasse in prevalenza a livello delle cellule delle cripte intestinali. È invece ora noto che HFE, agisce prevalentemente nel fegato come regolatore positivo della sintesi di epcidina 5,7. La mutazione più comune in HFE, denominata p.c282y è presente in omozigosi nella maggior parte dei pazienti con sovraccarico primitivo di ferro originari dal nord-europa 14, La variante p.h63d del medesimo gene è, in ordine di frequenza, la seconda mutazione riscontrata nei soggetti affetti da EE di tipo 1 14, È stato da prima ipotizzato che questa sostituzione aminoacidica potesse essere in realtà un polimorfismo, privo di effetto funzionale sulla proteina HFE 21. p.h63d mostra infatti la medesima frequenza nei pazienti con HH e nella popolazione generale ed è presente solo in una piccola percentuale dei casi con EE clinicamente accertata. Inoltre, la maggior parte degli individui omozigoti per questa variante o eterozigoti composti p.c282y/p.h63d non mostra alcun segno o sintomo di sovraccarico di ferro 2,17,18. Si è infine giunti alla conclusione che p.h63d sia una mutazione causativa a bassa penetranza 22. Oltre alle due mutazioni principali, sono state identificate ulteriori 20 mutazioni puntiformi in HFE 2,17-18,21. Tra queste, l unica rilevata con discreta frequenza è la variante (p.s65d), implicata in una forma lieve di HH e presente nel 1,5% della popolazione Europea 23. Tutte le altre varianti di HFE sono molte rare o sono state addirittura descritte solo in forma privata (unico nucleo familiare). È stata tuttavia recentemente rilevata, in più di una famiglia originaria dalla Sardegna, la presenza di una delezione di paia di basi, comprendente l intero gene HFE 24. Questo riarrangiamento genomico ricorrente, verosimilmente generatosi per crossing-over ineguale ed indagabile solo in laboratori di genetica medica di II livello, potrebbe essere responsabile di una significativa parte di quei casi di EE nei quali la diagnosi clinica di EE non è stata ad oggi confermata dagli studi molecolari 24. L EE di tipo 1 è una malattia con frequenza variabile, nelle diverse popolazioni di origine caucasica, da 1 caso su 100 abitanti in Irlanda ad 1 su 400 in Francia 2,13, In Italia, la prevalenza della malattia è soggetta ad ampie differenze tra gli individui originari dal nord, in cui la prevalenza è più alta (1 caso su 500 abitanti), e quelli di provenienza centro-meridionale (probabilmente meno di un caso su 2000). Inoltre, in Italia, ed in particolare nel centro sud e nelle isole, solo il 30-66% dei casi con EE è correlabile a mutazioni di HFE La penetranza (la probabilità che un genotipo si renda clinicamente evidente) della malattia nei soggetti con genotipo omozigote p.c282y è oggi considerata come pari al 50% circa nel maschio e di grado inferiore nella donna 2,17-18,21. L EE classica mostra poi, un ampio spettro in termini di gravità, in quanto le manifestazioni

29 S. Majore et al: Genetica della emocromatosi ereditaria 219 cliniche variano dalla semplice alterazione biochimica degli indici del ferro a quadri gravi con compromissione multiorgano. La variabilità fenotipica viene attribuita all azione sinergica di geni modulatori e di fattori ambientali 2,17,21. La storia naturale della patologia è caratterizzata dalla precoce comparsa di parametri biochimici indicativi di sovraccarico ematico di ferro (incremento dei valori dell indice di saturazione della transferrina), seguita da un progressivo aumento dei valori della ferritina ematica (come indice indiretto di sovraccarico tissutale di ferro). In un alta percentuale dei casi le alterazioni biochimiche evolvono nello sviluppo di segni e sintomi correlati a danno degli organi interessati. L esordio clinico varia da individuo a individuo anche se mediamente la fase sintomatica ha inizio nella IV-V decade di vita nell uomo e dopo la menopausa nella donna. I primi segni relativi a danno d organo sono generalmente quelli epatici. La compromissione epatica si manifesta con sintomi aspecifici, lieve rialzo dei livelli serici degli indici di necrosi epatica ed aumento di volume del fegato. Il corrispettivo quadro istologico è quello di una fibrosi, che è, fino ad un certo grado, reversibile. In fase più avanzata, ed in stretta relazione con la quantità di ferro accumulato negli epatociti, è possibile l evoluzione in cirrosi ed eventualmente in epatocarcinoma. Segni di disfunzione delle ghiandole endocrine (diabete mellito, ipogonadismo ipogonadotropico, ipotirodismo) e di danno cardiaco (aritmie o scompenso cardiaco), possono comparire più tardivamente e, in genere, solo quando i valori della ferritinemia hanno raggiunto la soglia di 1000 µg/l. Tali complicanze non mostrano specifiche peculiarità. Il coinvolgimento in un individuo di più di uno dei sopra menzionati organi dovrebbe però sempre suggerire l ipotesi diagnostica di EE. L iperpigmentazione cutanea, manifestazione anch essa tardiva e correlata all entità dei depositi cutanei è, al contrario, piuttosto patognomonica per sovraccarico di ferro 2, Manifestazione di frequente riscontro nell EE è anche una artropatia cronica che colpisce in particolare le articolazioni metacarpofalangee raffigurando un quadro radiologico piuttosto caratteristico 20. La presentazione clinica più comune di tale complicanza è quella di un artrite cronica spesso multiarticolare e dolente che provoca rigidità e tumefazione delle articolazioni interessate È ancora fonte di dibattito se questa complicanza sia funzione o meno del grado di accumulo marziale dell organismo 20. Il trattamento dell EE classica, come anche delle altre forme della malattia, prevede la rimozione del ferro in eccesso per mezzo di flebotomie periodiche. Lo stato di ferrodeplezione o di normalizzazione del contenuto di ferro dell organismo viene in genere raggiunto con la iniziale rimozione settimanale di ml di sangue intero e successivamente mantenuto con poche sedute salassoterapeutiche all anno. Nei pazienti con EE la salassoterapia è solitamente ben tollerata senza che i pazienti sviluppino alcun grado di anemia. Nelle rare condizioni in cui sussiste una controindicazione assoluta alla salassoterapia sono invece indicati i chelanti del ferro 2,17. Emocromatosi ereditaria di tipo 2 (emocromatosi giovanile) L EE tipo 2 (EE giovanile) comprende in realtà due forme di sovraccarico primitivo di ferro clinicamente simili ma geneticamente distinte 2,17,19 : l EE di tipo 2A e l EE di tipo 2B. Il gene HJV, mappato nella regione 1q21 e costituito da 3 esoni codificanti, è responsabile del sottotipo di più frequente riscontro (EE di tipo 2A). L EE di tipo 2B, più rara, è causata da mutazioni in un gene di 3 esoni, denominato HAMP, localizzato in 19q13.1. Entrambi i geni codificano molecole con ruolo centrale nel metabolismo del ferro: l ormone epcidina (HAMP), il principale regolatore dell emostasi marziale ed emojuvelina (HJV), a sua volta regolatrice di epcidina. L emocromatosi giovanile è caratterizzata da un quadro clinico molto più grave rispetto a quello dell EE classica e da un età di esordio precoce in entrambi i sessi. La maggioranza dei soggetti manifesta i primi segni clinici relativi a danno d organo verso i 20 anni e, in alcuni casi, anche in età infantile. La sintomatologia clinica iniziale è generalmente a carico dell asse ipofisi-gonadi (amenorrea secondaria nella donna, impotenza nell uomo) e del cuore (cardiopatia dilatativa e scompenso cardiaco). La malattia può anche esordire con diabete mellito insulino-dipendente. In tutti i casi è anche interessato il fegato con frequente sviluppo di cirrosi epatica. L iperpigmentazione cutanea è precocemente evidente e l artropatia presente in quasi tutti i pazienti.

30 220 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Le due forme di EE di tipo 2 sono a trasmissione autosomica recessiva e comportano un massivo accumulo sistemico di ferro. Si manifestano in uguale proporzione ed alla stessa età nei maschi e nelle femmine. L emocromatosi giovanile, seppur rara, viene più frequentemente riscontrata nei paesi del centro-sud Europa 2,17,19,21. Emocromatosi ereditaria di tipo 3 Questa forma di EE, ritenuta estremamente rara (22 casi ad oggi riportati in letteratura), è di prevalente appannaggio della popolazione italiana 20. Nonostante lo scarso numero dei casi descritti non abbia reso possibile tracciarne con precisione la storia naturale, è ormai noto che il fenotipo associato all EE di tipo 3 mostra mediamente una gravità intermedia tra quello della EE classica e quello della EE giovanile. Le manifestazioni cliniche sono le stesse della forma classica ma l età d inizio dei segni di sovraccarico marziale tende ad essere più precoce ed il decorso della malattia più rapido. Allo stesso tempo, l esordio clinico in età infantile è insolito e l evoluzione dei sintomi è meno rapida rispetto all EE tipo ,25. L EE tipo 3 è causata da mutazioni bialleliche del gene TFR2, clonato, mappato e sequenziato nel Esso mappa sul cromosoma 7q22 ed è costituito da 18 esoni. Il suo prodotto proteico è il recettore 2 della transferrina (TFR2). Si ritiene che questa molecola, espressa prevalentemente nel fegato, sia in grado di percepire i livelli serici di ferro e di indurre, quando complessata con la proteina HFE, la sintesi del polipeptide epcidina 7. Emocromatosi ereditaria di tipo 4 L emocromatosi di tipo 4 è la forma più comune di EE non correlata al gene HFE e, per quanto ad oggi noto, la sola ad ereditarietà autosomica dominante 17,19,21. È dovuta a mutazioni eterozigoti di SLC40A1, gene costituito da 8 esoni che mappa nella regione 2q32. SL- C40A1 codifica per la proteina ferroportina, l unico esportatore cellulare di ferro presente nell organismo 1. Caratteristica aggiuntiva dell EE di tipo 4 è che essa si manifesta, a seconda del tipo di mutazione che ne è alla base, con due fenotipi clinici alternativi tra loro alquanto dissimili (figura 2) 17, Di fatto, un primo gruppo di pazienti con EE di tipo 4 (EE di tipo 4a) mostra, come prima manifestazione biochimica, un incremento dei livelli sierici della ferritina, ma, contrariamente a tutte le altre forme, valori normali o bassi della saturazione della transferrina. In questi casi, l accumulo di ferro avviene principalmente nelle cellule del sistema reticoloendoteliale ed è quindi spesso presente una lieve splenomegalia. È inoltre facile, a differenza di quanto avviene nelle altre forme, lo sviluppo di anemia nel corso del programma flebotomico. Responsabili di questo quadro clinico sono mutazioni eterozigoti di SLC40A1 che causano diminuzione o perdita di funzione alla proteina ferroportina. Un secondo gruppo di pazienti con EE di tipo 4 (EE di tipo 4b) presenta, invece, un fenotipo clinico molto simile a quello dell emocromatosi classica, e, al pari di quest ultima, precoce aumento dei livelli di saturazione della transferrina ed accumulo di ferro prevalentemente nelle cellule parenchimali. In questi soggetti le mutazioni in SLC40A1 determinano, invece, acquisizione di funzione al prodotto genico, conferendo a ferroportina resistenza alla degradazione (Figura 2). Fig. 2. Pathway regolativo di epcidina Rappresentazione parziale del complesso pathway che modula l espressione del principale regolatore dell omeostasi del ferro; il polipeptide epcidina, codificato dal gene HAMP. L induzione dell espressione di HAMP è mediata dalle proteine bone morfogenetic (BMPs) che si legano ai loro recettori (BMPR) sulla superficie cellulare degli epatociti causando la fosforilazione di SMAD1/5/8. HJV, nella sua forma non solubile, amplifica questo segnale. SMAD1/5/8 fosforilato forma un complesso con SMAD4 che trasloca nel nucleo dove lega il promotore di HAMP stimolando l espressione di quest ultimo. Il ruolo di HFE e TFR2 quali regolatori positivi di HAMP non è ancora ben chiaro ma è probabile che entrambi funzionino come sensori dei livelli della transferrina diferrica. TMPRSS6, gene responsabile di IRIDA, è un regolatore negativo di HAMP in quanto taglia il complesso BMP/BMPR/HJV.

31 S. Majore et al: Genetica della emocromatosi ereditaria 221 Approccio al paziente con sospetta malattia da alterato metabolismo del ferro L EE, benché codificata tra le malattie rare, è una delle patologie genetiche più frequenti ed una delle poche che si avvale di una terapia, la flebotomia periodica, capace di prevenire tutte le complicanze. Riconoscerne l esistenza prima della comparsa di qualsiasi danno da accumulo di ferro è dunque un obiettivo doveroso. La diagnosi di EE viene formulata sulla base di criteri clinici ed, eventualmente, di valutazioni di natura genetica 2, Il parametro biochimico che si rivela più precocemente alterato e che è più specifico per un iperassorbimento di ferro alimentare non è l iperferritinemia (che non ha valore di specificità), ma piuttosto la percentuale di saturazione della transferrina che corrisponde al rapporto tra la sideremia e la capacità totale della transferrina di legare il ferro (TIBC). Un valore di saturazione della transferrina ripetutamente uguale o superiore al 45% è generalmente indicativo di un sovraccarico marziale a livello ematico e deve quindi far sospettare la EE. Al contrario, nella EE, l aumento della ferritina è relativamente tardivo. La concentrazione sierica di tale proteina è di fatto direttamente correlata all entità del sovraccarico globale di ferro dell organismo e mostra, quindi, nei pazienti con EE, un incremento progressivo nel corso degli anni. Vengono considerati anomali valori >200 µg/l nella donna e >300 µg/l nell uomo. Qualora secondario ad eccesso di ferro, un valore di ferritinemia 1000 µg/l suggerisce, invece, la presenza di danno epatico. D altro canto, bisogna sempre tener conto che un iperferritinemia può essere osservata in molte affezioni, alcune delle quali, come ad esempio la sindrome dismetabolica e l epatopatia alcolica, di frequente riscontro. Pertanto, tale reperto, quando non associato ad aumento significativo della percentuale di saturazione della transferrina, richiede, in prima istanza, una diagnosi differenziale per altre patologie che possono associarsi ad iperferritinemia (Tabella 2). Va comunque considerato che la causa di iperferritinemia persistente è spesso benigna e che questa rimane sconosciuta in un alta percentuale dei casi. È però possibile che il recente riscontro, in circa il 50% dei casi con iperferritinemia benigna familiare, di una mutazione ricorrente nella regione codificante Tabella 2. Cause di iperferritinemia (non associate a significativo sovraccarico di ferro) Sindrome iperferritinemia-cataratta ereditaria Iperferritinemia benigna EE di tipo 4A Sindrome dismetabolica Infezioni Infiammazioni acute e croniche Patologie autoimmuni Neoplasie Abuso alcoolico Epatopatie acute e croniche Sindrome emofagocitica del gene L-ferritina, consentirà la caratterizzazione molecolare di molti di quei pazienti con iperferritinemia idiopatica 28. Il percorso diagnostico nei casi in cui gli indici biochimici suggeriscono piuttosto la presenza di sovraccarico marziale, prevede che il sospetto venga in ogni caso confermato da una biopsia epatica (d obbligo nei casi con ferritinemia >1000 µg/l) o mediante una metodologia non invasiva (risonanza magnetica, SQUID o MID) in grado di definire l entità del contenuto in ferro del parenchima epatico. In caso di esito positivo di un tale approfondimento vanno valutate, oltre all EE, anche le altre cause di sovraccarico marziale (Tabella 3). A causa delle possibili difficoltà diagnostiche e delle conseguenze multisistemiche di un sovraccarico cronico di ferro, l approccio clinico Tabella 3. Principali patologie associate a sovraccarico di ferro Sovraccarico primitivo EE di tipo 1(classica) EE giovanile di tipo 2A di tipo 2B EE di tipo 3 EE di tipo 4b Aceruloplasminemia Ipotransferrinemia congenita Mutazioni del gene DMT1 Sovraccarico secondario Anemie con eritropoiesi inefficace Anemie emolitiche Trasfusioni Somministrazione di ferro parenterale Epatopatie croniche Sindrome dismetabolica

32 222 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 del paziente che mostra una qualsivoglia alterazione degli indici biochimici del ferro, può comportare il coinvolgimento di più specialisti (ematologo, epatologo, oncologo, infettivologo, endocrinologo) 2,17,19. La valutazione genetica si inserisce nell ottica di una diagnosi differenziale con altre cause di sovraccarico marziale/iperferritinemia, nella gestione (prevalentemente a carattere preventivo) della famiglia e nella valutazione dell opportunità di eseguire test genetici di conferma. Una delle peculiarità della genetica medica, infatti, è che essa pone la massima attenzione non solo al paziente inteso come singolo individuo, ma alla intera famiglia, muovendosi principalmente nell ambito della prevenzione e, quando opportuno, della diagnosi prenatale. Nella medicina moderna, sempre più attenta alla diagnosi precoce come strumento principale per il miglioramento della qualità e delle attese di vita della popolazione e sempre più orientata alla razionalizzazione dei costi della spesa sanitaria, tale approccio è assolutamente imprescindibile da quello terapeutico della medicina classica. Nello specifico, la consulenza genetica può essere di ausilio per un corretto inquadramento diagnostico di quei casi che mostrano alterazioni persistenti degli indici del ferro e per individuare in fase presintomatica i familiari con genotipo a rischio di patologia. Le indagini molecolari per EE che possono essere oggi effettuate sono molteplici e soggette a progressivo ampliamento grazie alle nuove conoscenze che si rendono man mano evidenti. Il livello di approfondimento degli esami genetici è variabile e solo pochi laboratori di genetica medica sono in grado di eseguire studi di II livello. La mutazione p.c282y del gene HFE è la causa più frequente di EE ed è rilevabile allo stato omozigote nella maggior parte dei pazienti del Nord Europa. Tale mutazione, originata nella popolazione celtica, mostra una distribuzione secondo un gradiente negativo nord-sud. In Italia, il genotipo p.c282y/ p.c282y è presente in circa il 65% dei pazienti con diagnosi certa di EE ed, in particolare, solo nel 40% circa dei casi nell Italia del centro-sud ed in percentuale ancor minore in quella insulare. p.h63d, variante a bassa penetranza e a frequenza polimorfica, mostra invece una distribuzione ubiquitaria. L indagine molecolare di I livello per EE prevede generalmente la ricerca di queste due mutazioni e di p.s65c, un ulteriore mutazione del gene HFE riscontrata in una percentuale significativa dei pazienti.. L eventualità di procedere in casi selezionati ad un secondo livello d indagine necessita, tra l altro, di una attenta valutazione del rapporto costo/beneficio e della probabilità di ottenere un esito positivo. A seconda delle caratteristiche del singolo paziente e della sua famiglia è possibile approfondire l esame di HFE mediante lo studio di tutta la sua sequenza e/o la ricerca di delezione dell intero gene. In altri casi, è invece indicato esaminare dapprima uno o più geni tra HJV, HAMP o SLC40A1 nell intera sequenza codificante e nelle giunzioni esone-introne. La recente identificazione di una forma grave di EE nel topo associata al gene Bmp6 29 e, nell uomo, di una nuova molecola regolatrice di epcidina (TMPRSS6) 30, rendono altamente verosimile che a breve sarà possibile studiare nuovi geni responsabili di sovraccarico primitivo di ferro. Infine, grazie ai recenti avanzamenti delle conoscenze sarà possibile avere a disposizione nuovi strumenti per la diagnosi e la terapia delle patologie da alterato metabolismo del ferro. Di fatto, il dosaggio della forma attiva dell epcidina sierica o urinaria si sta già rilevando un parametro discriminante nella diagnostica differenziale delle condizioni associate ad eccesso o a carenza di ferro. Si ipotizza allo stesso tempo che la stessa epcidina e/o altre molecole che con essa interagiscono potranno essere presto utilizzate per la cura di alcune tra queste condizioni patologiche 5. Bibliografia 1. Papanikolaou G, Pantopoulos K. Iron metabolism and toxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 2005; 202: Pietrangelo A. Hereditary Hemochromatosis A New Look at an Old Disease. N Engl J Med 2004; 350: Shayeghi M, Latunde-Dada G O, Oakhill J S, et al. Identification of an intestinal heme transporter. Cell 2005; 122: Papanikolaou G, Tzilianos M, Christakis JI, et al. Hepcidin in iron overload disorders. Blood; 2005; 105: Lee PL, Beutler E. Regulation of hepcidin and iron-overload disease. Annu Rev Pathol. 2009; 4:

33 S. Majore et al: Genetica della emocromatosi ereditaria Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science 2004; 306: Darshan D, Anderson GJ. Interacting signals in the control of hepcidin expression. Biometals. 2009; 22: Trousseau A (1865). Glycosurie, diabète sucré. Clinique médicale de l Hôtel-Dieu de Paris 2: von Recklinghausen FD (1890). Hämochromatose. Tageblatt der Naturforschenden Versammlung 1889: Sheldon JH. Hemochromatosis. Oxford. Oxford University Press, Saddi R, Feingold J. Idiopathic haemochromatosis: an autosomal recessive disease. Clin Genet. 1974; 5: Simon M, Bourel M, Fauchet R, et al. Association of HLA-A3 and HLA B14 antigens with idiopathic haemochromatosis.gut. 1976; 17: Feder JN, Gnirke A, Thomas W, et al. A novel MHC class 1-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet 1996; 13: Beutler E, Pointon JJ, Fischer, et al. Mutation analisis in hereditary hemochromatosis.blood Cells Mol Dis 1996; 22: Lucotte G. Frequency analysis and allele map in favour of the celtic origin of the C282Y mutation in hemochromatosis. Blood Cells Mol Dis 2001; 27: Hanson EH, Imperatore G, Burke W. HFE gene and hereditary hemochromatosis: a HuGE review. Am J Epidemiol 2001; 154: Pietrangelo A. Hereditary hemochromatosis. Biochim Biophys Acta. 2006; 1763: Alexander J, Kowdley KV. HFE-associated hereditary hemochromatosis. Genet Med. 2009; 11: Camaschella C, Roetto A. New insights into iron homeostasis through the study of non-hfe hereditary haemochromatosis. Best Prac Res Clin Haematol 2005; 18: Ricerca BM, Radio FC, De Marinis L, et al. Natural History of TFR2-Related Hereditary Hemochromatosis in a 47-year-old Italian Patient. Eur J Haematol Jun 15. [Epub ahead of print] 21. Le Gac G, Férec C. The molecular genetics of haemochromatosis. Eur J Hum Genet. 2005; 13: Beutler E. Genetic irony beyond haemochromatosis: clinical effects of HLA-H mutations. Lancet. 1997; 349: Mura C, Raguenes O, Férec C. HFE mutations Analysis in 711 hemochromatosis probands: evidence for S65C implication in mild form of hemochromatosis. Blood 1999; 93: Pelucchi S, Mariani R, Bertola F, Arosio C, Piperno A. Homozygous deletion of HFE: the Sardinian hemochromatosis? Blood. 2009; 113: Majore S, Milano F, Binni F, et al. Homozygous p.m172k mutation of the TFR2 gene in an Italian family with type 3 hereditary hemochromatosis and early onset iron overload. Haematologica 2006; 91: Pietrangelo A. The ferroportin disease. Blood Cells Mol Dis 2004; 32: Létocart E, Le Gac G, Majore S, et al. A novel missense mutation in SLC40A1 results in resistance to hepcidin and confirms the existence of two ferroportin-associated iron overload diseases. Br J Haematol Aug 25. [Epub ahead of print] 28. Kannengiesser C, Jouanolle AM, Hetet G, et al. A new missense mutation in the L ferritin coding sequence associated with elevated levels of glycosylated ferritin in serum and absence of iron overload. Haematologica. 2009; 94: Meynard D, Kautz L, Darnaud V, Canonne-Hergaux F, Coppin H, Roth MP. Lack of the bone morphogenetic protein BMP6 induces massive iron overload. Nat Genet. 2009; 41: Finberg KE, Heeney MM, Campagna DR, et al. Mutations in TMPRSS6 cause iron-refractory iron deficiency anemia (IRIDA). Nat Genet. 2008; 40: Corrispondenza e richiesta estratti: Dr.ssa Silvia Majore Az. Ospedaliera S. Camillo-Forlanini, Roma

34 ANNALI DEGLI OSPEDALI San Camillo e Forlanini Volume 11, Numero 4, Ottobre - Dicembre 2009 Focus SARCOIDOSI SARCOIDOSIS: A FOREWORD CARMELO RAIMONDI Ambulatorio della Sarcoidosi - U.O.C. di Broncopneumologia e Tisiologia, Azienda Ospedaliera S. Camillo-Forlanini, Roma Parole chiave: Sarcoidosi Key words: Sarcoidosis La sarcoidosi è, tutt ora, una malattia di origine sconosciuta. La teoria oggi prevalente la vuole come il risultato dell esposizione ad uno o più agenti ambientali (talco, pollini, insetticidi, ecc.) microbici (Propionibacterium acnes, Mycobatteri, ecc.), virali (Retrovirus, Cytomegalovirus, ecc.) che agendo su un organismo geneticamente predisposto (in causa sembra essere il complesso maggiore di istocompatibilità HLA) innescano il relativo processo patologico. La mortalità è stimata tra l 1 ed il 5% ed è dovuta quasi esclusivamente all insufficenza respiratoria. In questo Focus abbiamo volutamente evitato di trattare l etiologia della sarcoidosi in quanto è stato nostro intendimento porre l accento sulla identificazione diagnostica e sul trattamento terapeutico di tale malattia: aspetti che, pensiamo, possano più immediatamente interessare gli specialisti nella loro pratica clinica quotidiana. Poiché si tratta di una patologia spesso multi sistemica che può interessare più organi e apparati risulta necessaria la cooperazione tra diversi specialisti. In quest ottica Franco Quagliarini sviluppa gli aspetti radiologici evidenziando il ruolo della TC torace ad alta risoluzione (HRCT) e della scintigrafia polmonare con gallio, Francesco Arienzo tratta dei patterns di fisiopatologia respiratoria, Paolo Graziano descrive accuratamente i caratteri anatomo-patologici, Giovanni Galluccio e Gabriele Lucantoni (con Paolo Battistoni, Sandro Batzella, Vito Lucifora e Raffaele Dello Iacono) con sintetica ma esaustiva trattazione ci illustrano le varie tecniche broncoscopiche, Rita Gasbarra (con Angela Di Lorenzo e Monica Bronzini) ci mostrano in dettaglio l importanza del Liquido di Lavaggio Broncoalveolare (BAL), Carmelo Raimondi (con Alfonso Maria Altieri, Marcello Ciccarelli, Salvatore D Antonio e Mario Giuseppe Alma) ci descrivono l esperienza di un ambulatorio dedicato alla sarcoidosi ponendo l accento sulla diagnostica, la terapia e la modalità di follow-up, chiude il Focus la Prof.ssa Paola Rottoli dell Università di Siena che, dopo un breve excursus sulla terapia tradizionale tratta (insieme con C. Olivieri ed E. Bargagli) delle nuove frontiere aperte dall impiego dell anti TNFα nel combattere la Sarcoidosi. Corrispondenza: Dott. C. Raimondi, Ambulatorio della Sarcoidosi, Az. Ospedaliera S. Camillo-Forlanini, Roma, UOC Broncopneumologia e Tisiologia, P.zza Forlanini, 1, Roma

35 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 225 LA SARCOIDOSI: QUADRI RADIOLOGICI SARCOIDOSIS: RADIOLOGIC FEATURES FRANCO QUAGLIARINI U.O.C. Radiologia Forlanini Azienda Ospedaliera S. Camillo Forlanini, Roma Parole chiave: Sarcodosi. Tomografia Computerizzata ad alta risoluzione Key words: Sarcoidosis. High Resolution Computed Tomography Riassunto La sarcoidosi è una malattia multi sistemica che può coinvolgere più organi. L interessamento polmonare è la forma più frequente ed è quella che coinvolge direttamente il radiologo. La stadiazione radiologica della sarcoidosi toracica è diffusamente accettata e costituisce un importante riferimento fra i vari specialisti che si interessano di questa malattia. Il radiologo attualmente può offrire un grosso contributo al clinico, grazie alle possibilità diagnostiche della TC ad alta risoluzione. La Tc ad alta risoluzione oltre a mostrare le alterazioni interstiziali (noduli, opacità lineari), evidenzia la loro distribuzione peribroncovascolare e lungo le limitanti pleuriche, particolarmente a livello delle scissure. La peculiarità dei quadri radiologici, permette di porre sia il sospetto di malattia che lo stadio. Abstract The sarcoidosis is a multisystemical disease which can involve numerous organs. The pulmonary involvement is the most frequent form and is the one which concerns directly the radiologist. The radiological staging of thoracic sarcoidosis is accepted everywhere and constitutes an important reference for the numerous specialist who are interested in this illness. The radiologist currently can offer a big contribution to the clinical, thanks to the diagnostic possibilities that the use of the High Resolution CT offers. The High Resolution CT shows interstial alterations (nodules, linears opacitys), underlines their distribution peribronchial and perivascular along the limiting pleura, particularly at the level of scissures. The pecuriality of radiological pictures allows to suspect both the illness and the stage. La sarcoidosi è una malattia cronica, ad eziologia ignota, che si localizza in tutte le sedi dove è presente il sistema istiocitario; è caratterizzata dalla formazione negli organi colpiti di granulomi non caseosi (e per questo che viene anche definita granulomatosi sistemica) e determina sovvertimento della normale architettura. Si tratta di una malattia multi sistemica a patogenesi immunologica che colpisce pazienti giovani o di media età, interessando vari organi: prevalentemente polmoni, linfonodi mediastinici, cute, occhi e più raramente altri distretti corporei quali fegato, milza (Fig.1), cuore, reni, apparato oste-muscolare e sistema nervoso. Le varie manifestazioni della malattia assumono caratteri diversi in rapporto con l età, il sesso, la razza e l area geografica 1. Il radiologo, nell esecuzione di un occasionale esame radiografico del torace, può sospettare la presenza di sarcoidosi e quindi richiedere l esecuzione di una TC ad alta risoluzione (HRCT) 2,3. Per l accertamento diagnostico della sarcoidosi è necessaria una sintesi fra aspetti clinici, radiologici, istologici, biochimici ed immunologi. Nella sarcoidosi polmonare, che interessa circa il 90% dei pazienti, il medico radiologo, pur intervenendo in seconda istanza in base al sospetto clinico di malattia, può offrire tuttavia un contributo fondamentale per confermare la diagnosi, grazie alla presenza di alcuni segni semeiologi caratteristici della malattia evidenziabili solo con l HRCT 4,5. L HRCT è un esame che va eseguito secondo precisi parametri tecnici (Tab 1).

36 226 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Fig. 1 - Donna di 70 anni con sarcoidosi al III Stadio e con granulomi epatici e splenici Tabella 1 Parametri Tecnici HRCT Collimazione mm 1-1,5 KV 120 Ma 200 Tempo di scansione 1-2sec Matrice 512x512 Algoritmo di ricostruzione frequenza spaziale alta (filtro per osso) Livello medio della finestra fra -500 e -700 UH Ampiezza finestra 1700 Con le TC di ultima generazione TCms (Tomografi computerizzati multistrato) tali problematiche sono state in parte superate poiché lo stesso esame può essere ricostruito in post processing con differenti algoritmi in base alle esigenze diagnostiche del radiologo. Nelle TCms più moderne è possibile impostare automaticamente alcuni parametri tecnici in modo da limitare al massimo la dose di radiazioni ai pazienti. Convenzionalmente la stadiazione della sarcoidosi intratoracica prevede 5 quadri radiologici: Stadio 0: Radiografia toracica negativa; Stadio I: Linfoadenopatia ilare; Stadio II: Linfoadenopatia ilare ed infiltrazione polmonare; Stadio III: Infiltrazione polmonare senza linfoadenopatia ilare; Stadio IV: Fibrosi polmonare. La classificazione radiologica è grossolana ma, per la sua semplicità ed immediatezza, viene di fatto riconosciuta e compresa in tutto il mondo. Lo stadio 0 comprende quei pazienti che non mostrano alterazioni al controllo radiologico del torace, pur presentando manifestazioni cliniche di sarcoidosi in altri organi (5%-10% dei casi). Lo Stadio I è quello che raggruppa in maggior numero di pazienti (50% dei casi): si tratta di pazienti che mostrano uno slargamento simmetrico del mediastino e un incremento volumetrico delle regioni ilari legati alla presenza di adenopatie; in questi casi va posta una diagnosi differenziale nei confronti dei linfomi Hodgkin e non Hodgkin (dirimente l esame istologico), della TBC (spesso monolaterale ed associata ad alterazioni parenchimali caratteristiche) e delle linfoadenopatie infettive non specifiche (che in genere mostrano un quadro emato-chimico che indirizza verso la diagnosi corretta). La diagnosi differenziale nei confronti delle pneumoconiosi silicotiche può essere posta in base ad alcuni aspetti radiologici caratteristici (calcificazioni a guscio d uovo ) e sulla positività dell esposizione lavorativa. Nello Stadio II l associazione di tumefazioni linfonodali e di lesioni parenchimali impegna notevolmente il radiologo, ma la valutazione accurata dei segni semiologici presenti all HRCT 4,5 pur nella loro molteplicità e variabilità, possono indirizzare correttamente la diagnosi (Tab. 2), tenendo sempre conto dell importanza dell anamnesi (Fig. 2). Le aree di air-trapping, apprezzabili nell HRCT eseguita in fase espiratoria sono un segno abbastanza aspecifico poiché possono presentarsi anche in presenza di altre patologie che interessano le piccole vie aeree: esse sono conseguenti alla presenza di granulomi sarcoidei all interno della mucosa del bronchiolo terminale, siano essi in fase attiva o in evoluzione fibrotica. La diagnosi differenziale va posta con la TBC miliare, la silicosi, la paracoccidiosi, l alveolite allergica e con altre interstiziopatie fibrosanti immunologiche. Nello Stadio III le alterazioni parenchimali sono analoghe a quelle del II stadio senza la presenza di linfonodi in sede mediastinica (Fig.3).

37 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 227 Tabella 2 Noduli a margini netti ed irregolari (Ø 1-5 mm) Situati lungo l interstizio peri-bronco-vascolare (sia centrale che periferico), a livello dei setti interlobulari, delle superfici pleuriche e lungo le scissure: distribuzione perilinfatica Distribuzione simmetrica, prevalente nei campi polmonari medio-superiori Aree di aumentata densità parenchimale con aspetto a vetro smerigliato Coesistenza di noduli di dimensioni maggiori di 1-2 cm Distribuzione irregolare per la contemporanea presenza di aree di parenchima sano e di aree di consolidazione di forma e dimensioni irregolari Presenza di aree di air trapping nelle scansioni assunte in fase espiratoria Slargamento del mediastino per la presenza di tumefazioni linfonodali bilaterali Fig. 2A - Maschio 37a sarcoidosi II stadio Fig. 2B - Maschio 53a micronoduli diffusi da metastasi da ADK polmonare Fig. 3 - RX 2p donna di anni 41 Sarcoidosi III stadio Il IV Stadio è sicuramente lo stadio più difficile da diagnosticare poiché le alterazioni sono a prevalente carattere fibrosante aspecifico, caratterizzate dalla distorsione del parenchima polmonare (conseguente a lesioni parenchimali di tipo reticolare), da un ispessimento irregolare dei setti interlobari con dislocazione dei bronchi. L eventuale presenza di polmone ad alveare è rara e sicuramente esprime una condizione di fibrosi irreversibile. In tale fase il polmone può andare incontro ad una riduzione di volume che interessa soprattutto i lobi superiori. In fase tardiva si possono creare delle masse conglobate a prevalente localizzazione parailare conseguenti alla confluenza di più addensamenti adiacenti, con associate alterazioni di tipo bronchiettasico e bronchioloectasico da trazione con bolle ed aree di enfisema paracicatriziale. La sarcoidosi, come del resto tutte le fibrosi polmonari, può causare un quadro di insufficienza respiratoria e una condizione di cuore polmonare cronico con ipertensione polmonare. Poiché il quadro della fibrosi polmonare è l evoluzione finale di molte patologie polmonari (infettive, da esposizione professionale, neoplastiche, immunologiche), la diagnosi differenziale è possibile soltanto quando si hanno tracce della patologia iniziale. I quadri radiologici della sarcoidosi possono essere estremamente complessi poiché si può andare incontro a riprese di malattia e quindi alla comparsa di nuove ondate di noduli (Fig.4) che possono localizzarsi sia su polmoni completamente guariti o sommarsi ad alterazioni fibrosanti precedenti. La medicina nucleare permette di ottenere altre informazioni valide ai fini della diagnosi e sullo stato di attività

38 228 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 della sarcoidosi. La metodica più utilizzata è la scintigrafia con Gallio marcato che può essere altamente diagnostica come ad esempio quando si rileva la caratteristica immagine del Panda a livello del cranio 6, che permette di visualizzare le aree di attività interessanti le ghiandole lacrimali e le parotidi. Tale segno sebbene non specifico e molto sensibile soprattutto nel I e II stadio (Fig. 5). Recentemente l introduzione della Pet- TC con (18)FDG ha stimolato molti studi nella sarcoidosi, sia per la diagnosi che nel follow-up dei pazienti in terapia 7. Bibliografia Fig. 4 - Giovane donna di 36 anni che dopo una prima fase di remissione completa presenta a distanza di 3 anni, una ripresa di malattia caratterizzata dalla comparsa di micronodulia diffusa 1. Agostini C, Semenzato G. La sarcoidosi. Giorn It Allergol Immunol Clin 2003;13: Costabel U, Ohshimo S, Guzman J. Diagnosis of sarcoidosis. Curr Opin Pulm Med Sep; 14(5): Miller BH, Rosado-de-Christenson ML, Mc Adams HP, et al. Thoracic Sarcoidosis: Radiologic-Pathologic Correlation. RadioGraphics 1995; 15 :42 l Webb W R, Muller N L.Naidich DP et al. Of The Lung Philadelphia Lippincott Willlams & Wilkins Maffessanti M, Dalpiaz G. Pneumopatie Infiltrative Diffuse: Clinica,Anatomia Patologica, HRCT Milano Springer-Verlag Karen A. Kurdziel, MD The Panda Sign Radiol 2000; 215: Prager E, Wehrschuetz M, Bisail B, Woltsche M et al. Comparison of 18F-FDG and 67Gacitrate in sarcoidosis imaging Nuklearmedizin. 2008; 47: Fig. 5 - Segno del Panda: Scintigrafia con Ga 67: a livello del cranio si evidenziano le aree di attività che interessano le ghiandole lacrimali e le ghiandole parotidee

39 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 229 ASPETTI ISTOPATOLOGICI DELLA SARCOIDOSI POLMONARE HISTOPATHOLOGIC FEATURES OF PULMONARY SARCOIDOSIS PAOLO GRAZIANO U.O.C. di Anatomia ed Istologia Patologica Azienda Ospedaliera S. Camillo Forlanini, Roma Parole chiave: Sarcodosi. Granulomatosi. Polmone Key words: Sarcoidosis. Granulomatosis. Lung Riassunto - La sarcoidosi è una malattia cronica granulomatosa multisistemica ad eziologia sconosciuta. Gli aspetti istopatologici ed il caratteristico pattern di distribuzione perilinfatico dei granulomi, integrati ad un approfondito studio clinico-radiologico, permettono di differenziare la sarcoidosi dalle altre malattie granulomatose polmonari. Abstract - Sarcoidosis is a chronic multisystemic granulomatous disease of unknown etiology. The histopathologic features and the characteristic perilymphatic distribution of granulomas, joined to an accurate clinical and radiological analysis, allow to differentiate sarcoidosis from the other granulomatous diseases of the lung. La sarcoidosi è una malattia cronica granulomatosa multisistemica ad eziologia sconosciuta caratterizzata dalla formazione di granulomi epitelioidi. In un appropriato contesto clinico-radiologico, l esame broncoscopico e l acquisizione di multipli campioni bioptici consentono generalmente di raggiungere la diagnosi di sarcoidosi. La caratteristica morfologica maggiormente significativa della sarcoidosi è rappresentata dalla presenza di granulomi ben definiti, non necrotizzanti, tipicamente confluenti (Fig. 1). I granulomi sono costituiti da aggregati di istiociti epitelioidi, talora commisti a cellule giganti multinucleate e ad una minor quota di elementi infiammatori e linfociti. I granulomi possono andare incontro ad un processo evolutivo che comporta parziale o totale sostituzione dei granulomi stessi ad opera di tessuto fibroso ialino. Il pattern di distribuzione dei granulomi è una delle caratteristiche maggiormente utili per il riconoscimento della sarcoidosi e per la sua distinzione da altre forme di granulomatosi polmonare. I granulomi della sarcoidosi si distribuiscono lungo le vie linfatiche (Fig. 2) e di conseguenza coinvolgono i setti interstiziali disponendosi lungo le arterie, le vene e i bronchi, sino ad interessare la pleura. I granulomi possono anche interessare la parete delle strutture vascolari, coinvolgendone la tonaca media ed intima e configurando aspetti di vasculite granulomatosa in assenza di necrosi del vaso. È opportuno rammentare come una minima quota di necrosi fibrinoide sia osservabile in circa il 20-30% dei granulomi rinvenuti in corso di sarcoidosi e che, nel parenchima polmonare circostante i granulomi, non sia usualmente osservabile una significativa quota di infiltrato infiammatorio. La coesistenza di un abbondante quota flogistica e di granulomi mal definiti, deve suggerire ipotesi diagnostiche alternative quali la polmonite da ipersensibilità, da aspirazione od un eziologia infettiva. Le cellule giganti dei granulomi possono contenere inclusioni citoplasmatiche non specifiche, rappresentate da corpi asteroidi e corpi di Schaumann o cristalli di ossalato di calcio birifrangenti alla luce polarizzata. Il pattern di distribuzione e le caratteristiche morfologiche descritte, se integrate ad un approfondito quadro clinico-radiologico, sono usualmente caratteristiche e coerenti con la diagnosi di sarcoidosi, ma non sono di per sé diagnostiche. Le principali condizioni patologiche che devono essere poste in diagnosi differenziale con la sarcoidosi includono le forme infettive, la berilliosi, le pneumoconiosi e la polmonite da ipersensibilità. Ogni volta che si rileva la presenza di un processo granulomatoso polmonare, soprattutto necrotizzante, è mandatorio lo studio colturale microbiologico ed il patologo deve necessariamente eseguire

40 230 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Fig. 1 - Caratteristici granulomi epitelioidei gigantocellulari non necrotizzanti Fig. 2 - Caratteristica distribuzione perilinfatica e subpleurica dei granulomi colorazioni istochimiche volte alla ricerca di eventuali forme microbiche che possano comprovarne l eziologia infettiva. Gli aspetti istopatologici in corso di berilliosi sono del tutto sovrapponibili a quelli evidenziabili nella sarcoidosi. La diagnosi di berilliosi è pertanto essenzialmente di pertinenza clinica e si basa principalmente sull accertamento di una storia di esposizione. Un accurata anamnesi patologica può sempre facilitare il corretto inquadramento di un processo granulomatoso polmonare ed accertare un eventuale eziologia da esposizione a polveri. La presenza di cristalli nelle cellule giganti e nei granulomi può suggerire anche la possibilità di una malattia da inalazione, che però, usualmente, non mostra la caratteristica distribuzione perilinfatica osservata nella sarcoidosi. Anche la polmonite da ipersensibilità (alveolite estrinseca allergica) può mostrare punti di somiglianza con la sarcoidosi. A differenza della sarcoidosi, nella polmonite da ipersensibilità i granulomi appaiono usualmente mal definiti e non ben circoscritti. Inoltre, nella sarcoidosi non si rileva quel prominente infiltrato infiammatorio bronchiolocentrico che coinvolge l interstizio polmonare e si associa ad aspetti di bronchiolite obliterante e di polmonite in via di organizzazione (BOOP) presenti invece nell alveolite allergica estrinseca. In conclusione, il patologo può sospettare, prospettare od avere elementi morfologici coerenti con la diagnosi di sarcoidosi. Le sole caratteristiche morfologiche, seppur suggestive, non sono patognomoniche di per sé e necessitano dell usuale integrazione con le informazioni cliniche, radiologiche e dei dati di laboratorio, in modo da escludere le altre forme di granulomatosi polmonare a differente eziologia ed a diverso trattamento terapeutico, che possono presentare aspetti sovrapponibili a quelli osservati in corso di sarcoidosi. Bibliografia essenziale Gilman MJ, Wang KP. Transbronchial lung biopsy in sarcoidosis. An approach to determine the optimal number of biopsies. Am Rev Respir Dis 1980; 122: Hunninghake GW, Costabel U, Ando M, et al. ATS/ ERS/WASOG statement on sarcoidosis. American Thoracic Society/European Respiratory Society/World Association of Sarcoidosis and other Granulomatous Disorders. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis; 1999; 16: Hsu RM, Connors AF Jr, Tomashefski JF Jr. Histologic, microbiologic, and clinical correlates of the diagnosis of sarcoidosis by transbronchial biopsy. Arch Pathol Lab Med 1996; 120: Leslie KO, Gruden JF, Parish JM, Scholand MB. Transbronchial biopsy interpretation in the patient with diffuse parenchymal lung disease. Arch Pathol Lab Med. 2007; 131: Review Sundaram B, Gross BH, Oh E, et al. Reader accuracy and confidence in diagnosing diffuse lung disease on high-resolution computed tomography of the lungs: impact of sampling frequency. Acta Radiol 2008; 49: 870-5

41 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 231 LA SARCOIDOSI: RUOLO DELLA FISIOPATOLOGIA RESPIRATORIA SARCOIDOSIS: SIGNIFIANCE OF RESPIRATORY PHISIOPHATOLOGY FRANCESCO ARIENZO U.O. di Fisiopatologia Respiratoria Azienda Ospedaliera S. Camillo Forlanini, Roma Parole chiave: Spirometria. Capacità di diffusione polmonare dell ossido di carbonio (DLCO), Sarcoidosi Key words: Spirometry. Diffusing Lung Capacity Carbon Oxide (DLCO). Sarcoidosis La Fisiopatologia respiratoria(fr) ha un ruolo limitato nella definizione diagnostica della Sarcoidosi ma diventa determinante per la valutazione del grado di impegno funzionale e quindi del decorso della malattia e della efficacia del trattamento terapeutico. È bene, dunque, affiancare sin dall inizio lo studio funzionale a quello clinico così da avere poi (la Sarcoidosi necessita spesso di trattamenti assai lunghi) un sicuro punto di riferimento.ci si può avvalere del contributo della FR nelle diverse fasi della respirazione: ventilatoria, della diffusione alveolo-capillare, circolatoria,della respirazione tissutale. La fase ventilatoria viene studiata essenzialmente con la Spirometria e la Pletismografia corporea; la fase della diffusione col il test della DLCO; la fase circolatoria con la Emogasanalisi e la Saturimetria dinamica. La fase della respirazione tissutale si può indagare indirettamente con il test da sforzo cardiorespiratorio completo della parte metabolica. Come è noto la Sarcoidosi viene distinta in quattro stadi anatomo-clinico-radiologici: lo stadio zero,quello dell adenopatia ilomediastinica isolata, quello parenchimale e quello della fibrosi.questa suddivisione non deve intendersi come assoluta perché in diversi casi può essere presente l interessamento parenchimale senza che sia documentabile quello linfonodale. Lo stesso interessamento parenchimale può non essere visibile radiologicamente ma rivelato dall esame istologico o dalla captazione scintigrafica.la fase della fibrosi può essere caratterizzata da diverso impegno funzionale anche con quadri radiologici simili.è proprio questa complessità anatomoclinica che può essere meglio definita dallo studio funzionale. Nello stadio zero lo studio funzionale deve escludere in assenza di anomalie radiologiche del torace un eventuale interessamento funzionale. Nella fase dell adenopatia le prove di funzionalità respiratoria sono normali e solo raramente vi è un interessamento spirometrico che mostra un lieve deficit restrittivo quando l impegno mediastinico è considerevole. La spirometria correlata con lo studio del volume residuo e dei parametri da questo derivabili è determinante negli stadi III e IV della malattia. Il danno funzionale principale caratteristico della Sarcoidosi florida è l Insufficienza Ventilatoria Restrittiva.Il deficit restrittivo è in rapporto all interessamento interstiziale ed allo sviluppo della fibrosi come in tutte le malattie fibrosanti. Lo stadio IV, caratterizzato da fibrosi irreversibile, può portare allo sviluppo di enfisema bolloso. Negli stadi piu conclamati si potra allora registrare una Insufficienza Ventilatoria Mista con componente ostruttiva non reversibile con broncodilatatore. Sempre nella Sarcoidosi florida l altro parametro caratteristico rilevabile nella fase della diffusione dei gas è la diminuzione della DLCO. Molti autori hanno però dimostrato che la diminuzione della diffusione del monossido di carbonio può essere presente in alcuni casi anche nelle fasi iniziali della malattia quando l interessamento parenchimale interstiziale non è visibile all esame RX torace e poco visibile anche all HRTC. È bene ricordare l importanza della membrana alveolo-capillare come unita morfofunzionale costituita da living alveolare,membrana alveolare,liquido interstiziale,endotelio capillare, plasma, membrana eritrocitaria. Quando la membrana alveolo-capillare si ispessisce

42 232 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 subito lo scambio di O2 si riduce mentre quello della CO2 rimane inizialmente inalterato poiche questo gas nei liquidi biologici è 24 volte più solubile e 20 volte piu diffusibile dell ossigeno. È con l Emogasanalisi che possiamo indagare sul trasporto dei gas nel sangue.l emogasanalisi si presenta inizialmente normale ma può mostrare anche una alcalosi respiratoria con una p O2 normale. Questo quadro è indotto dalla iperventilazioone che può caratterizzare clinicamente le primissime fasi della malattia e può arrivare sino ad uno scompenso con un valore del ph superiore ai 7,45: alcalosi respiratoria scompensata. Nelle fasi successive si potrà avere prima una ipossiemia normocapnica e solo successivamente, per quanto abbiamo gia detto,negli stadi avanzati della fibrosi polmonare, una ipossiemia con ipercapnia: acidosi respiratoria compensata o scompensata. Gli studi di molti autori sono stati indirizzati, naturalmente, all inquadramento funzionale nelle primissime fasi della Sarcoidosi. Accanto ai lavori già citati sulla possibile diminuzione della DLCO molti autori hanno dimostrato, sia pure in un numero ridotto di casi, un esordio della malattia con un Deficit Ventilatorio Ostruttivo. Ma ancora oggi non vi è una spiegazione chiara ed univoca di questa situazioni come per altro del riscontro,sia pur raro,di un aumento dell Iperreattività Bronchiale. Il test da sforzo cardiorespiratorio può permettere di individuare precocemente deficit che qualche volta non correlano con il quadro clinico. È importante ricordare, a tal proposito, che la Sarcoidosi è una malattia sistemica che può anche interessare il cuore e gli stessi muscoli respiratori. Per la loro semplicità di esecuzione sono assai utili il test del cammino (6mWT) e la saturimetria delle 24 ore che possono mostrare desaturazioni poco o non sospettate. Sinteticamente i risultati caratteristici dello studio funzionale nella Sarcoidosi sono i seguenti: Danno restrittivo con riduzione della capacità vitale (CV) e della capacità polmonare totale (CPT). Flusso d aria normale. Ridotta capacità di diffusione del monossido del carbonio (DLCO). Ipossiemia arteriosa che peggiora con lo sforzo fisico e nelle fasi più avanzate ipossiemia ed ipercapnia. Studi recenti mostrano correlazioni solo limitate tra lo studio funzionale e quello clinico condotto anche con biopsie. Concludendo tutto lo studio funzionale, iniziale e ripetuto nel tempo, permette un monitoraggio della patologia che è indispensabile affiancare allo studio clinico e biologico. Bibliografia essenziale Cardaci G: Fisiopatologia Cardiorespiratoria.Biomedicainternazionale, Roma 1995 Hamid Q, Shannon J, Martin J: Le basi fisiologiche delle patologie respiratorie, ed. it. Momento Medico, Salerno 2007 SARCOIDOSI POLMONARE: LA DIAGNOSTICA BRONCOSCOPICA PULMONARY SARCOIDOSIS: THE BRONCHOSCOPIC DIAGNOSIS GIOVANNI GALLUCCIO, GABRIELE LUCANTONI, PAOLO BATTISTONI, SANDRO BATZELLA, VITO LUCIFORA, RAFFAELE DELLO IACONO U.O.C. Endoscopia Toracica, Azienda Ospedaliera S. Camillo Forlanini, Roma Parole chiave: Lavaggio Broncoalveolare. Biopsia Transbronchiale. Agoaspirato Transbronchiale. Agobiopsia Transbronchiale Key words: Bronchoalveolar Lavage. Transbronchial Biopsy. Transbronchial Needle Aspiration. Transbronchial Needle Biopsy Riassunto - Con lo sviluppo e le evoluzione tecnologiche delle strumentazioni endoscopiche sia rigide che flessibili la broncoscopia ha assunto una diffusione vastissima, tanto da rappresentare oggi l esame principe nella diagnostica di una vasta gamma di patologie del torace.

43 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 233 La patologia immunologia dell interstizio polmonare si avvale in modo determinate, a fini diagnostici e studiativi, di numerose metodiche endoscopiche come il lavaggio bronco-alveolare, la biopsia transbronchiale, l agoaspirato transbronchiale e l agobiopsia transbronchiale. Abstract - The development and technological evolution of both rigid and flexible endoscopic instruments has widened so much that, at present time, the bronchoscopy is considered one of the most important exam in the diagnosis of thoracic diseases. For the diagnosis and study of the immunologic interstitial lung diseases there are many endoscopic techniques such as the broncoalveolar lavage, the transbronchial biopsy, the transbronchial needle aspiration and the transbronchial needle biopsy. Definizione La sarcoidosi è una malattia infiammatoria cronica, ad eziologia sconosciuta, che può colpire qualsiasi organo con predilezione per il distretto toracico. È una patologia caratterizzata dalla presenza di granulomi non caseificanti, da una aumentata risposta dei linfociti helper tipo1 (Th1) e dei fagociti mononucleati in sede di malattia e da un incremento nella produzione di numerose citochine e chemochine infiammatorie. A livello polmonare è presente una reazione immunitaria linfocitaria che interessa gli spazi aerei e l interstizio polmonare, denominata alveolite; questa è caratterizzata da essudazione alveolare, dall espansione delle cellule infiammatorie,sia a livello degli spazi alveolari che dell interstizio,dei linfociti T e dei macrofagi alveolari evidenziabili nel liquido di lavaggio alveolare (BAL). Tecniche Diagnostiche L approccio diagnostico per i pazienti affetti da sarcoidosi comprende metodiche come il lavaggio broncoalveolare (BAL), la biopsia transbronchiale (TBB), l agoaspirato transbronchiale (TBNA), la biopsia transcarenale con ago rigido (TBNB) ed eventuali tecniche chirurgiche più invasive mediante VATS, mediastionoscopia e toracotomia. LAVAGGIO BRONCOALVEOLARE (BAL) Il lavaggio broncoalveolare (BAL) consiste nella instillazione di soluzione fisiologica in piccole quote ripetute nelle vie aeree distali e nel recupero dell aspirato per l analisi delle componenti cellulari e non cellulari. Si tratta di una tecnica che differisce concettualmente dal semplice aspirato bronchiale in quanto la instillazione ed il recupero di materiale riguardano il tratto bronchiolo-al- veolare le cui cellule e i vari componenti non cellulari sono rappresentativi del sistema infiammatorio ed immunitario di tutto il tratto respiratorio inferiore. Tecnica Il BAL va eseguito dopo una esplorazione routinaria di tutto l albero bronchiale, prima di manovre quali biopsie o brushing che potrebbero contaminare con sangue il materiale recuperato. Usualmente si preferiscono il bronco lobare medio o la lingula per l effettuazione dell esame al fine di sfruttare per quanto possibile l effetto della gravità per migliorare il recupero in relazione alla posizione anatomica dei suddetti lobi. La punta del broncoscopio viene fatta avanzare fino a farla incuneare in un bronco subsegmentario, ciò produce una aderenza tra la parete bronchiale e lo strumento e limita il reflusso di liquido (e quindi la perdita di materiale) durante la aspirazione. Successivamente si instilla un totale di almeno 100ml di soluzione fisiologica pre-riscaldata a 37 (il riscaldamento riduce la tosse e il broncospasmo). La instillazione si effettua in boli ripetuti di 20-50ml. Dopo ogni bolo e una attesa di circa 30 secondi si aspira il liquido. Normalmente il recupero è intorno al 40-60% con variazioni legate soprattutto alla tendenza al collasso bronchiale in pazienti affetti da BPCO. Una eccessiva pressione di aspirazione può comunque causare un collasso bronchiale e ridurne il recupero. Durante la manovra di aspirazione è importante mantenere il canale operativo del fibroscopio al centro del bronco e quindi non preoccuparsi di vedere completamente il lume stesso in quanto in questo caso il canale operativo potrebbe aderire alla parete, più che vedere è importante posizionarsi in base al liquido che si riesce ad aspirare. La quantità totale di liquido di lavaggio dovrebbe

44 234 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 essere tra i 100 e 150 ml, volumi maggiori non modificano le concentrazioni di cellule recuperate e sono associate a maggiore morbilità. Quale che sia il volume dei boli di lavaggio in genere la prima aliquota viene utilizzata per esami di tipo batteriologico e citodiagnostico ma non per la valutazione della concentrazione di cellule o per le sottopopolazioni linfocitarie in quanto il recupero della prima aliquota rappresenta un lavaggio di cellule e materiale non cellulare proveniente da bronchi distali e non da bronchioli o alveoli. Effetti collaterali In pratica corrispondono a quelli della fibrobroncoscopia eseguita in anestesia locale. I più frequenti effetti collaterali comprendono infiltrazione alveolare, broncospasmo, febbre, ipossia lieve. Complicanze gravi si possono verificare nello scompenso cardiaco grave (edema polmonare) o nei pz con insufficienza respiratoria grave (peggioramento della ipossiemia). Il sanguinamento è assolutamente infrequente anche in caso di coagulopatia o trombocitopenia. Fattori di rischio Estesi addensamenti polmonari, ipossiemia (PaO2<60mmHg o SatO2< 90%) VEMS <1l; PT <50%, piastrine< , asma bronchiale. Utilità clinica del BAL Si ritiene che nella storia naturale delle patologie interstiziali del polmone il primo processo anatomicamente riconoscibile sia l alveolite cioè l aumento del numero di cellule a funzione infiammatoria ed immunitaria nell interstizio e anche all interno dell alveolo. Il BAL rappresenta una possibilità importante per conoscere le popolazioni cellulari presenti nell ambiente alveolare durante l evoluzione di una patologia interstiziale. Alcuni pattern cellulari sono tipici di forme particolari di interstiziopatia anche se tranne rari casi non possono essere considerati in assoluto definitivi per la diagnosi ma vanno interpretati nel contesto della storia della malattia, e del quadro complessivo clinico-radiologico. In corso di sarcoidosi è caratteristico l aumento dei linfociti nel liquido di lavaggio alveolare, in particolare i CD4 che sono considerati i marcatori dell alveolite in fase acuta. Il rapporto CD4/CD8 è aumentato e valori tra 3,5 e 4,0 sono virtualmente diagnostici ma sempre in relazione al quadro clinico complessivo in quanto la diagnosi di sarcoidosi rimane ancora legata alla definizione istologica. Va inoltre ricordato che al momento della diagnosi il 30% dei pazienti ha un rapporto CD4/ CD8 normale e il 10% può avere un rapporto diminuito. Nella sarcoidosi avanzata (quadro fibrotico) si può riscontrare un aumento della conta dei neutrofili. Un aumento del numero di mastociti oltre lo 0,5% sembra indicare una tendenza evolutiva negativa. BIOPSIA TRANSBRONCHIALE (TBB) Le biopsie transbronchiali vengono in genere eseguite con pinze bioptiche di piccole dimensioni in grado di prelevare campioni di tessuto polmonare posto tra due bronchioli ramificati oppure frammenti di parete bronchiolare. Individuata la zona della lesione con l ausilio delle immagini TC, si introduce il broncoscopio flessibile (Fig.1) nel bronco segmentario e lo si incannula; si procede quindi all in- Fig. 1 troduzione delle pinze nel canale di lavoro. È possibile anche utilizzare una guida radioscopica (Fig. 2), con la quale si può raggiungere con maggiore sicurezza la zona da sottoporre a prelievi bioptici. Una volta incannulato il bronco si fuoriuscire la Fig. 2

45 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 235 pinza e la si spinge perifericamente sino alla zona subpleurica; a questo punto si ritira lievemente la pinza e la si chiude per eseguire il prelievo di parenchima polmonare. Agoaspirato transbronchiale (TBNA) L impiego di aghi flessibili (Fig. 3) attraverso il canale operativo del broncoscopio flessibile consente di prelevare materiale citologico o anche istologico (a seconda del tipo di ago) da quasi tutte le stazioni linfoghiandolari peribronchiali. In caso di masse linfonodali (linfoadenopatie infiammatorie o neoplastiche) in sede paratracheale destra e sinistra, precarenale, in finestra aorto-polmonare, sottocarenale, oppure localizzate sotto gli speroni di divisione dei grossi bronchi, il prelievo transbronchiale è possibile, grazie al rapporto di contiguità con l albero bronchiale. Le uniche stazioni non raggiungibili sono le mediastiniche anteriori e posteriori e le sotto-sottocarenali. I rapporti fissi fra le singole stazioni linfonodali e trachea e bronchi hanno consentito di stabilire una vera e propria mappa dei punti da pungere per l agoaspirato. In questo modo è possibile non solo caratterizzare eventuali linfoadenopatie, ma anche ottenere una stadiazione preoperatoria in caso di neoplasie polmonari. È comunque sempre opportuna una accurata localizzazione topografica effettuata con esame TAC con contrasto, anche al fine di escludere la presenza di una vascolarizzazione anomala o di laghi sanguigni nel contesto del tessuto. La penetrazione dell ago è limitata a 1,5 cm e l esame TAC deve informare Fig. 3 della disponibilità di questo spazio di sicurezza nel contesto della massa. La metodica è sicura e le complicanze (sanguinamento, pnx, pneumomediastino) molto rare, vanno evitate stazioni troppo vicine a grossi vasi. Agobiopsia transbronchiale (TBNB) Dopo l introduzione di un tracheoscopio rigido in anestesia generale si usa un ago rigido, retto, a ghigliottina (Flexitemno). Si tratta di uno strumento caratterizzato da una camicia metallica, ed un ago rigido al suo interno (16-19 G). Quest ultimo, dietro la punta, ha una scanalatura di circa 1 cm per la raccolta del frustolo di tessuto è collegato ad un dispositivo a molla tramite un bottone che permette di caricare e far scattare la camicia sopra di esso a mo di saracinesca di ghigliottina (Fig. 4). L ago viene introdotto nel canale Fig. 4 Fig. 5 del broncoscopio rigido e la punta inserita nel sito del prelievo (Fig. 5). Dopo aver penetrato interamente la parete tracheale o bronchiale, si ottiene la resezione di una carota di tessuto mediante lo scatto della saracinesca della ghigliottina. Il frustolo viene fissato in formaldeide e quindi incluso per l esame istologico (Fig. 6). Sono raggiungibili con questa metodica le stazioni linfonodali sottocarenali (N7 sec. Naruke), paratracheali destre, ilari. Il materiale ricavato è abbondante e consente una precisazione istologica anche in patologie ematologiche o immunologiche complesse. Fig. 6

46 236 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Tabella 1 - Controindicazioni dell agobiopsia transcarenale Assolute Diatesi emorragica Trombocitopenia Uremia Relative Ipertensione polmonare Ostruzione vena cava superiore Controindicazioni e complicanze Tabella 2 - Complicanze dell agobiopsia transcarenale Poco frequenti Rare Emorragia paratracheale Pneumotorace Febbricola Pneumomediastino Fig. 7 Le controindicazioni assolute (Tabella 1) comprendono la diatesi emorragica, per trombocitopenia e uremia, mentre tra quelle relative sono da annoverare l ipertensione polmonare e l ostruzione della vena cava superiore la quale, causando un circolo collaterale attraverso l emiazygos, ne determina un aumento dimensionale che, in caso di puntura accidentale dell ago in questa sede, può provocare un emorragia paratracheale ed ematomi. Fatta eccezione per questo caso, la regione carenale è priva di strutture vascolari importanti, e quindi il rischio di emorragia è minimo.le complicanze (Tabella 2) sono rare e sono rappresentate da piccola emorragia alla rimozione dell ago dalla parete tracheo-bronchiale, saltuaria comparsa di febbricola con emocoltura negativa, ed infine qualche rarissimo caso di pneumotorace o pneumomediastino. Processi della più svariata natura possono colpire i linfonodi mediastinici: infettivi, granulomatosi, linfoproliferativi, neoplastici. La metodica endoscopica più efficace prevede il posizionamento preliminare di un broncoscopio rigido avente un calibro sufficientemente ampio. In tal modo sarà possibile introdurre nel lume dello strumento aghi rigidi taglienti, con o senza parte terminale a ghigliottina, di grosso calibro (inferiore ai 20 G), che consentono il prelievo di carote di tessuto adeguate alla lavorazione istologica. L importanza di poter effettuare un prelievo sufficientemente grande sono intuitive secondo il giusto principio che maggiore è la quantità di tessuto patologico asportata migliori sono le probabilità per il patologo di fare una corretta diagnosi istologica. È evidente inoltre che l utilizzo del broncoscopio rigido consente anche un adeguato controllo dell emostasi in caso di sanguinamento nel punto del prelievo ( e questa rappresenta l unica vera complicanza di tale esame diagnostico). Il limite tecnico della procedura è legato alle dimensioni della massa sottocarenale in rapporto alla lunghezza della parte penetrante dell ago; è buona norma pertanto una valutazione preliminare caso per caso delle masse sottocarenali mediante TAC del torace (Fig. 7) onde esser certi di avere tessuto bioptizzabile sufficiente attorno alla all ago stesso e non rischiare di penetrare in mediastino. Quanto detto non esclude tuttavia la possibilità di un approccio diagnostico endoscopico diverso nella diagnostica delle masse sottocarenali e non solo. Più semplicemente l esame può essere eseguito con broncoscopio flessibile ed utilizzare aghi flessibili che generalmente hanno un calibro inferiore a quelli utilizzati in broncoscopia rigida. In tal caso il patologo è in grado di analizzare uno striscio citologico che, inevitabilmente, per quanto detto sopra, ha una minore sensibilità diagnostica. Bibliografia 1. American Thoracic Society. Statement on Sarcoidosis. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: Prakash UBS. Broncoscopia. Mayo Foundation Ed Raven Press 3. European Respiratory Monograph Endoscopia Polmonare e tecniche bioptiche. Vol. 5 Monografia 3 Dicembre EdiAIPO Scientifica

47 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 237 IL BAL NELLO STUDIO DELLA SARCOIDOSI BAL IN SARCOIDOSIS RITA GASBARRA, ANGELA DI LORENZO, MONICA BRONZINI U.O.C. di Anatomia ed Istologia Patologica, Azienda Ospedaliera S. Camillo - Forlanini, Roma Parole chiave: BAL. Citofluorimetria. Rapporto CD4/CD8. Sarcoidosi Key words: BAL. Flow cytometry. CD4/CD8 ratio. Sarcoidosis Riassunto - La metodologia di studio del BAL, semplice nell esecuzione e tollerabile per il paziente, fornisce informazioni per la diagnosi differenziale delle alveoliti. Nel nostro laboratorio viene eseguita sia l immunofenotipizzazione della popolazione linfocitaria del pellet, sia l analisi citologica e il citogramma. Un rapporto CD4/CD8 uguale o superiore a 4 ha una sensibilità superiore al 50% ed una specificità del 94-96% per la diagnosi di sarcoidosi, e comunque, per valori inferiori, un aumento della quota linfocitaria e un relativo aumento della quota di CD4, può rivelarsi utile al supporto della diagnosi clinica. Di particolare interesse risulta inoltre l apporto del BAL nel follow-up delle sarcoidosi. Abstract - The bronchoalveolar lavage (BAL) analysis, a procedure of easy performance and good tolerance for the patient, gives useful information in the differential diagnosis of alveolitis. In our laboratory, lymphocyte immunophenotyping on the pellet obtained by BAL centrifugation, cytological examination and cytogram are routinely performed. In sarcoidosis a CD4/CD8 ratio of 4 or more has respectively a sensitivity over 50% and a specificity of 94-96%. Anyway, lower values together with increased number of lymphocytes and CD4 amounts might be helpful in supporting clinical diagnosis of sarcoidosis. In follow-up of patients affected by sarcoidosis, BAL study seems to be of great interest. La metodologia di studio del BAL, proposta nel 1974 da Reynords e Newball, è stata paragonata ad una finestra sul polmone. Essa infatti consente di studiare la componente cellulare dell alveolite e di monitorare i fenomeni immunologici che hanno luogo in sede polmonare. Sulla esecuzione ed sulla interpretrazione dei risultati del BAL sono oggi disponibili linee guida formulate dall American Thoracic Society, dall European Respiratory Society e dal Gruppo di studio di Endoscopia Toracica dell AIPO sulla esecuzione del broncoaspirato e sulla interpretrazione dei risultati. La semplicità di esecuzione dell indagine e la sua ottima tollerabilità anche nei pazienti critici, ha portato allo sviluppo e all applicazione della metodica nella pratica clinica, anche se con alterne vicende di critiche ed entusiasmi. In ogni caso lo studio delle cellule recuperate con il BAL ha dato luogo ad una nuova semiologia cellulare del polmone profondo che ha dimostrato come le risposte infiammatorie polmonari siano differenti rispetto a quelle dell organismo. Le informazioni di rilevanza clinica che si ottengono dalla processazione del liquido recuperato sono: Valutazione della cellularità totale a livello broncoalveolare Analisi morfologica cellulare Tipizzazione immunofenotipica citofluorimetrica Indagini batteriologiche Indagini chimiche I principali problemi che il laboratorio deve affrontare nello studio del BAL riguardano la standardizzazione di alcuni passaggi chiave quali: la sede del lavaggio, la tipologia del fluido impiegato, le fasi della processazione del liquido recuperato, la definizione dei valori di normalità. Nella nostra esperienza il campione del lavaggio broncoalveolare viene accettato entro 1 ora dal prelievo, affinché la vitalità cellulare rimanga entro limiti accettabili,che abbiamo fissato intorno al 60%. In caso di tempi prolungati, si consiglia il trasporto ed il mantenimento in ghiaccio, fino al momento della lavorazione. Dopo un filtraggio su doppio

48 238 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 strato di garza inumidita in PBS, per allontanare muco e detriti macroscopici, il BAL viene centrifugato a 1000/1200g per 10. Delle due fasi ottenute, quella liquida, o sovranatante, viene utilizzata per indagini chimiche (dosaggio di citochine,proteinosi ecc) mentre quella solida o pellet, che contiene la frazione cellulata, viene impiegata per l esame citofluorimetrico. Il pellet, risospeso in una quantità di PBS tale da ottenere una concentrazione approssimativa di 1x 10 6 cellule/ml, viene utilizzato per la immunofenotipizzazione. La determinazione dell immunofenotipo linfocitario si esegue nel nostro laboratorio con un citofluorimetro FACScan BD impiegando triplette di anticorpi, secondo lo schema seguente: CD45/CD3/CD4 linfociti T helper CD45/CD3/CD8 linfociti T suppressor CD45/CD3/CD19 linfociti T e B totali CD45/CD3/CD16+56 linfociti Natural Killer (NK) Per l acquisizione e l elaborazione dei dati viene impiegato il programma Multiset della Becton Dickinson, che impiega provette dedicate per la conta assoluta e identifica e quantizza i diversi subsets. Mediante l anticorpo CD45, infatti, si identifica la popolazione linfocitaria, che servirà per definire il Gate di interesse, e all interno del gate così definito, gli altri anticorpi classificheranno le diverse sottopopolazioni in percentuale numerica. Almeno 3000 eventi riconosciuti dal citofluorimetro come appartenenti alla serie linfocitaria vengono analizzati per singolo test. Il volume di liquido inviato al laboratorio, il recupero cellulare ottenuto (cell/ml) e la quantità di emazie totali vengono registrati come parte integrante del referto. I vetrini per l esame citologico ed il citogramma alveolare vengono allestiti su citocentrifugati colorati in MGG. L esame morfologico contiene informazioni rilevanti il citotipo e le sue caratteristiche (tipico, atipico, benigno o maligno) e la presenza di eventuali forme batteriche e/o fungine. L osservazione alla luce polarizzata può evidenziare presenza di corpi birifrangenti (silicati) e l eventuale presenza di fibre o manubri quali i corpi dell asbesto. La presenza di un eccessiva quota epiteliale (> 3%) indica un prelievo in sede bronchiale e quindi non rappresentativo del reale ambiente alveolare. In casi particolari possono essere eseguiti esami immunoistochimici mirati ad identificare citotipi specifici quali le cellule del Langherans (CD1a+). Nel soggetto normale non fumatore il citogramma, seppure con ampie variazioni, si attesta su un range come sottoriportato: 90-97% di macrofagi 3-8% di linfociti 0,5-3% di neutrofili La sensibile variazione di queste percentuali orienta verso diagnosi differenziali ad es. un alveolite linfocitaria accompagna una sarcoidosi o una polmonite da ipersensibilità mentre un alveolite eosinofila differenzia una polmonite eosinofila o un alveolite macrofagica accompagna un istiocitosi X o una sarcoidosi al 1 stadio). In ambito clinico acquista particolare significato la valutazione della quota B e T linfocitaria e delle cellule T a fenotipo CD4+ o CD8+. Sono riportati di seguito valori di normalità, non confrontabili con quanto ottenibile con lo studio sul sangue periferico: CD3 pan T 77% del gate linfocitario (65-88%) CD4 helper 49% (36-62%) CD8 suppressor 27% (15-40%) CD19 pan B 7% (3-12%) CD16+56 NK 5% (1-14%) È possibile l invio di campioni per esami microbiologici (batteri, virus, miceti, protozoi, ecc.) o citologici, in base al contesto clinico specifico. Oltre alla valutazione dell intensità e del tipo di alveolite e al monitoraggio della infiammazione durante il trattamento, le possibilità diagnostiche possono essere risolutive solo in un numero limitato di malattie, quali la già citata Istiocitosi X CD1a positiva, la proteinosi alveolare, la berilliosi, la polmonite lipoidea esogena (polmonite da aspirazione). In un ampio gruppo di patologie il pattern cellulare del BAL, pur non fornendo elementi di sufficiente specificità da risultare diagnostici, può essere di supporto alla diagnosi clinica ed orientarla più correttamente. È questo il caso della sarcoidosi. La malattia, ad interessamento polmonare, nella fase iniziale presenta un quadro citologico al BAL con aumento della cellularità totale rappresentato dalla popolazione linfocitaria attivata, che risulta prevalentemente di tipo helper (CD4+). Il rapporto CD4/CD8 uguale o

49 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 239 Fig.1a Fig.1b Fig.1c Fig.1d Fig. 1a L area R1 identifica il campo; Fig. 1b UR: linfociti CD45+/CD3+ (linf.t) di analisi, CD45+ (gate) UL: linfociti CD45+/CD19+ (linf.b); Fig. 1c UR: linfociti CD3+/CD4+ (T-Helper); Fig. 1d UR: linfociti CD3+/CD8+ (T-Suppressor) Fig. 1 - Studio citofluorimetrico delle sottopopolazioni linfocitarie Legenda: UL = quadrante superiore sinistro; UR= quadrante superiore destro; LL = quadrante inferiore sinistro; LR = quadrante inferiore destro superiore a 4 ha una sensibilità superiore al 50% ed una specificità del 94-96% per la diagnosi di sarcoidosi. Interessante è il confronto dello studio delle sottopopolazioni linfocitarie eseguito su liquido di lavaggio broncoalveolare con quello su sangue periferico. In quest ultimo infatti è presente una quota normale o lievemente diminuita di linfociti CD4+, a fronte dell aumento descritto nell ambiente alveolare. È sottoriportato un esempio di referto di BAL fornito dal nostro laboratorio riferito ad un paziente affetto da sarcoidosi (Figg. 1-2). Nello studio si evidenzia il forte aumento della quota linfocitaria (55%) e il valore del rapporto H/S > 4 (15,5), in questo caso altamente diagnostico per sarcoidosi. Volume accettato ml: 23 Cellule esaminate: /ml Vitalità: 90% Rapporto H/S = 15.5 CD3 = 98% CD19 = / % CD4 = 92% CD8 = 6% CD16+56 = 2% CD45 = 100% = 61% degli eventi totali Formula Macrofagi = 23% Linfociti = 55% Neutrofili = 20% Eosinofili = 2% Fig. 2 - Referto relativo allo studio delle sottopopolazioni linfocitarie e citogramma in paziente affetto da sarcoidosi

50 240 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Conclusioni Nella diagnostica delle pneumopatie infiltrative diffuse il BAL può risultare diagnostico in un numero limitato di patologie; tuttavia spesso può rivelarsi utile al supporto della diagnosi clinica o può orientarla più correttamente.di particolare interesse risulta l apporto del BAL nella diagnosi e nel follow-up delle sarcoidosi. Bibliografia essenziale AIPO Gruppo di Studio Lavaggio Broncoalveolare ed Indagini Biologiche in Pneumologia. Standard tecnico-operativo del Lavaggio Broncoalveolare. Rassegna di Patologia dell Apparato Respiratorio 1998, 13: American Thoracic Society (a). Clinical role of bronchoalveolar lavage in adults with pulmonary disease.am Rev Respir Dis 1990; 142: American Thoracic Society (b). Medical section of the American Lung Association.Statement on Sarcoidosis.Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: Clinical guidelines and indications for bronchoalveolar lavage (BAL). Report of the European Society for Pneumology Task group on BAL. Eur Resoir J 1990; 3: Costabel U. Diagnostic problems: bronchoalveolar lavage (BAL) The Menarini Series on Pneumology, 2000; 16-7 Ghio P et al. La gestione del lavaggio bronco-alveolare nel laboratorio di citometria a flusso. Lettere GIC 2000; 3: Marruchella A, Fiorenzano G, Dottorini M. L applicazione clinica del Lavaggio Broncoalveolare nell adulto. Rassegna di Patologia dell Apparato Respiratorio 2001; 16: Reynolds HY. Bronchoalveolar lavage. Am Rev Respir Dis 1985; 135: ESPERIENZA DI UN AMBULATORIO PER LA SARCOIDOSI TRIAL OF AMBULATORY FOR SARCOIDOSIS CARMELO RAIMONDI, ALFONSO MARIA ALTIERI, MARCELLO CICCARELLI, SALVATORE D ANTONIO, MARIO GIUSEPPE ALMA Unità operativa complessa di Broncopneumologia e Tisiologia, Azienda Ospedaliera S. Camillo - Forlanini, Roma Parole chiave: Sarcoidosi. Steroidi. Diagnosi differenziale Key words: Sarcoidosis. Steroids. Differential diagnosis Riassunto - Gli autori presentano 151 casi di Sarcoidosi nei loro aspetti diagnostici e terapeutici. Abstract - The Authors, introduce 151 cases of Sarcoidosis with their diagnostic and therapeutic expressions. La Sarcoidosi è caratterizzata da infiltrati infiammatori granulomatosi non caseificanti che possono interessare ogni organo ed apparato anche se il polmone è l organo più colpito (nel 90% dei casi)¹; seguono il sistema linfatico (30%), la cute(25%), il sistema muscolo-scheletrico (25-39%), il fegato (50-80%), l occhio (11-83%), il sistema nervoso centrale periferico (10%), il cuore (5%), le parotidi, la milza, l apparato gastro-enterico, la tiroide, il rene e così via. La Sarcoidosi può simulare molte altre malattie granulomatose (berilliosi, istoplasmosi, ecc.) ma, in primis, la tubercolosi: è quindi necessario effettuare una corretta diagnosi differenziale. Nella nostra Azienda Ospedaliera esiste l Ambulatorio dedicato alla Sarcoidosi presso la U.O.C. di Broncopneumologia e Tisiologia. A tale ambula-

51 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 241 Tabella 1 Numero pazienti Età media Età alla diagnosi DONNE UOMINI GLOBALE Rapporto donne/uomini = 1,35 torio hanno avuto accesso, a tutt oggi, 151 pazienti affetti sicuramente da tale malattia. Nella Tabella 1 sono riportati l età media di tali pazienti e l età media in cui è stata posta la diagnosi. La diagnosi posta attorno ai 50 anni di età è da imputare probabilmente, a nostro avviso, ad una ancora non adeguata conoscenza della malattia da parte di molti operatori sanitari e contemporaneamente, al carattere spesso sfumato e non sempre persistente dei primi sintomi che così vengono presi in considerazione talora solo a distanza di anni dalla loro prima presentazione. All ambulatorio accedono pazienti spesso inviati da altre strutture anche per il solo sospetto clinico di malattia. Noi procediamo nel seguente modo: a) Per i pazienti con diagnosi istologica ci avvaliamo della revisione dei preparati istologici da parte dei nostri colleghi del Servizio di Anatomia Patologica dell Azienda, allenati a confrontarsi quotidianamente con questa patologia; con tale iter i preparati istologici di due pazienti hanno portato ad escludere la sarcoidosi. b) Per i casi di sospetta malattia procediamo alla esecuzione o al completamento degli accertamenti radiologici, strumentali e clinici. In ambulatorio vengono seguiti pure i pazienti dimessi dal nostro reparto con diagnosi di Sarcoidosi: interessante notare che ben 26 di essi erano stati avviati al ricovero per altre patologie che potevano simulare la Sarcoidosi. Da questo punto di vista ci troviamo in una posizione privilegiata in quanto, ricoverando e trattando malati di pertinenza tisiologica, il personale medico del reparto è abituato costantemente a formulare diagnosi differenziale tra TBC ed altre malattie granulomatose. Nella Tabella 2 sono riportati i dati inerenti ai casi ricoverati nel reparto, poi transitati nell ambulatorio, ed i casi di accesso diretto all ambulatorio. La Tabella 3 mostra le sedi e la metodica di prelievo per la diagnosi istologica. Nella Tabella 4 riportiamo la classificazione in stadi della Sarcoidosi polmonare basati sulla radiografia standard del torace; anche se la TC torace ad alta risoluzione (HRCT) talora ci mostra una stadiazione non corrispondente a quella ricavata Tabella 3 Sede e metodica di prelievo per Pazienti diagnosi istologica Mediastinoscopia o Toracoscopia 46 video assistita (biopsia linfonodi toracici) Biopsia trans-bronchiale o transcarenale 29 in corso di fibrobroncoscopia Biopsia linfonodi periferici 17 Biopsia della cute 16 Biopsia del fegato 5 Biopsia della milza 2 Biopsia altre sedi (parotidi, labbra) 7 Totale 122 Diagnosi istologica su un totale di 122 pazienti Tabella 4 Stadio Radiografia del Torace 0 Normale I Linfoadenopatie ilari bilaterali (LIB) II LIB più infiltrati polmonari III Infiltrati polmonari IV Fibrosi polmonare Tabella 2 TIPO Diagnosi di accesso Numero Diagnosi confermata Sospetta TB polmonare 15 0 In reparto TB polmonare 5 0 Altre diagnosi 6 0 Sospetta Sarcoidosi 8 6 In ambulatorio Sarcoidosi su base clinica Sarcoidosi su base istologica Totale di prima diagnosi di sarcoidosi confermata su base clinica o istologica effettuata ambulatorialmente ed in regime di ricovero: 58

52 242 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Tabella 5 Stadio Pazienti 0 25 I 27 II 29 III 49 IV 21 dalla radiografia, è norma internazionalmente riconosciuta continuare a basarsi sulla radiografia standard. Nella Tabella 5, quindi, è possibile osservare la distribuzione in stadi dei pazienti affetti dalla forma polmonare. Corre l obbligo di precisare che la maggior parte dei pazienti con malattia allo stadio IV soffriva già da diversi anni della patologia quando è pervenuta alla nostra osservazione; di questi pazienti tre erano affetti da grave insufficienza respiratoria (si trovavano in ossigenoterapia continua) ed erano non responders ai farmaci: due di essi sono successivamente deceduti ed uno è stato inviato per essere sottoposto, con successo, a doppio trapianto di polmone. La localizzazione della malattia nei vari organi ed apparati è mostrata nella Tabella 6 dove abbiamo, fra l altro, differenziato l interessamento polmonare da quello anche polmonare. Alla voce altri organi sono riportati solo 5 casi e ciò si identifica nell interessamento prevalente di tali organi, anche se, ad esempio, fegato e milza sono interessati in percentuale maggiore, ma molto secondariamente negli altri casi. Le patologie preesistenti alla diagnosi di sarcoidosi erano numerose e varie; da notare (Tab. 7) le oculopatie, le discrasie ematiche, le cardiopatie, i distiroidismi, patologie tutte riportate in letteratura come manifestazioni di accompagnamento o anche come manifestazioni prodromiche della sarcoidosi. Tabella 7 Patologie preesistenti Pazienti Ipertensione arteriosa 30 Distiroidismi 27 Ernie iatali con reflusso GE 15 Cardiopatie 15 Discrasie ematiche 14 Diabete mellito 12 Oculopatie 13 Ansia depressione 11 Pregressi K operati 10 Gastriti croniche 10 Cisti renali 8 Cisti epatiche 6 Litiasi renali 6 Diverticolosi coliche 6 Gammapatie monoclonali 5 Litiasi biliari 5 cerebropatie 4 ipoalbuminemie 3 Cisti spleniche 2 Litiasi parotidee 2 Insufficienza renale cronica 2 Ulcera duodenale 2 Diabete insipido 1 Deficit fattore XII 1 Nella Tabella 8 sono riportati i sintomi e le manifestazioni di esordio della patologia sarcoidea che presentano maggiore rilevanza statistica; abbiamo omesso le manifestazioni percentualmente minori Tabella 8 Sintomi di esordio Tabella 6 Tipo di sarcoidosi Pazienti Polmonare 86 Polmonare e linfonodi periferici 17 Linfonodi periferici 9 Polmonare e altri organi 21 Cutane 9 Altri organi 5 Polmonare e pleurica 2 Midollare 1 Muscolare 1 Tosse 29% Dispnea 18% Toracoalgie 7% Astenia 24% Mialgie 12% Artralgie 11% Febbricola 10% Linfonodi superficiali 9% Eritema nodoso 9% Noduli sottocutanei 8% Lesioni cutanee 6% }54% (33-50%) }23% (25-39%) }23% (25%)

53 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 243 Tabella 9 Quando iniziare il trattamento Pazienti sintomatici (tosse, dispnea, astenia, ecc.) Linfonodi ilo-mediastinici aumentati di volume Interstiziopatia polmonare in evoluzione Interessamento oculare, cutaneo, cardiaco, neurologico Linfonodi retroperitoneali iperplastici Ipercalcemia/ipercalciuria (ad esempio idrartro al ginocchio); tra parentesi abbiamo riportato le percentuali riferite dalla WA- SOG¹ (World Association of Sarcoidosis and Other Granulomatous Disorders); notiamo come le nostre osservazioni siano sostanzialmente coincidenti con tali dati. Una questione che non sempre trova unanimità di consensi fra gli studiosi ed i clinici consiste nell individuare il momento in cui iniziare il trattamento terapeutico. Noi concordiamo con quanto specificato nella Tabella 9 e sui relativi fattori che, anche singolarmente, autorizzano l intervento terapeutico. La terapia, d altronde, è tuttora prevalentemente basata sugli steroidi come farmaci di prima scelta. Il dosaggio indicato (Tab. 10) è puramente orientativo in quanto, ovviamente, deve essere adattato al peso corporeo del paziente, alla sua tollerabilità ed alla dose comunque efficace caso per caso; tale terapia deve essere iniziata a dosaggi pieni che vanno poi ridotti gradualmente fino alla cessazione della stessa nell arco di nove-dodici mesi, valutandone già dopo i primi tre-quattro mesi l efficacia e regolandosi di conseguenza in un attento follow-up nei mesi successivi. I pazienti vengono preventivamente informati sui possibili effetti collaterali della terapia ed educati a coglierne in tempo i primi segni con controllo periodico della glicemia, della pressione arteriosa, degli elettroliti sierici, controllando nel contempo la densitometria ossea con MOC e ponendoli sotto costante protezione gastrica preferibilmente con inibitori di pompa protonica. Quando lo steroide presenta controindicazioni (diabete non ben controllato, scarsa compliance, ecc.) si possono adoperare con discrete possibilità di successo farmaci di seconda linea come metrotessato, azatioprina e gli altri elencati sempre nella Tabella 10, da soli o meglio associati a basse dosi di steroidi quando possibile. I farmaci suddetti sono stati da noi impiegati come specificato nella Tabella 11. Non sono stati trattati 24 pazienti che, a nostro avviso non rientravano nei criteri richiedenti terapia. Negli altri pazienti, in tre casi lo steroide ha evidenziato un diabete latente (comunque sempre in pazienti con uno od entrambi i genitori già diabetici) in un caso l assunzione di metotressato, già solo nell arco di una settimana, è coincisa con anomalie ematiche che, indagate, hanno condotto ad identificare un linfoma non Hodgkin sulla preesistente sarcoidosi; in altri due casi si è imposta la sospensione del farmaco per innalzamento persistente dei valori degli enzimi epatici; a parte queste tre situazioni il metotressato si è rivelato ben tollerato ed efficace soprattutto nel ridurre le tumefazioni dei linfonodi mediastinici che avevano resistito al solo steroide; molto efficace anche l idrossiclorochina per le manifestazioni cutanee talora deturpanti (specie al viso) di pazienti ovviamente monitorati dai colleghi oculisti prima, durante e dopo tale terapia per cui non abbiamo mai dovuto registrare i possibili temuti effetti collaterali a carico dell apparato visivo. A tutt oggi, 23 pazienti necessitano attualmente di terapia di mantenimento in quanto la sospensione della stessa è coincisa con la ripresa dei segni di malattia (aumento delle tumefazioni linfonodali in dimensioni e numero, ripresa della ipercalciuria, ecc.); intendiamo come terapia di mantenimento un dosaggio di prednisone di 5-15 mg o di metilprednisolone di 4-12 mg. Possiamo pertanto affermare che l armamentario terapeutico di cui disponiamo oggi ci permette se non di guarire almeno di poter mantenere sotto accettabile controllo la malattia, tenendo però Tabella 10 Farmaci usati nella sarcoidosi Prednisone-metilprednisolone mg/die Metotrexate 7,5-20 mg/sett. Azatioprina mg/die Ciclofosfamide 50/150 mg/die Idrossiclorochina 200 mg/die Infliximab 50/150 mg/die Altri farmaci utilizzati: Minociclina, Doxiciclina, Pentossifilina, Talidomide, ecc. Tabella 11 Terapia Farmaco pazienti Steroide 99 Steroide + Metotrexate 15 Steroide + idrossiclorochina 9 Steroide + ciclofosfamide 1 Steroide + idrossiclorochina+azatioprina 1 Steroide + azatioprina 3 Nessuna terapia 24

54 244 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Tabella 12 Responder alla terapia Stabili dopo fine della terapia da un minimo 25 di sei mesi ad un massimo di 4 anni Tuttora in terapia di mantenimento 23 Attualmente in trattamento 71 Recidive poi rispondenti alla ripresa della 5 terapia a dosaggi inizialmente maggiori del trattamento iniziale Totale 124 Non responder alla terapia Decessi per insufficienza respiratoria 2 Doppio trapianto polmonare con successo 1 Totale 3 sempre ben presente che la sarcoidosi è, per definizione, una malattia capricciosa, che mostra un atteggiamento spesso imprevedibile con improvvise riaccensioni che possono presentarsi da pochi mesi a molti anni dopo la fase terapeutica. Per tale motivo, nella Tabella 12, abbiamo preferito definire stabili e non guariti coloro che avevano completato con successo la terapia, poiché se vera guarigione sarà intervenuta, lo si potrà affermare solo dopo un congruo numero di anni. I pazienti che avevano presentato localizzazioni polmonari (ormai asintomatici), vengono controllati ambulatorialmente in follow-up con il seguente programma: radiografia standard del torace con dosaggio della calciuria delle 24 ore ed esami ematochimici di routine ogni 6 mesi e per 3 anni. TC torace con cadenza annuale per i primi 3 anni. radiografia standard del torace con periodicità annuale dal 4 anno in poi. Bibliografia essenziale ATS/ERS/WASOG Statement on Sarcoidosis. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis 1999; 16: TERAPIA DELLA SARCOIDOSI CON ANTI-TNFα THERAPY FOR SARCOIDOSIS WITH ANTI-TNFα P. ROTTOLI, C. OLIVIERI, E. BARGAGLI Dipartimento di Medicina Clinica e Scienze Immunologiche, Sezione Malattie Respiratorie, Università di Siena, Siena-Italia Parole chiave: Sarcoidosi. Terapia. Anti-TNFα Key words: Sarcoidosis. Therapy, Anti-TNFα Introduzione La terapia della sarcoidosi è tuttora oggetto di dibattito, anche se non vi sono stati cambiamenti essenziali negli ultimi vent anni relativamente ai farmaci di prima scelta e agli schemi terapeutici impiegati 1,2. Le ultime linee guida internazionali sulla malattia risalgono al Consensus dell ATS/ERS del , ma una revisione delle raccomandazioni terapeutiche non è stata ancora formulata, anche se sono uscite numerose reviews sull argomento 4,5. Indubbiamente i corticosteroidi restano il cardine della terapia nel trattamento iniziale del paziente, pur con il limite di non pochi effetti collaterali, sebbene negli ultimi dieci anni siano stati condotti vari studi, controllati e osservazionali, volti alla ricerca di nuovi farmaci mirati più a modificare la storia naturale della malattia che al solo controllo dei sintomi 6. Infatti la mancata conoscenza dell eziologia della sarcoidosi ha condizionato pesantemente il trattamento e la notevole variabilità dell esordio e dell andamento clinico creano non poche difficoltà nelle scelte terapeutiche per la esigenza sia di controllare la sintomatologia che di prevenire la progressione della malattia. Altri punti non ancora completamente definiti sono l indicazione al trattamento e il timing al trattamento, cioè stabilire con esattezza quali pazienti

55 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 245 devono ricorrere alla terapia, quando iniziare il trattamento e quanto proseguirlo nel tempo. Infatti non tutti i pazienti con sarcoidosi devono essere trattati, ad esempio se sono asintomatici o hanno una sarcoidosi polmonare al primo stadio o una sindrome di Lofgren secondo le linee ATS/ERS non necessitano di terapia 2. Se i pazienti sono sintomatici o hanno una forma polmonare progressiva o coinvolgimento extrapolmonare con compromissione funzionale di organi vitali devono effettuare terapia sistemica. In particolare la terapia è indispensabile in caso di coinvolgimento cardiaco, neurologico, muscolare, oculare, se c è ipercalcemia o se la malattia persiste in un arco di tempo variabile da due a cinque anni 3. Quest ultima condizione è definita sarcoidosi cronica ed è caratterizzata dalla persistenza della malattia con un quadro di infiammazione cronica che richiede una terapia a lungo termine 5. Questi sono criteri generali ma mancano parametri precisi e condivisi che permettano di stabilire con sufficiente certezza che la malattia è attiva e progressiva 7. In genere la terapia comunemente utilizzata si basa sull impiego di corticosteroidi alla dose di attacco di 20-40mg/die (0,5 mg/kg di peso corporeo), a scalare fino a raggiungere un dosaggio di mantenimento in grado di conservare nel tempo il miglioramento ottenuto con la terapia, 5-15mg/die. Il trattamento non si interrompe prima di 9-12 mesi e, se vi è evidenza di ripresa della malattia, si valuta la possibilità di riprenderlo. Un attento monitoraggio del paziente si rende necessario non solo per valutare la risposta alla terapia, ma anche per la tossicità legata ad un trattamento a lungo termine con steroidi o nel caso siano stato utilizzati farmaci immunosoppressori quali il metotrexate o l azatioprina. Spesso, infatti, il paziente non rimane aderente a cicli protratti di terapia, come quelli che si rendono necessari in questa malattia, a causa dei frequenti effetti collaterali e delle complicazioni legate al trattamento, da qui la necessità di avere a disposizione varie opzioni terapeutiche che siano basate sulle nuove conoscenze dei meccanismi patogenetici della sarcoidosi e sul fenotipo dei pazienti 4,8. Poichè la sarcoidosi è una malattia infiammatoria granulomatosa cronica, le ricerche verso nuovi approcci terapeutici hanno preso spunto dallo studio delle citochine coinvolte nei complessi processi immuno-infiammatori che portano alla formazione del granuloma epitelioide senza necrosi caseosa, elemento patognomonico della malattia 2,9. Tra queste, particolare interesse è stato rivolto verso il TNF α, una potente citochina proinfiammatoria prodotta principalmente dai monociti e dai macrofagi alveolari. È stato dimostrato che colture di macrofagi alveolari ricavati dal liquido ottenuto con il lavaggio broncoalveolare in pazienti con sarcoidosi attiva rilasciano spontaneamente elevati livelli di TNF α 10 e, confrontando i livelli di questa citochina tra pazienti con sarcoidosi e controlli sani, sono emersi valori significativamente più alti nei malati rispetto ai controlli 11. A conferma del ruolo chiave del TNFα nella sarcoidosi attiva Ziegenhagen et al. riportavano che i pazienti affetti da sarcoidosi che peggiorava nell arco di sei mesi presentavano valori iniziali maggiori di TNFα rispetto ai pazienti con sarcoidosi stabile 12. Tutte queste osservazioni hanno creato una base razionale per l impiego di molecole in grado di bloccare il TNFα prima che si leghi con il suo recettore e determini l attivazione cellulare che porta alla cascata di citochine infiammatorie. I farmaci con azione specifica verso il TNFα attualmente disponibili sono l infliximab, l etanercept e l adalimumab, comunemente utilizzati nella cura delle malattie infiammatorie croniche reumatiche. Attività antitnf α è attribuita anche ad altri farmaci come la talidomide o la pentossifillina. Pertanto sarà considerata la letteratura disponibile sull utilizzo di queste molecole nella sarcoidosi. Infliximab È un anticorpo monoclonale chimerico che lega sia il TNF α libero che quello presente sulla superficie delle cellule e, attivato il complemento, porta alla lisi cellulare 13. Viene utilizzato nel trattamento dell artrite reumatoide, della spondilite anchilosante, dell artrite psoriasica e del morbo di Crohn. Il primo studio che parla dell utilizzo dell infliximab nella sarcoidosi resistente ad altri trattamenti risale al ; da allora in letteratura sono comparsi diversi case reports che descrivono il suo impiego nel trattamento della sarcoidosi 15-17, in particolare nelle localizzazioni cutanee 18, 56, oculari 19, neurologiche e polmonari 23. Sulla base di questi studi è stato effettuato uno studio di fase II in doppio cieco, randomizzato, multicentrico, placebo-controllo effettuato su 138 pazienti affetti da sarcoidosi polmonare cronica sottoposti a terapia con due diverse dosi di infliximab 16. Lo studio, iniziato nel settembre 2003 e conclusosi nell agosto 2004, prevedeva la somministrazione di infliximab endovena alla dose di 3 o 5 mg/kg oppure placebo alle settimane 0, 2, 6, 12, 18, 24. I pazienti sono stati selezionati in base al coinvolgimento polmonare della sarcoidosi,

56 246 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 provata istologicamente ed a valori di FVC compresi tra il 50% e l 85% del valore predetto. L end point primario era la variazione dei valori di FVC dopo 24 settimane. I pazienti trattati con infliximab presentavano un miglioramento, peraltro modesto (2,5%), della capacità vitale forzata rispetto ai controlli dopo 24 settimane di terapia. La risposta alla terapia con infliximab risultava nella analisi post hoc più significativa per quei pazienti che presentavano un quadro più grave di malattia, evidenziato da un volume corrente più basso e da una durata maggiore del quadro clinico. Successivamente l efficacia dell infliximab è stata indagata nel trattamento della sarcoidosi extrapolmonare dimostrando una significativa riduzione del grado di interessamento extrapolmonare nei pazienti trattati con infliximab (3 o 5 mg/kg) rispetto al gruppo placebo 24. Judson et al. dimostravano che la terapia con infliximab migliorava la sarcoidosi extrapolmonare, sebbene tutti i pazienti arruolati nello studio continuassero a prendere una dose di corticosteroidi e non avessero una diagnosi istologica di sarcoidosi extrapolmonare 24. Questo dato ha portato gli autori ad affermare che l infliximab può apportare benefici nei pazienti con sarcoidosi extrapolmonare già in terapia con corticosteroidi. Questi risultati in realtà sono stati oggetto di critica (in particolare l impiego di un nuovo score per quantificare il coinvolgimento extrapolmonare chiamato Extrapulmonary Physician Organ Severity Tool) e la reale efficacia dell infliximab nella sarcoidosi extrapolmonare resta ancora da definire 25. Etanercept È un recettore solubile del TNFα che, legatosi a questa molecola, ne inibisce competitivamente il legame con il suo recettore presente sulla superficie cellulare. È utilizzato per il trattamento dell artrite reumatoide, della spondilite anchilosante, dell artrite psoriasica e della psoriasi 26. Ad oggi, gli studi clinici condotti per provare l efficacia del farmaco nel trattamento della sarcoidosi non hanno provato nessuna evidenza di miglioramento, anzi aumenta il numero dei case report che parlano dell insorgenza della sarcoidosi in pazienti affetti da malattie reumatiche e trattati con questo farmaco. Il primo case report sull utilizzo dell etanercept nella sarcoidosi con coinvolgimento cutaneo ed articolare risale al Nello stesso anno Utz et al. provarono l utilizzo dell etanercept nei pazienti con sarcoidosi polmonare in stadio II e III, ma furono costretti ad interrompere lo studio perché i pazienti svilupparono una progressione della malattia 28. Successivamente è stato condotto un secondo studio in doppio cieco randomizzato sull utilizzo dell etanercept in 18 pazienti affetti da sarcoidosi cronica oculare, refrattari alla terapia con methotrexate 29. Ai pazienti venivano somministrati 25 mg di etanercept per via sottocutanea due volte a settimana. Sebbene il farmaco venisse ben tollerato dai pazienti, il suo utilizzo non è stato associato ad un miglioramento effettivo dei pazienti considerati né fu raggiunto l end point primario dello studio che era la riduzione della terapia steroidea con l etanercept. Alcuni reports hanno evidenziato che la somministrazione intraarticolare di etanercept è stata usata con successo per trattare un paziente affetto da artrite cronica sarcoidea 30 e con vasculite sarcoidea refrattaria ad altri trattamenti 31. Adalimumab Anticorpo monoclonale umanizzato diretto contro il TNFα 32 e utilizzato nell artrite reumatoide e psoriasica. Si somministra sottocute piuttosto che per via endovenosa come l infliximab. Attualmente in letteratura esistono soli pochi case reports che descrivono il suo utilizzo in pazienti affetti da sarcoidosi cronica. Due case report presentano dei pazienti con sarcoidosi cutanea resistente alla terapia con altri farmaci, ma responsiva all adalimumab 33, 34. Callejas-Rubio et al. 35 descrivono il primo caso di sarcoidosi polmonare che risponde con successo al trattamento con adalimumab quando nessun altro trattamento era risultato efficace. Gli autori riportano che dopo la somministrazione di 40 mg di adalimumab per due settimane il paziente presentava una riduzione della tosse e della dispnea oltre che una regressione della linfoadenopatia ilare. Attualmente si è concluso un trial volto a verificare la sicurezza e l efficacia dell adalimumab in 11 pazienti con sarcoidosi polmonare cronica, sintomatici. I dati non sono stati ancora pubblicati. Reazioni avverse associate alla terapia con anti TNFα L impiego di questi farmaci richiede molta attenzione specialmente perché possono aumentare il rischio infettivo, in particolare è stato segnalata, specialmente per infliximab, la possibilità di riattivare la tubercolosi dovuta all azione soppressiva sull immunità cellulo-mediata. Uno screening accurato del paziente da trattare con esclusione di soggetti ad alto rischio e in casi selezionati una profilassi antibiotica possono minimizzare questa possibile complicazione 36,37.

57 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi 247 In modo analogo appare aumentato il rischio di contrarre infezione da Listeria monocytogenes, sebbene i casi riportati in letteratura ricevessero farmaci immunosoppressivi contemporaneamente alla terapia con anti TNFα 38. Vari disordini immunologici sono stati riferiti come effetti collaterali attribuiti all utilizzo di questi farmaci 39 e, tra questi, dobbiamo segnalare anche casi di sarcoidosi insorta durante il trattamento con anti TNF α utilizzati per la cura di malattie croniche infiammatorie, specialmente per l artrite reumatoide. Si tratta di case reports che evidenziano questo strano effetto paradosso, dovuto probabilmente al disequilibrio citochinico che ha portato alla comparsa di sarcoidosi polmonare durante il trattamento con infliximab 40,41, adalimumab 42 ed etanercept 43 e che si è risolto dopo l interruzione della terapia. Tra le reazioni avverse è stato segnalato un aumentato rischio di sviluppare tumori linfoproliferativi, soprattutto linfomi non Hodgkin, e scompenso cardiaco 44, 45. Risulta pertanto fondamentale una accurata valutazione iniziale ed un attento follow up dei pazienti in trattamento ad intervalli regolari, con grande attenzione verso i parametri di laboratorio. L impiego di questi farmaci va limitato a Centri Specialistici competenti. Purtroppo interrotta la terapia i pazienti possono presentare riattivazioni della malattia quindi per un corretto e sicuro utilizzo di questi farmaci si rendono necessari trials clinici prospettici, randomizzati, in doppio cieco, con un gran numero di pazienti, in modo da poter stabilire il dosaggio ottimale e la durata della terapia a lungo termine, valutandone anche la possibile tossicità. Ad oggi l evidenza ricavata da trials clinici dotati di queste caratteristiche per supportare l uso di questi farmaci risulta ancora limitata, gli studi in corso sono piccoli, con un numero esiguo di pazienti arruolati e con la segnalazione di numerosi eventi avversi 46. Altri farmaci che inibiscono la produzione di TNF alpha: thalidomide e pentossifillina Insieme a farmaci che agiscono legandosi al TNF già formato inattivandolo, vi sono altre molecole che invece ne inibiscono la produzione e che sono state oggetto di studi. La talidomide agisce sopprimendo il rilascio di TNF da parte dei macrofagi alveolari 47,48, ma sembra possedere anche attività anti-infiammatorie e anti-angiogenetiche che rendono il suo meccanismo d azione ancora non del tutto chiaro. È stata usata con successo nella terapia della sarcoidosi cutanea cronica (49,50) ad un dosaggio di 100 mg/die mentre non è risultata efficace nel trattamento della sarcoidosi polmonare (51). Inoltre non possono essere omessi gli effetti collaterali legati all uso del farmaco, per lo più dose correlati, come lo sviluppo di sonnolenza, costipazione, rash, neuropatia periferica e la ben nota teratogenicità (52). La pentossifillina è una metilxantina che agisce aumentando i livelli di camp e determinando come conseguenza una ridotta espressione del gene del TNF quindi una minore produzione di TNF α da parte dei fagociti mononucleati ed in particolare dei macrofagi alveolari 53,54. In uno studio clinico del 1997 su un numero limitato di casi, 23 pazienti affetti da sarcoidosi, la pentossifillina sembrava promettere una buona risposta nella terapia della sarcoidosi polmonare progressiva ad un dosaggio di 25 mg/kg al giorno 55. Gli effetti avversi riferiti erano di natura gastrointestinale fatta eccezione per qualche raro caso di pancitopenia o epatite tossica. Nel 1999 è iniziato un nuovo studio randomizzato, in doppio cieco, in pazienti con sarcoidosi polmonare già in terapia con corticosteroidi. L obiettivo dello studio era di valutare l efficacia della pentossifillina nei pazienti con sarcoidosi polmonare. Lo studio non è ancora concluso 57. Conclusioni Sulla base dei dati della letteratura risulta che pur avendo i farmaci ad attività anti TNF α un rationale per il loro impiego basato sul coinvolgimento del TNF α nella patogenesi della malattia, non abbiamo ad oggi una dimostrazione chiara della loro efficacia basata su evidenze indiscutibili. I pochi studi clinici controllati non hanno dato i risultati sperati, questo può dipendere da vari fattori e non necessariamente dalla scarsa attività di queste molecole nella sarcoidosi. Infatti potrebbe essere dovuto alla scelta di casistiche non adeguate o eterogenee (pazienti con sarcoidosi non particolarmente attiva o scarsamente progressiva), ai dosaggi impiegati, agli intervalli e ai tempi di somministrazione non sufficienti, alla mancata associazione con altri farmaci (steroidi o metotrexate). Gli studi osservazionali portano a sperare nell efficacia in casistiche selezionate o in forme resistenti alla terapia standard. Inoltre è emerso che vi è una variabilità di risposta legata al tipo di molecola. Con

58 248 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 queste considerazioni che ne limitano fortemente l uso (non solo quindi per gli alti costi), si evince che si tratta di una terapia di seconda o meglio di terza scelta da impiegare solo in casi particolari in Centri specializzati e con l approvazione dei comitati etici nonché con il consenso informato del paziente. Bloccare il TNFα non sembra rappresentare la risposta definitiva alla richiesta di una terapia per la sarcoidosi cronica o refrattaria ad altri trattamenti, ma costituisce uno strumento in più da approfondire ulteriormente per raggiungere l obiettivo di bloccare definitivamente la progressione della malattia e non soltanto ridurre i sintomi. È necessario continuare con la ricerca e con studi clinici prospettici ben disegnati che dimostrino un aumento di efficacia, una ridotta tossicità e una migliorata qualità di vita legati all utilizzo di questi nuovi farmaci, nonché sarebbe opportuna una riduzione dei costi. Inoltre portare avanti gli studi sulla patogenesi della malattia permetterà di rendere la terapia sempre più mirata verso un preciso bersaglio. Bibliografia 1. Rottoli P. La terapia della Sarcoidosi: Attualità in medicina interna. A cura di F. Balsano, G. Bruno. Fond. A. Cisalpino, Roma 1987; Iannuzzi MC, Rybicki BA, Teirstein AS. Sarcoidosis. N Engl J Med 2007; 357: Hunninghake GW, Costabel U, Ando M, et al. ATS/ERS/WASOG statement on sarcoidosis. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Disease 1999; 16: Baughman RP, Lower EE. Novel therapy for sarcoidosis. Sermin Respir Crit Care Med 2007; 28: Baughman RP, Costabel U, Du Bois RM. Treatment of sarcoidosis. Clin Chest Med 2008; 29: Baughman RP, Lower EE. Therapy for sarcoidosis. Eur Respir Mon, 2005; 32: Bargagli E, Mazzi A, Rottoli P. Markers of inflammation in sarcoidosis: blood, urine, BAL, sputum and exhaled gas. Clin Chest Med 2008; 29: Prasse A, Katic C, Germann M, et al. Phenotyping sarcoidosis from a pulmonary perspective. Am J Respir Crit Care Med 2008; 177: Iannuzzi MC. Advances in the genetics of sarcoidosis. Proc Am Thorac Soc 2007; 4: Baughman RP, Stohofer SA, Buchsbaum J, et al. Release of TNF by alveolar macrophages of patients with sarcoidosis. J Lab Clin Med 1990; 115: Ziegenhagen MW, Rothe E, Zissel G, et al. Exaggerated TNF alpha release of alveolar macrophages in corticosteroid resistant sarcoidosis. Sarc Vasc Diffuse Lung Disease 2002; 19: Ziegenhagen MW, Benner UK, Zissel G, et al. Sarcoidosis: TNFα release from alveolar macrophages and serum levels of s IL-2R are prognostic markers. Am J Respir Crit Care Med 1997; 156: Scallon BJ, More MA, Trinh H. Chimeric anti-tnf-alpha monoclonal antibody ca2 binds recombinant transmembrane TNF-alpha and activates immune effector functions. Cytochine 1995; 7: Baughman RP, Lower EE. Infliximab for refractory sarcoidosis. Sarc Vasc Diffuse Lung Disease 2001; 18: Doty JD, Mazur JE, Judson MA. Treatment of sarcoidosis with infliximab. Chest 2005; 127: Baughman RP, Drent M, Kavuru MS, et al. Infliximab therapy in patients with chronic sarcoidosis and pulmonary involvement. Am J Respir Crit Care Med 2006; 174: Saleh S, Ghodsian S, Yakimova V, et al. Effectiveness of infliximab in treating selected patients with sarcoidosis. Respir Med 2006; 100: Meyerle JH, Shoor A. The use of infliximab in cutaneous sarcoidosis. J Drugs Dermatol 2003; 2: Baughman RP, Bradley DA, Lower EE. Infliximab for ocular chronic inflammation. Int J Clin Pharmacol Therapy 2005; 43: Sollberger M, Fluri F, Baumann T. Successful treatment of steroid refractory neurosarcoidosis with infliximab. J Neurol 2004; 251: Kobylecki C, Shaunak S. Refractory neurosarcoidosis responsive to infliximab. Pratical Neurol 2007; 7: Moravan M, Segal BM. Treatment of CNS sarcoidosis with infliximab and mycophenolate mofetil. Neurol 2009; 72: Rossman M, Newman LS, Baughman RP, et al. A double-blind, randomized, placebo-controlled trial of infliximab in subjects with active pulmonary sarcoidosis. Sarc Vasc Diffuse Lung Dis 2006; 23: Judson MA, Baughman RP, Costabel U, et al. Efficacy of infliximab in extrapulomary sarcoidosis: results from a randomized trial. Eur Respir J 2008; 31: Wells AU. Infliximab in extrapulmonary sarcoidosis: tantalising but inconclusive. Eur Respir J 2008; 31: Moreland LW, Schiff MH, Baumgartner SW. Etanercept therapy in rheumatoid arthritis: a randomized, controlled trials. An Intern Med 1999; 130:

59 C. Raimondi et al.: Sarcoidosi Khanna D, Liebling M, Louise JS. Etanercept ameliorates sarcoidosis arthritis and skin disease. J Rheumatol 2003; 30: Utz JP, Limper AH, Kalra S, et al. Etanercept for the treatment of stage II and III progressive pulmonary sarcoidosis. Chest 2003; 124: Baughman RP, Lower EE, Bradley DA, et al. Etanercept for refractory ocular sarcoidosis: results of a double-blind randomized trial. Chest 2005; 128: Hobbs K. Chronic sarcoid arthritis treated with intraarticular etanercept. Arthritis Rheum 2005; 52: Sweiss NJ, Welsch MJ, Curran JJ, Ellman MH. Tumor necrosis factor inhibition as a novel treatment for refractory sarcoidosis. Arthritis Rheum 2005; 53: Baker DE. Adalimumab: human recombinant immunoglobulin G1 anti- tumor necrosis factor monoclonal antibody. Rev Gastroenterol Disord 2004; 4: Philips MA, Lynch J, Azmi FH. Ulcerative cutaneous sarcoidosis responding to adalimumab. Acad Dermatol 2005; 53: Hefferman MP, Smith DI. Adalimumab for treatment of cutaneous sacoidosis. Arch Dermatol 2006; 142; Callejas-Rubio JL, Ortego-Centeno N, Lopez- Perez L, et al. Treatment of therapy- resistant sarcoidosis with adalimumab. Clin Reumatol 2005; Keane J, Gershon S, Wise RP. Tuberculosis associated with infliximab, a tumor necrosis factor α neutralizing agent. N England J Med 2001; 345: Efde M, Houtman PM, et al. Tonsillar tuberculosis in a rheumathoid arthritis patient receiving anti TNF α(adalimumab) treatment. Neth J Med 2005; 63: Slifman NR, Gershon SK, Lee JH, et al. Listeria monocytogenes infection as a complication of treatment with tumor necrosis factor α neutralizing agents. Arthritis Rheum 2003; 48: Ramos-Casals M, Brito-Zeron P, Munoz S. Autoimmune disease induced by TNF-targeted therapies: analysis of 233 cases. Medicine Baltimore 2007; 86: O Shea FD, Marras TK, Inman RD. Pulmonary sarcoidosis developing during infliximab therapy. Arth Rheum 2006; 15: Toussirot E, Pertuiset E, et al. Sarcoidosis occurring during anti-tnf-alpha treatment for inflammatory rheumatic diseases: report of two cases. Clin Exp Rheumatol 2008; 26: Massara A, Cavazzini L, La Corte R, et al. Sarcoidosis appearing during anti tumor necrosis factor α therapy: a new class effect paradoxical phenomenon. Two case reports and literature review. Semin Arth Rheum (articolo in stampa) 43. Ishiguro T, Takayanagy N et al. Development of sarcoidosis during etanercept therapy. Inter Med 2008; 47: Denys BG, Bogaerts Y, Coenegrachts KL, et al. Steroid-resistant sarcoidosis: is antagonism of TNF alpha the answer? Clin Sci 2007; 112: Chung ES, Paker M, Lo KH. Randomized, double blind, placebo-controlled, pilot vtrial of infliximab, a chimeric monoclonal antibody to TNF alpha, in patients with moderate to severe heart failure: results of anti TNF therapy against congestive heart failure trial. Circulation 2003; 107: Paramonthayan S, Lasserson T. Treatments for pulmonary sarcoidosis. Resp Med 2008; 102: Tavares JL, Wangoo A, Dilworth P, et al. Thalidomide reduces tumour necrosis factor-alpha production by human alveolar macrophages. Respir Med 1997; 91: Ye Q, Chen B, Tong Z, et al. Thalidomide reduces IL-18, IL-8 and TNF-alpha release from alveolar macrophages in interstitial lung disease. Eur Respir J 2006; 26: Carlesimo M, Giustini S, Rossi A,et al. Treatment of cutaneous and pulmonary sarcoidosis with thalidomide. J Am Acad Dermatol 1995; 32: Baughman RP, Judson MA, Teirstein AS, et al. Thalidomide for chronic sarcoidosis. Chest 2002; 122: Judson MA, Silvestri J, Hartung C, et al. The effect of thalidomide on corticosteroid dependent pulmonary sarcoidosis. Sarc Vasc Diffuse Lung Dis 2006; 23: Marriott JB, Dredge K, Dalgreish AG. Thalidomide derived immunomodulatory drugs (ImiDs) as potential therapeutic agents. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 2003; 3: Marques LJ, Zheng L, Poulakis N, Guzman J, Costabel U. Pentoxifylline inhibits TNFα production from alveolar macrophages. Am J Respir Crit Care Med 1999; 159: Tong Z, Dai H, Chen B, et al. Inhibition of cytokine release from alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis by pentoxifylline: comparison with dexamethasone. Chest 2004; 124: Zabel P, Entzian P, Dalhoff K, et al. Pentoxifylline in treatment of sarcoidosis. Am J Crit Care Med 1997; 155: Doherty CB, Rosen T. Evidence-based therapy for cutaneous sarcoidosis. Drugs 2008; 68: Manganiello VC, Park MK, Stylianou M, et al. A randomized trial of pentoxifylline in pulmonary sarcoidosis. American Thoracic Society 2005 international conference, San Diego, California, 2005; A14

60 Gestione e organizzazione sanitaria ANNALI DEGLI OSPEDALI San Camillo e Forlanini Volume 11, Numero 4, Ottobre - Dicembre 2009 SALUTE GLOBALE: I DETERMINANTI DELLA SALUTE E LE CONCLUSIONI DEL RAPPORTO DELL OMS A CURA DELLA COMMISSIONE SUI DETERMINANTI SOCIALI DELLA SALUTE GLOBAL HEALTH: HEALTH DETERMINANTS AND THE FINAL REPORT BY WHO S COMMISSION ON SOCIAL DETERMINANTS OF HEALTH CARLO RESTI U.O Sanità Internazionale e Cooperazione Direzione Generale, Azienda Ospedaliera S. Camillo-Forlanini, Roma Parole chiave: Salute Globale. Determinanti della salute. Diseguaglianze in salute. Politiche socio-sanitarie Key words: Global health. Determinants of health. Inequalities in health. Social and health system policies «Le disuguaglianze di salute sono una questione di vita e di morte, ma i sistemi sanitari non tendono per loro natura all uguaglianza. L assistenza primaria è la cornice migliore in cui agire per fare in modo che tutti gli attori, anche al di fuori del settore sanitario, esaminino il loro impatto sulla salute». Così ha commentato Margareth Chan, direttore dell Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS/WHO) alla presentazione del rapporto finale della commissione dell OMS sui determinanti sociali della salute, composta da decision makers, accademici, ex-capi di Stato ed ex-ministri della salute. La commissione ha lavorato per tre anni sul tema dei determinanti sociali della salute, e ad agosto 2008 ha pubblicato i suoi risultati in un rapporto di 246 pagine (Fig.1) intitolato Closing the Gap in a Generation: Health Equity through Action on the Social Determinants of Health. 1 La Commissione ha descritto e documentato senza reticenze come l ingiustizia sociale uccide su larga scala, con toni più in uso da parte di sociologi e politici che da parte di professionisti della salute, invitando la comunità internazionale ad annullare questo divario sociale nel corso di una generazione. Fig.1

61 C. Resti: Salute globale 251 Ma ci pare evidente come questo messaggio, che mette in luce le ingiustizie e le diseguaglianze in salute e nell accesso ai servizi sanitari dei Paesi ricchi come dei Paesi poveri, non può non toccare le coscienze e l operato di chi si dedica all assistenza e alle cure dei malati nell ospedale e sul territorio. Lo stato di salute di un individuo e più estesamente di una comunità o di una popolazione è influenzato, determinato, da molteplici fattori. Lo studio dei determinanti della salute costituisce la base e la sostanza della sanità pubblica, perché consente di analizzare e possibilmente modificare attraverso opportune politiche di contrasto, i fattori che influenzano l insorgenza e l evoluzione delle malattie. Per descriverli in modo sintetico, ma comprensivo, si può fare riferimento a tre diversi modelli 2,3,4. Un primo modello, che rispecchia l enfasi che negli Stati Uniti viene posta nella responsabilità individuale nei confronti della salute e delle malattie, attribuisce per il 50% lo stato di salute delle persone ai loro comportamenti e stili di vita (vedi slide 1 ), dando molto meno importanza ad altri fattori. Un secondo modello, di scuola nord europea, è un modello molto più articolato e complesso del precedente. Parte dai determinanti più prossimi ed individuali che si esprimono nel genoma: età, sesso, fattori costituzionali e genetici che si trovano al centro di uno schema a cipolla. Poi vi sono i fattori relativi agli stili di vita dell individuo che possono influire sulla sua salute. Qui si possono considerare sia i consumi voluttuari (alcool, droghe, tabacco, etc.) sia i comportamenti individuali (sessuali, alimentari, di esercizio fisico, di mobilità nell ambiente, di personalità, etc.). Poi, mano a mano più distali, ma non per questo meno influenti, vi sono i networks sociali e di comunità che un individuo si sceglie oppure subisce. Ad esempio hanno una importanza crescente secondo gli studi i primi anni di vita, la cosiddetta early life. Poi si incontrano fattori più facilmente individuabili e studiabili anche singolarmente, che possono essere: il reddito; il livello di istruzione; l accesso ai servizi sanitari di base, l abitazione e i luoghi di vita; l ambiente di lavoro come salubrità fisica e come clima entro cui si svolgono tutte le attività lavorative; la disoccupazione; l acqua potabile; le disponibilità alimentari. Infine occorre tener conto di determinanti relativi al contesto generale socioeconomico e culturale nel quale si vive e all ambiente nel quale si nasce e si cresce anche all interno della stessa città (vedi slide 2 ). Il terzo modello è proposto in una originale cornice concettuale proprio dalla Commissione sui Determinanti Sociali della Salute e comprende non solo i fattori che influenzano lo stato di salute degli individui e delle comunità, ma anche i fattori coinvolti nella distribuzione diseguale della salute all interno di una popolazione (vedi slide 3 ). Slide 1. Determinanti della salute (USA) Slide 2. Determinanti della salute (Europa)

62 252 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 Slide 3. Commission on Social Determinants of Health conceptual framework Si evidenziano tutti i fattori che a diverso titolo hanno un impatto sulla distribuzione di benessere e salute: da sinistra a destra nello schema, il contesto politico e socioeconomico, la posizione sociale (determinanti strutturali) e le condizioni di vita e di lavoro, i comportamenti individuali, i fattori biologici e l influenza su questi del sistema sanitario (determinanti intermedi). In sanità pubblica vi sono dunque due orientamenti nell approccio ai problemi di salute della collettività: un approccio socio-strutturale, di tipo politico, che studia argomenti come le disuguaglianze, le povertà, con finalità di integrare il più possibile gli interventi con gli altri settori che hanno influenza sulla salute e un approccio agli stili di vita di tipo tecnico, che analizza i rischi individuali causati dai differenti stili di vita con finalità di prevenzione dei gruppi a rischio. In particolare la scuola inglese, ha sviluppato l approccio socio-strutturale studiando i vari aspetti della povertà. Secondo questa scuola 5 la carenza di reddito, considerata come povertà (economica e di mezzi) presenta due facce: carenti condizioni materiali e mancanza di partecipazione sociale. In sostanza, oltre una certa soglia di reddito procapite, non sono più le differenze nelle condizioni materiali (strutturali) come acqua pulita, adeguata nutrizione, accesso ai servizi di base, etc. che si correlano con differenze nello stato di salute, bensì entrano in gioco diversi fattori sociali che potrebbero causare disuguaglianze nella salute all interno della stessa nazione (esempio dei paesi ricchi) in relazione ad opportunità differenti che favoriscono la partecipazione sociale, la soddisfazione di una vita in pienezza, un controllo maggiore sulla propria esistenza. In conlusione si può affermare che secondo la teoria socio-strutturale, circostanze economiche e sociali possono avere influenza sullo stato di salute attraverso effetti fisiologici derivanti da moventi emozionali e sociali, sia da effetti diretti causati da circostanze strutturali (materiali). Le disuguaglianze all interno dei Paesi Le disuguaglianze sanitarie fra i Paesi sono studiate da tempo, ma la commissione evidenzia ora anche quelle presenti all interno dei singoli Paesi: c è un legame diretto fra reddito e salute, chiamato gradiente sociale, presente non solo nei Paesi in via di sviluppo, ma anche nei più ricchi. Il gradiente sociale può essere più o meno marcato, ma è un fenomeno universale. Per esempio: in Indonesia la mortalità materna nelle fasce povere è 3-4 volte maggiore rispetto alle fasce ricche; la mortalità infantile negli slum di Nairobi è 2,5 volte superiore rispetto ad altre zone della città; l aspettativa di vita di un aborigeno maschio australiano è minore di 17 anni rispetto a un maschio australiano non aborigeno; negli Stati Uniti, fra il 1991 e il 2000, morti si sarebbero potute evitare se gli afroamericani avessero avuto lo stesso tasso di mortalità dei bianchi (nello stesso periodo, le vite salvate negli Stati Uniti grazie ai progressi della medicina sono state in tutto ). Il benessere non è necessariamente un determinante La crescita economica, in atto in molti Paesi, da sola non sempre basta a migliorare la salute della popolazione: senza un equa distribuzione dei benefici, la crescita economica può anzi esacerbare le

63 C. Resti: Salute globale 253 disuguaglianze. D altra parte, alcuni Paesi a basso reddito hanno raggiunto buoni livelli sanitari: per esempio Cuba, Costa Rica, Cina, Sri Lanka e lo Stato indiano del Kerala. La commissione ha sottolineato che il benessere deve essere usato con giudizio e ha portato, come esempio di eccellenza da seguire in tutto il mondo, i Paesi dell Europa settentrionale, che hanno sviluppato politiche per l uguaglianza dei benefici e dei servizi, la piena occupazione e l integrazione di una società multietnica per eccellenza, la parità fra i sessi e un basso livello di emarginazione sociale. Secondo la commissione, buona parte del lavoro di riduzione delle disuguaglianze è al di là delle possibilità del settore sanitario: la causa di molte malattie non è la mancanza di antibiotici, ma di acqua pulita, e le malattie cardiache non dipendono tanto dalla scarsità di unità coronariche, quanto dagli stili e dagli ambienti di vita. Di conseguenza, il settore sanitario deve attirare l attenzione sulle cause alla radice delle disuguaglianze. «Ci affidiamo troppo agli interventi medici. Un modo migliore per aumentare l aspettativa di vita e migliorare la qualità della vita sarebbe l adozione, da parte di ogni governo, di politiche e programmi per la salute e l uguaglianza sanitaria», ha commentato Michael Marmot, presidente della Commissione. Le raccomandazioni della Commissione La Commissione ha formulato tre raccomandazioni generali per contrastare gli effetti delle disuguaglianze: migliorare le condizioni della vita quotidiana. In particolare, la Commissione richiama gli Stati ad agire e collaborare per l infanzia, i rifornimenti di acqua pulita e la copertura universale dei sistemi sanitari; contrastare, a livello globale, nazionale e locale, la distribuzione ingiusta del potere, del denaro e delle risorse, che sono i determinanti strutturali delle condizioni di vita. Ai Paesi più ricchi la commissione chiede di onorare l impegno di dedicare lo 0,7% del prodotto nazionale lordo agli aiuti. A livello globale, raccomanda l adozione dell equità sanitaria come obiettivo centrale dello sviluppo, e dei determinanti sociali della salute come indice del progresso; misurare e analizzare il problema e verificare l impatto dell azione. Per questo è necessario innanzitutto investire in sistemi di registrazione e nella formazione di decisori e professionisti sanitari. «Un crimine non agire» «Un mondo più giusto sarebbe un mondo più sano. I servizi sanitari e gli interventi medici sono solo uno dei fattori che influenzano la salute della popolazione. L aumento delle disuguaglianze sanitarie è un fenomeno presente nei Paesi a medio-basso reddito ma anche in Europa. Sarebbe un crimine non intraprendere tutte le azioni possibili per contrastarlo», ha affermato Giovanni Berlinguer, membro della commissione, deputato al Parlamento europeo ed ex-componente del Comitato internazionale di bioetica dell Unesco. Un altro membro della Commissione, Amartya Sen, professore di Economia e di Filosofia ad Harvard e premio Nobel per l Economia nel 1998, ha invece dichiarato: «L obiettivo primario dello sviluppo, per ogni singolo Paese e per il mondo in generale, è l eliminazione delle limitazioni che impoveriscono la vita delle persone e ne riducono la durata. La causa fondamentale della deprivazione umana è l impossibilità di vivere vite lunghe e in salute, e questo è molto più che un problema medico: è legato agli svantaggi che hanno profonde radici sociali». Conclusioni Anche se si avverte la necessità di ulteriori studi, le conoscenze attuali sono sufficienti per avviare l azione. In 30 anni l Egitto ha ridotto la mortalità infantile dal 235 per mille al 33 per mille, e la Grecia e il Portogallo dal 50 per mille sono arrivati quasi ai livelli di Svezia, Islanda e Giappo-

64 254 Annali degli Ospedali San Camillo e Forlanini 11, 4, 2009 ne. Nel 2000, Cuba ha raggiunto una copertura del 99% dei servizi per l infanzia. La Commissione ha già messo in moto azioni concrete in diverse parti del mondo: Brasile, Canada, Svezia, Regno Unito, Kenya, Iran, Mozambico, Cile e Sri Lanka sono diventati Paesi partner della Commissione impegnandosi a far progredire l equità sanitaria, e stanno già sviluppando politiche in proposito. Questi esempi dimostrano che se c è la volontà politica il cambiamento è possibile. La strada da fare è ancora lunga ma, secondo la Commissione, la direzione è stata fissata e il percorso è chiaro. L Oms metterà il rapporto a disposizione degli Stati membri, che decideranno come le rispettive Agenzie sanitarie dovranno rispondere. Bibliografia 1. CSDH (2008) Closing the gap in a generation: health equity through action on the social determinants of health. Final Report of the Commission on Social Determinants of Health. Geneva, World Health organization 2. Institute for the future (IFTF), Health and Health care The forecast, The challenge. Jossey-Bass, Princeton Dahlgren G, Whitehead M, Policies and strategy to promote social equity in health. Stockholm: Institute of Future Studies, CSDH. A conceptual framework for Action on the Social Determinants of Health. Discussion paper (Final Draft), April Marmot M, The influence of income on health: views of an epidemiologist, Health Affairs March/April 2002 Per corrispondenza e richiesta estratti: Dott. Carlo Resti, Via Cassia 603, ROMA E mail: [email protected]

65 Società Editrice Universo S.R.L. Via G.B. Morgagni Roma Tel / Fax [email protected] - Indirizzo Web: GRUPPO PERIODICI LA CLINICA TERAPEUTICA: Rivista bimestrale di clinica e terapia medica, diretta da Pietro Cugini e Massimo Lopez. MEDICINA PSICOSOMATICA: Rivista trimestrale di medicina psicosomatica, psicologia clinica e psicoterapia, diretta da Massimo Biondi, redatta da Roberto Delle Chiaie. ANNALI DI IGIENE, MEDICINA PREVENTIVA E DI COMUNITà: Rivista bimestrale, diretta da G.M. Fara, A. Gullotti, V. Leoni, A. Panà, A. Simonetti D Arca. ZACCHIA - Archivio di Medicina Legale, sociale e criminologica: Rivista trimestrale, diretta da Ferdinando Antoniotti, Paolo Arbarello, Luigi Macchiarelli, Silvio Merli. La clinica termale: Rassegna trimestrale di idrologia e climatologia medica, fondata da Mariano Messini. SCIENZA DELLA RIABILITAZIONE: Rivista trimestrale, diretta da V. M. Saraceni. INTERNATIONAL NURSING PERSPECTIVES: Rivista quadrimestrale di ricerca infermieristica, diretta da Paola Binetti. ANNALI DEGLI OSPEDALI SAN CAMILLO E FORLANINI: Rivista trimestrale, diretta da Franco Salvati. ABBONAMENTI ANNO 2010 Italia Estero + sp.postali Euro Euro Euro LA CLINICA TERAPEUTICA 56,00 112, ,00 LA CLINICA TERAPEUTICA... on-line 45,16 + Iva 20% 45,16 MEDICINA PSICOSOMATICA 45,00 90, ,00 MEDICINA PSICOSOMATICA... on-line 38,00 + Iva 20% 38,00 ANNALI DI IGIENE, MEDICINA PREVENTIVA E DI COMUNITÀ 69,00 138, ,00 ANNALI DI IGIENE... on-line 55,16 + Iva 20% 55,16 ZACCHIA 50,00 100, ,00 ZACCHIA... on line 39,00 + Iva 20% 39,00 LA CLINICA TERMALE 32,00 64, ,00 SCIENZA DELLA RIABILITAZIONE 39,00 78, ,00 INTERNATIONAL NURSING PERSPECTIVES 33,00 66, ,00 INTERNATIONAL NURSING PERSPECTIVES... on line 24,00 + Iva 20% 24,00 ANNALI DEGLI OSPEDALI S.CAMILLO E FORLANINI (Istituzionale) 100,00 200, ,00 ANNALI DEGLI OSPEDALI S.CAMILLO E FORLANINI (privato) 73,00 146, ,00 Il pagamento può essere effettuato mediante versamento sul conto corrente postale N , a mezzo vaglia postale o assegno bancario intestati alla Società Editrice Universo - via G. B. Morgagni, Roma, a mezzo bonifico bancario c/o UNICREDIT Banca di impresa - Via Bari 11 - Roma - IBAN IT51F MONTE DEI PASCHI DI SIENA - AG IBAN IT84R o a mezzo carta di credito: Visa - Cartasì - American Express. I supplementi di ogni rivista si spediscono in contrassegno su richiesta al prezzo di euro 25,00 + 5,00 euro di spese spedizione. I fascicoli non pervenuti all'abbonato devono essere richiesti entro 30 giorni dalla ricezione del fascicolo successivo, decorso tale termine si spediscono, se disponibili, soltanto dietro pagamento. Per altre informazioni rivolgersi a: Società Editrice Universo, Via Morgagni 1, Roma Tel Fax [email protected] PER GLI ABBONAMENTI SI RICHIEDE IL PAGAMENTO ANTICIPATO A RICHIESTA SI INVIANO FASCICOLI DI SAGGIO