LA DIAGNOSTICA ATTRAVERSO LE NANOTECNOLOGIE

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1 LA DIAGNOSTICA ATTRAVERSO LE NANOTECNOLOGIE Matteo Cocuzza Politecnico di Torino Introduzione L'invecchiamento della popolazione, le grandi aspettative per una migliore qualità della vita e lo stile di vita della moderna società richiedono un assistenza sanitaria migliore, più efficiente ed economicamente sostenibile. Il progresso nella comprensione del funzionamento del corpo umano su scala molecolare e nanometrica, così come la capacità di intervenire in una fase pre-sintomatica, acuta o cronica di una malattia costituiscono elementi della massima importanza per rispondere a queste aspettative. Malattie come il cancro, il diabete, l'alzheimer e il morbo di Parkinson, i problemi cardiovascolari, le malattie infiammatorie e infettive e la depressione costituiscono sfide estremamente impegnative da affrontare. Le nanotecnologie applicate alla ricerca in tema di salute sono in grado di offrire soluzioni in un certo senso rivoluzionarie. La diagnosi precoce, i trattamenti intelligenti (si utilizza spesso l aggettivo smart nel mondo anglosassone e nella comunità internazionale) e l'attivazione di meccanismi di auto-risanamento sono tra i principali obiettivi sulla strada dell evoluzione della salute. La nano medicina, in evoluzione, spazia da nanoparticelle per la diagnostica molecolare all imaging, fino a terapie a micro e nanosistemi medicali integrati: questi potrebbero, in futuro, eseguire complesse azioni di riparazione a livello cellulare all'interno del corpo. Nella nanodiagnostica l'obiettivo finale è quello di identificare la malattia il più precocemente possibile, idealmente a livello della sua manifestazione in una singola cella. Per raggiungere quest obiettivo, devono essere intraprese attività di ricerca e sviluppo nel campo delle nanotecnologie per migliorare l'efficacia della diagnostica in-vivo e in-vitro. Le nanotecnologie possono offrire strumenti di diagnostica con caratteristiche di migliore sensibilità, specificità ed affidabilità, oltre alla possibilità di registrare diverse misure in parallelo o di integrare diverse fasi analitiche, dalla preparazione del campione fino alla rilevazione in un unico dispositivo miniaturizzato. Tale dispositivo può, in prospettiva e grazie alle micro e nanotecnologie, contenere a bordo abbastanza intelligenza e automazione da poter essere utilizzato dal paziente stesso e fornire una moltitudine di informazioni al medico. I miglioramenti delle tecniche microscopiche e spettroscopiche verso la direzione dell altissima risoluzione spaziale, della risoluzione molecolare e dell elevatissima sensibilità consentiranno di comprendere meglio la complessa "macchina" cellulare. Il progresso risultante dovrebbe aprire la strada a strumenti di diagnostica in-vivo più innovativi e potenti. In termini generali le nanotecnologie avranno un grande impatto sulle metodologie disponibili sia per la diagnostica delle malattie che per la scoperta di nuovi farmaci. Il progresso nella diagnostica in-vivo si basa attualmente sia sull imaging molecolare che sulla dispositivistica impiantabile cosiddetta minimamente invasiva. Nell'imaging molecolare, l'obiettivo è quello di sintetizzare agenti di rilevazione altamente affidabili e sensibili, ed eventualmente anche in grado di somministrare farmaci e monitorare la terapia. Questo è il cosiddetto principio delle tre F ( find, fight and follow, cioè individuare, combattere e monitorare ) che si declina nei concetti di diagnosi precoce, terapia e controllo della terapia, noto anche come teranostica. Il tessuto di interesse è in primo luogo visualizzato con nanostrutture di contrasto target-specifiche, dopodiché, le nanostrutture stesse, combinate con un agente farmacologicamente attivo, possono essere utilizzate per la terapia. Infine, il monitoraggio nel tempo dei risultati della terapia è possibile con sistemi di visualizzazione sequenziali e in real-time. Sarà quindi possibile ottenere diagnosi più precoci e affidabili utilizzando migliori traccianti e agenti di contrasto in combinazione con sistemi di rilevamento evoluti, progresso atteso dalla combinazione di diverse tecniche d imaging esistenti. 1

2 Impatto sociale Le classi patologiche che probabilmente beneficeranno maggiormente delle nanotecnologie nei prossimi 10 anni sono il cancro, le malattie del sistema cardiovascolare, dei polmoni e del sangue, le malattie neurologiche (in particolare quelle neurodegenerative), il diabete, e le malattie infiammatorie e infettive.il cancro è una malattia complessa che coinvolge una moltitudine di processi molecolari e cellulari, ed è il risultato di un graduale accumulo di mutazioni genetiche in cellule specifiche. I marcatori altamente efficienti e precisi basati sulle nanotecnologie e i dispositivi di rilevazione quantitativa per la diagnosi precoce e per il monitoraggio della terapia avranno un grande impatto nella gestione del paziente, nel miglioramento della qualità della vita e nella riduzione dei tassi di mortalità. La principale applicazione delle nanotecnologie alle malattie del sistema cardiovascolare riguarda la diagnosi non invasiva e la terapia mirata della placca aterosclerotica. Dispositivi per il monitoraggio di eventi trombotici ed emorragici possono avere un grande impatto, ad esempio, nella diagnosi e nel trattamento di ictus ed embolie. Dispositivi multifunzionali potrebbero essere in grado di rilevare eventi, trasmettere i dati biologici in tempo reale all esterno e fornire anticoagulanti o fattori di coagulazione all occorrenza. Il cervello rappresenta uno dei sistemi più complessi nel campo della biomedicina. Con una migliore comprensione delle funzioni cerebrali, la nanotecnologia offre possibilità di migliore diagnosi e cura per le malattie neurodegenerative come la sclerosi multipla, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. I rischi e le sfide della nanomedicina annoverano tuttavia questioni e dubbi tuttora non completamente risolti relativamente alla tossicità e cancerogenicità, alla stabilità a lungo termine, ai percorsi naturali per l escrezione delle nanostrutture artificiali, alle sfide tecnologiche nella produzione e sintesi molecolare su larga scala e alle metodologie per certificare la garanzia di qualità e affidabilità. Le Tecniche Diagnostiche basate sulle Nanotecnologie Le applicazioni delle micro e nanobiotecnologie nella diagnostica medica possono essere raggruppate in due aree: applicazioni in-vitro (biosensori e dispositivi integrati) ed in-vivo (dispositivi impiantabili, imaging medicale). Le basi della moderna medicina sono state gettate a metà del XIX secolo a seguito del riconoscimento che è la cellula la fonte della vita e, di conseguenza, di salute e malattia. Naturale conseguenza fu che la ricerca di base per costruire una migliore comprensione della complessa attività cellulare divenne essenziale per la medicina. Il progresso tecnologico e la combinazione di diversi metodi per la caratterizzazione delle cellule invitro (come le moderne tecniche di microscopia ottica, la microscopia a scansione di sonda, la microscopia elettronica e l imaging basato sulla spettrometria di massa) saranno quindi di importanza fondamentale per la nanomedicina. La diagnosi per applicazioni mediche in-vitro è tradizionalmente un compito laborioso. Campioni di sangue o tessuti o altri fluidi corporei vengono inviati a un laboratorio per l'analisi, analisi che spesso richiede ore, giorni o settimane, a seconda della tecnica utilizzata, oltre ad un intensa e attenta attività lavorativa da parte di personale altamente qualificato. I diversi nodi critici possono comprendere il deterioramento del campione, il costo, i lunghi tempi di attesa (a volte anche per i casi urgenti), i risultati imprecisi per insufficienti quantità di campione, la difficoltà di integrazione di parametri ottenuti da una grande varietà di metodologie e la scarsa standardizzazione nella raccolta e nell instradamento dei campioni. La miniaturizzazione, la parallelizzazione e l'integrazione di diverse funzioni in un unico dispositivo, solitamente basato su tecniche derivate dall'industria microelettronica, hanno portato allo sviluppo di una nuova generazione di dispositivi che sono più piccoli, più veloci e meno costosi, non richiedono particolari competenze, sono in grado di fornire letture più accurate e possono operare su quantitativi ridotti di campione fisiologico. La capacità di lavorare su campioni più piccoli implica anche metodi meno invasivi e meno traumatici per il loro prelievo. La nanotecnologia permette inoltre un ulteriore affinamento delle tecniche diagnostiche, consentendo screening ad alto rendimento (ad es. per testare un campione per numerose malattie, o un grande numero di campioni per una stessa malattia) e l implementazione della diagnostica Point- Of-Care (POC) [1]. Con questo termine si intendono tutte le analisi cliniche eseguite al di fuori del laboratorio di analisi chimico, ovvero decentrate. Tale decentramento può essere mantenuto all interno dell ambito ospedaliero, oppure esteso al di fuori di questo ambito (si pensi ad es. all ambiente domestico e alle possibilità di autodiagnosi o automonitoraggio). In ogni caso, il POC non può prescindere da altre due caratteristiche, peculiari quanto la sua localizzazione: la riduzione del tempo totale di analisi (il cosiddetto Turn Around Time) e il miglioramento dimostrabile della salute del paziente, permettendo al clinico di prendere, in tempi brevi, decisioni critiche sulla diagnosi della malattia e la conseguente terapia da adottare, migliorando la prognosi del paziente. Questi progressi tecnologici aprono la strada verso importanti cambiamenti nel modo in cui i farmaci potranno essere prescritti in futuro, gettando le basi per l'obiettivo della medicina personalizzata, cioè su misura rispetto alle caratteristiche ed esigenze individuali. Per inciso, è interessante sottolineare come molte tecniche innovative in-vitro messe a punto per i test medici hanno trovato importanti applicazioni in settori completamente diversi, come ad esempio nel monitoraggio 2

3 ambientale e nella sicurezza (rilevazione di droghe, esplosivi o agenti per la guerra chimico-batteriologica). Negli ultimi 25 anni l imaging medicale si è evoluto passando da un ruolo marginale nel settore sanitario fino a diventare uno strumento essenziale di diagnosi. L'imaging molecolare e la terapia assistita da immagini sono attualmente strumenti fondamentali per la sorveglianza della malattia e nello sviluppo di quasi tutte le applicazioni della nanomedicina in-vivo. In origine, le tecniche di imaging non potevano che rilevare cambiamenti nell aspetto dei tessuti quando i sintomi erano in fase relativamente avanzata. Successivamente sono stati introdotti mezzi di contrasto per identificare più facilmente e mappare il sito fisiologico della patologia. Oggi, attraverso l impiego delle micro e nanotecnologie, sia gli strumenti di imaging che i marcatori e gli agenti di contrasto sono stati drasticamente raffinati verso l obiettivo di rilevare la malattia il più precocemente possibile, eventualmente a livello di una singola cella, e monitorare l'efficacia della terapia. La convergenza tra le nanotecnologie e l'imaging medico apre le porte ad una rivoluzione nel campo dell'imaging molecolare (anche detto nano-imaging) nel prossimo futuro, consentendo in prospettiva l individuazione di una singola molecola o di una singola cella in un complesso ambiente biologico. Una delle sfide è, e sarà, quella di definire partenariati di ricerca e sviluppo tra l'industria dell'imaging e quella che sviluppa mezzi di contrasto, che portano, integrando, diverse competenze al medesimo tavolo. La Diagnostica in-vitro Uno strumento diagnostico in-vitro può essere un singolo biosensore, o un dispositivo integrato che contiene diversi biosensori. Un biosensore è un sensore che contiene, solitamente alla superficie, un elemento biologico (detto biorecettore), come ad es. un enzima, un anticorpo o una molecola di DNA, in grado di riconoscere e di segnalare (attraverso alcuni cambiamenti biochimici) la presenza, l'attività o la concentrazione di una specifica molecola (analita) biologica in soluzione. Un trasduttore (un transistor, un sensore ottico, termico o gravimetrico) è solitamente accoppiato al biorecettore e viene utilizzato per convertire il segnale biochimico in un segnale quantificabile (tipicamente elettrico o ottico). Attributi chiave dei biosensori sono le loro specificità (o selettività, cioè la capacità di identificare unicamente la molecola target e non possibili interferenti) e sensibilità (ovvero la minima quantità o concentrazione di analita target). Figura 1 Schema implementativo di un biosensore con la catena biorecettore, trasduttore ed elettronica di condizionamento del segnale L impiego delle tecnologie di derivazione microelettronica (per intenderci quelle impiegate per la fabbricazione dei circuiti integrati) ha consentito la miniaturizzazione dei biosensori, il che ha portato alla messa a punto di array (matrici) di sensori altamente integrati, in grado di estrarre informazioni da piccoli campioni e di effettuare diverse misurazioni in parallelo su un singolo campione. Le principali modalità di trasduzione utilizzate nei sensori chimici possono essere classificate come: (a) termica, (b) di massa, (c) elettrochimica, e (d) ottica. Poiché ognuna di queste modalità di rilevazione è associata a caratteristiche che sono complementari tra loro, la ricerca di un "trasduttore ideale" è tuttora estremamente viva e intensa. Nel corso degli ultimi due decenni, i progressi della tecnologia micro-elettro-meccanica (MEMS [2, 3, 4]) hanno consentito lo sviluppo di sensori checoinvolgono la trasduzione di energia meccanica e si basano principalmente sui fenomeni meccanici. Lo sviluppo di microcantilever per la microscopia a forza atomica (Atomic Force Microscopy, AFM [5]) ha segnato una tappa importante nella maturazione di adeguati approcci tecnologici per la fabbricazione di sensori MEMS. 3

4 La funzionalità dei sensori MEMS si basa su movimenti meccanici su scala micrometrica e sulle deformazioni dei loro componenti micro-lavorati, come ad es. le microtravi sospese vincolate ad un singolo estremo (i microcantilever [6], la versione miniaturizzata di un trampolino), ad entrambi gli estremi (i cosiddetti "ponti" o microbridge) o i diaframmi e le membrane sospese. L'idea generale alla base della sensoristica MEMS è che gli stimoli fisici, chimici o biologici possono alterare le caratteristiche meccaniche del trasduttore miniaturizzato in modo tale che il conseguente cambiamento può essere misurato con strumenti elettronici, mezzi ottici o di altra natura. In particolare, i microcantilever, insieme ad opportuni mezzi di read-out (ad es. la cosiddetta leva ottica ) sono in grado di misurare spostamenti dell ordine di mm Nell utilizzo di micro e nanocantilever come sensori gravimetrici in modalità di risonanza, è stata raggiunta l incredibile sensibilità di massa di pochi femtogrammi (10-15 grammi), grazie alla quale sono state pesate poche particelle di virus. I microcantilever per la diagnostica in-vitro possono essere utilizzati secondo due diverse modalità. In quella statica le deflessioni del cantilever possono essere indotte da forze esterne esercitate sul cantilever stesso (come ad es. nella microscopia a forza atomica) o da uno stress intrinseco generato sulla superficie del cantilever. I sensori a cantilever operanti in modalità dinamica sono essenzialmente oscillatori meccanici le cui caratteristiche di risonanza dipendono dalla loro massa intrinseca o adesa (cantilever usati come microbilance). Ad esempio, l'assorbimento di molecole di analita su un cantilever risonante induce una riduzione, misurabile con estrema precisione, della sua frequenza di risonanza a causa di un aumento della massa sospesa del risonatore. A seconda della natura degli stimoli in ingresso, i sensori a microcantilever possono essere utilizzati come sensori fisici (ad es. per realizzare dei microaccelerometri), chimici o biologici. I cantilever destinati all utilizzo come sensori (bio)chimici vengono in genere sottoposti ad un processo di modifica delle superfici (funzionalizzazione), in modo che uno o due lati presentino alta affinità per l'analita target. Recentemente, si è affermata una significativa attenzione verso la possibilità di implementare una conversione diretta di varie interazioni biologiche recettore-analita in risposte meccaniche utilizzando trasduttori a sbalzo (cantilever). Una significativa pietra miliare per lo sviluppo di biosensori a cantilever è stata la dimostrazione della loro applicabilità alle analisi del DNA per il monitoraggio sensibile e specifico di fenomeni di ibridazione (ovvero il fenomeno di appaiamento e di congiungimento di due singole eliche di DNA 4

5 in una doppia elica) mediante array di cantilever funzionalizzati e lettura ottica delle loro deflessioni. Ad esempio i ricercatori dell Oak Ridge National Laboratory (USA) sono riusciti a rilevare il fenomeno di ibridazione con un singolo mismatch (cioè un errore di accoppiamento di una singola base tra due eliche singole, errori dovuti ad esempio ad una mutazione genetica che può indurre una specifica patologia) utilizzando un microcantilever in modalità statica posto in una cella di flusso termicamente stabilizzata. Un altro approccio promettente per il rilevamento ultrasensibile di specie biologiche in aria è stato dimostrato utilizzando cantilever estremamente miniaturizzati che operano in modalità di risonanza (modalità dinamica). I cantilever in nitruro di silicio utilizzati in questi studi sono lunghi circa 5 micrometri, hanno frequenze di risonanza nel campo dei MHz e hanno consentito la rilevazione di piccole quantità di molecole biologiche e cellule. E stato quindi dimostrato che la sensibilità di massa di un microcantilever è sufficiente a rilevare i cambiamenti di massa dovuti all adesione di una singola cellula microbica. I cantilever sono quindi oggi riconosciuti come piattaforme estremamente promettenti per la prossima generazione di sensori chimici e biologici. Si prevede che l affinamento delle tecniche di microfabbricazione e funzionalizzazione dei cantilever sia in grado di offrire una piattaforma versatile per la misura in-vitro e in tempo reale delle proprietà fisiche, chimiche e biochimiche di fluidi fisiologici. In generale, questa tecnologia MEMS offre una potenzialità senza precedenti per lo sviluppo di una produzione di massa di sensori estremamente sensibili e per l'analisi rapida di sostanze chimiche e diverse specie biologiche a costo ridotto. Rispetto ai sensori più convenzionali, i sensori a cantilever offrono una migliore risposta dinamica, dimensioni notevolmente ridotte, alta precisione, e una maggiore affidabilità. I vantaggi della sensoristica a cantilever possono poi essere ulteriormente ampliati con l'organizzazione di trasduttori individuali in un array multi-sensore integrato on-chip con la circuiteria elettronica di pilotaggio e di lettura. L'obiettivo più ambizioso rimane la rilevazione veloce, affidabile, specifica e ad un costo sostenibile (ad es. per il sistema sanitario nazionale) di alcune molecole (o idealmente anche di una singola molecola) in un campione biologico complesso, non amplificato e senza l impiego di molecole di appoggio che fungano da etichetta (label). Il miglioramento della diagnostica in-vitro nei confronti di questo insieme di finalità richiede: - strumenti micro o nano-analitici a più alta sensibilità e risoluzione spaziale e strumenti integrati in grado di combinare più informazioni; - una maggiore sensibilità dei metodi di screening, tale da permettere da un lato la riduzione del campione e dall altro una diagnosi precoce sulla base di basse concentrazioni di marcatori della malattia; 5

6 - specificità (selettività) maggiore, per consentire la rilevazione quantitativa di marcatori in campioni biologici complessi e non purificati; - maggiore affidabilità, semplicità d'uso e robustezza, per non dover richiedere necessariamente l utilizzo di personale estremamente qualificato che potrebbe, altrimenti, essere dedicato a compiti più importanti e qualificanti, come ad es. l interpretazione della moltitudine di dati e informazioni che è fondamento della disciplina della diagnosi; - analisi più veloci; - l integrazione di diverse tecnologie per fornire elementi per un analisi complementare multiparametrica, tipicamente più precisa ed attendibile di quelle che si affidano sull interpretazione di un unico fattore. Diverse fasi di complessa preparazione e di analisi possono attualmente essere incorporate in Lab-On-aChip (LOC) [7, 8, 9], dispositivi microfluidici, in grado di miscelare, e processare fluidi separati (ad es. campioni fisiologici e relativi reagenti per lo specifico esame), implementando e ottimizzando protocolli clinici di analisi e identificazione dei campioni. La microfluidica è la scienza che studia i comportamenti fluidici alla micro e nano-scala, nonché gli aspetti ingegneristici di progettazione, simulazione e fabbricazione dei dispositivi fluidici per il trasporto, la somministrazione e la movimentazione di fluidi dell ordine di microlitri o addirittura nanolitri. Le reazioni biologiche o chimiche a questa scala dimensionale sono di solito molto rapide poiché sono impiegate piccole quantità di campioni e reagenti, i fenomeni diffusivi nelle soluzioni sono più veloci e qualunque reazione indotta da cicli termici è accelerata grazie agli scambi termici più efficienti tra il contenitore e il mondo esterno (scalando le dimensioni di un qualunque dispositivo il rapporto superficie/volume aumenta, favorendo così i fenomeni che avvengono alla superficie o incrementando l importanza del controllo e della conoscenza delle proprietà delle superfici stesse). L'idea alla base dei Lab-On-a-Chip è sostanzialmente quella di ridurre i laboratori biologici o chimici ad un sistema alla microscala, in grado di essere tenuto o gestito con una mano o anche di dimensioni più piccole. I sistemi LOC possono essere realizzati in silicio, vetro o materiali polimerici e le dimensioni tipiche dei canali microfluidici vanno da poche unità a diverse centinaia di micrometri. I campioni liquidi o i reagenti possono essere trasportati attraverso i microcanali dai rispettivi serbatoi alle zone di reazione, sfruttando, ad esempio, meccanismi di movimentazione e pompaggio elettrocinetici, magnetici, o idrodinamici. Il controllo della posizione e dell avanzamento dei fluidi è assistito da micro valvole opportunamente progettate ed eventualmente integrate con modalità e caratteristiche diverse all interno del circuito microfluidico. I movimenti fluidici o le reazioni biochimiche possono essere monitorati con diversi sensori, che sono spesso utilizzati per la rilevazione biochimica dei prodotti di reazione di una determinata analisi. Diversi sono i vantaggi legati all utilizzo e allo sfruttamento della tecnologia Lab-On-a-Chip rispetto agli approcci chimici convenzionali o ai laboratori biologici tradizionali: - Utilizzo di minimi volumi di fluido, sia per il campione fisiologico che per i relativi reagenti, il che implica meno sprechi, riduzione dei costi dei reagenti e dei volumi del campione necessario per la diagnostica, tecniche meno invasive e meno dolorose per il suo prelievo. La prospettiva di riduzione dei costi è sicuramente il vantaggio più importante per la diffusione su larga scala di questa tecnologia. Molti reagenti utilizzati nelle reazioni chimiche e biologiche sono estremamente costosi, quindi la prospettiva di utilizzarne piccole quantità per un'applicazione è sicuramente molto attraente per ilmercato e per il gestore del laboratorio di analisi. - Tempi di analisi e di risposta più veloci, grazie alla diffusione su brevi distanze, al riscaldamento più 6

7 veloce, agli alti rapporti superficie/volume, alle capacità termiche ridotte. In termini pratici, le analisi possono essere condotte in pochi secondi/minuti, mentre su scala di laboratorio tradizionale possono richiedere ore o persino giorni. - Migliore controllo del processo grazie alla risposta più rapida del sistema (ad esempio il controllo termico per le reazioni chimiche esotermiche). - Compattezza dei sistemi grazie all'integrazione di diverse funzionalità, volumi molto piccoli e minori consumi di energia; il tutto si traduce a sua volta in una maggiore predisposizione alla realizzazione di sistemi portabili. - Elevata parallelizzazione grazie alla compattezza del sistema, il che consente analisi high-throughput (cioè ad alta resa, ovvero il processamento di un gran numero di campioni a parità di tempo). - Costi di fabbricazione ridotti, consentendo la produzione di chip usa e getta, fabbricati secondo un approccio di produzione di massa. - Eliminazione della necessità di personale altamente qualificato per effettuare le operazioni di analisi. - Aumento del numero di parametri monitorati (test multi-parametrici) - Nuove funzionalità e possibilità diagnostiche (grazie alla riduzione delle dimensioni e ai nuovi fenomeni disponibili a causa dello scalamento delle dimensioni). - Infine, i sistemi Lab-On-a-Chip consentono di minimizzare gli effetti (smaltimento) e i rischi (contaminazione) legati alla produzione di sottoprodotti di reazionepotenzialmente nocivi, dal momento che il loro volume sarà inevitabilmente moltoridotto. I Lab-On-a-Chip sono quindi sistemi microfluidici miniaturizzati in cui si possono implementare complesse reazioni con potenziali applicativi nei campi dell analisi del DNA, del rilevamento di agenti biochimici o per la guerra chimico-batteriologica, per la selezione e il filtraggio delle cellule, per l analisi del sangue, per lo sviluppo e lo screening di farmaci, per la chimica combinatoria e l analisi delle proteine. I dispositivi microfluidici integrati sono in grado di misurare decine di migliaia di segnali provenienti da un campione, fornendo così al medico o al chirurgo più dati complementari da un solo campione del suo paziente. Alcuni dispositivi per la diagnostica sono stati sviluppati per analizzare parti del genoma o del proteoma usando frammenti di DNA o di anticorpi come elementi sensibili e sono quindi chiamati gene-chip o protein-chip. I cosiddetti Cells-On-Chip [10] usano cellule come elementi di rilevamento (biorecettori), e vengono impiegati in molti casi per lo screening di agenti patogeni o tossicologici. 7

8 I biosensori che sfruttano cellule come recettori monitorano i cambiamenti fisiologici nelle cellule stesse esposte a campioni biologici o industriali contenenti agenti patogeni, inquinanti, biomolecole o farmaci. La lettura può essere ottica (ad esempio per fluorescenza, luminescenza o colorimetria) o elettrica (variazioni del potenziale elettrico o dell impedenza). L'attività elettrofisiologica di alcuni tipi di cellule, come i neuroni e le cellule cardiache, è fortemente chimico-dipendente e ha quindi stimolato il loro uso in biosensori integrati su chip. Le variazioni di attività elettrica possono essere monitorate da array di microelettrodi planari (i cosiddetti Micro Electrodes Array o MEA [11, 12]), che sono facilmente integrabili in dispositivi microfluidici e che implementano un gran numero di punti di misurazione per singolo dispositivo. Attraverso diverse tecniche i neuroni possono essere patternati (cioè disposti ordinatamente in punti precisi, in corrispondenza degli elettrodi dell array) sulla superficie ed il dispositivo può essere utilizzato anche per modulare l'attività delle reti neurali assemblate in-vitro. La microfluidica può non solo consentire la somministrazione di fattori farmacologici solubili, ma offre anche un utile viatico al controllo della connettività neuronale (l instaurarsi delle sinapsi, cioè dei collegamenti elettrici tra diverse cellule neuronali limitrofe). Un sistema portatile, altamente integrato, di biosensori basati su cellule è stato realizzato integrando un interfaccia digitale basata su un chip CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor, ovvero la tecnologia per la fabbricazione dei circuiti integrati) con elettrodi di registrazione, con un sistema di controllo della temperatura (elettrodi di riscaldamento per sostenere i requisiti ambientali necessari per le cellule) e con una microfluidica che definisce la camera di coltura. In questo specifico settore permane comunque tuttora la complessità della sfida dell uso di cellule viventi come sensori, poiché diverse variabili ambientali, la densità delle cellule e la loro interazione possono influenzare significativamente le proprietà del sensore. Lo sviluppo e la commercializzazione di dispositivi Lab-On-a-Chip a basso costo e facili da usare per il Point-OfCare domestico (prevenzione e controllo delle malattie presso la propria dimora) sta spingendo la ricerca nella direzione dell implementazione di: - tecniche di preparazione del campione semplici da usare, consentendo il rilevamento di piccole quantità di marcatori di malattia in una goccia di sangue abbastanza ridotta, ma anche piccole quantità diluite in un volume di campione relativamente grande, ad esempio, 5-10 cellule tumorali in 100 ml di urina; - tecniche di rilevazione ultra-sensibili e senza l impiego di molecole marcanti, puntando quindi ad un rilevamento più diretto e veloce, utilizzando, ad esempio, cantilever o polimeri conduttori; - dispositivi complessi integrati, basati su micro e nano-fluidica avanzate, utilizzando ad esempio le pareti dei canali funzionalizzate (cioè modificate chimicamente) come elementi attivi per il rilevamento; 8

9 - sensori biomimetici con l impiego di molecole come sensori. Il Nano-Imaging in-vivo Le primissime manifestazioni di una malattia nel corpo sono indicate da cambiamenti nelle cellule (difetti di adesione cellulare, errori di mitosi, errori di comunicazione intercellulare, anomali cambiamenti citoplasmatici). Grandi benefici sono quindi prevedibili dalla capacità di visualizzare e identificare questi cambiamenti di stato. La nano-diagnostica in-vivo si riferisce in generale alle tecniche di imaging (nano-imaging), ma comprende anche i dispositivi impiantabili. Le tecniche di imaging comprendono: l imaging ottico e spettroscopico avanzato, l imaging nucleare con traccianti radioattivi, la risonanza magnetica, l imaging a raggi X o a ultrasuoni, e tutte dipendono dall identificazione di traccianti o agenti di contrasto che sono stati introdotti nel corpo per segnare il sito della malattia [17, 18]. Tecniche di imaging diverse hanno bisogno di dispositivi di segnalazione diversi. Ad esempio, i quantum dots possono fornire informazioni emettendo segnali fluorescenti a contatto con cellule malate. Non è difficile, almeno a livello di immaginazione, compiere il salto da un dispositivo reporter (che si limita quindi a fornire solo un informazione) a un dispositivo che non solo indica il luogo della malattia, ma offre anche una cura e la possibilità di implementare un protocollo terapeutico. La tracciatura delle cellule tumorali con nanoparticelle funzionalizzate, e in grado di reagire a stimoli esterni, consente una sorta di 'chirurgia' in-situ e localizzata (rottura o riscaldamento delle particelle con il laser, campi magnetici, microonde, ecc) senza invasività nel resto del corpo. 9

10 Di estremo interesse, a tal proposito, sono le nanoparticelle con particolari proprietà magnetiche per l individuazione ed il trattamento del cancro. Iniettate nel corpo del paziente e guidate selettivamente verso le cellule tumorali, queste nanoparticelle consentono di applicare calore alle cellule quando esposte a campi elettromagnetici ad alta frequenza. A seconda delle indicazioni cliniche per le diverse entità del tumore, è possibile implementare una terapia basata sull ipertermia (fino a 46 C), eventualmente anche utilizzata per migliorare a livello locale la radioterapia o la chemioterapia convenzionali, o sulla termoablazione (temperature fino a 70 C) per la distruzione diretta delle cellule tumorali. Grazie alle proprietà specifiche delle nanoparticelle, l'assorbimento di potenza elettromagnetica, e quindi la produzione di calore, è altamente riproducibile. L'assorbimento differenziale delle nanoparticelle nelle cellule tumorali, ma non nelle cellule normali, consente un riscaldamento selettivo del tessuto tumorale a livello cellulare. Questa tecnologia rivoluzionaria mira a stabilire una forma completamente nuova di trattamento del cancro nel prossimo futuro, con particelle magnetiche per il trattamento di tumori con effetti collaterali decisamente minimi, migliorando così la qualità della vita dei pazienti. La tecnologia e le sue apparecchiature relative sono attualmente nelle fasi finali dei trial clinici se non già disponibili seppur con limitazioni geografiche. La Magforce AG [19] (Germania) è leader nel settore delle nanotecnologie per il trattamento del cancro, ed è stata la prima azienda al mondo a ricevere l'approvazione europea per un prodotto medico che utilizza nanoparticelle a tale scopo. La nuova terapia è a disposizione dei pazienti presso il centro NanoTherm in Germania alla Charité Università di Medicina di Berlino, Dipartimento di Radioterapia Oncologica e Radioterapia. L apertura di centri di terapia aggiuntivi è prevista nel resto della Germania entro il L imaging molecolare mirato è importante per una vasta gamma di scopi diagnostici, quali l'identificazione di un sito di infiammazione, la visualizzazione di strutture vascolari o di stati di alterazione specifica e l'esame anatomico. E altresì importante anche per la ricerca sul rilascio controllato di farmaci, per valutare la distribuzione di un farmaco, e per la diagnosi precoce di accumuli di farmaco inattesi e potenzialmente pericolosi. La capacità di tracciare la distribuzione di un farmaco porta alla possibilità di attivarlo solo dove serve, riducendo così il potenziale di tossicità e gli effetti collaterali. 10

11 Attualmente è utilizzata una vasta gamma di particelle o di molecole per l'imaging medicale. Alcuni recenti sviluppi si sono del resto concentrati sull'utilizzo di nanoparticelle come traccianti o mezzi di contrasto. Nanocristalli fluorescenti quali i cosiddetti quantum dots [20] (letteralmente punti quantici ) sono nanoparticelle che, a seconda del loro rivestimento e delle loro proprietà fisiche e chimiche, possono avere come bersaglio un tessuto specifico o una cellula ed essere concepiti e sintetizzati per emettere un segnale luminoso di fluorescenza a scopi di imaging. Offrono un emissione fluorescente più intensa, più duratura e una maggiore possibilità di multiplexing (segnalazione di eventi diversi con segnali luminosi diversi) rispetto ai materiali convenzionali. Ci si attende che i quantum dots possano essere particolarmente utili per l'imaging nei tessuti viventi, in cui i segnali possono essere oscurati da scattering (riflessioni e distorsioni ottiche lungo direzioni casuali). Approfonditi studi tossicologici sono in fase di esecuzione per studiare con precisione il loro impatto sull'uomo, sugli animali e sull'ambiente. I più recenti sviluppi si stanno concentrando sulla possibilità di adottare un rivestimento per le nanoparticelle, per migliorarne l'efficienza di targeting e di biocompatibilità. I principali vantaggi del nano-imaging per la diagnostica in-vivo sono la diagnosi precoce della malattia e il monitoraggio delle fasi evolutive della malattia stessa (ad esempio nelle metastasi del cancro). Ulteriori sforzi di ricerca sono tuttavia necessari per migliorare l'efficienza e l'affidabilità dei sistemi di rilevamento. Un obiettivo fondamentale per i prossimi anni è quello di sviluppare macchine di rilevamento clinico più efficienti ed economiche, in grado di acquisire immagini dell'intero corpo in un solo passaggio e magari intercettando segnali radioattivi multi-isotopo. Il vantaggio principale consisterebbe in un drastico aumento nella velocità di imaging del corpointero, particolarmente importante per lo screening dei tumori. Nel campo del Nano-Imaging ulteriori approfondimenti sono ancora necessari per: - migliorare i metodi di analisi delle immagini e la loro visualizzazione, come ad esempio la ricostruzione ottica 3-D, la tomografia intracellulare in tempo reale, l imaging stereoscopico, le modalità di visualizzazione in realtà virtuale e aumentata, l'olografia, l imaging ottico invivo con cateteri e strumenti endoscopici evoluti, rispetto ai quali si farà cenno in seguito; - progettare e sintetizzare nanoparticelle in grado di puntare più efficacemente alle cellule malate, comprese quelle situate dietro barriere fisiologiche, come ad es. i tessuti epiteliali; - creare nanoparticelle cosiddette all purpose, in grado cioè di essere visualizzate da più strumenti di imaging (ad esempio ottico, acustico, magnetico, ecc.); - migliorare la biocompatibilità dei mezzi di marcatura, per minimizzare qualsiasi potenziale tossicità, reazione allergica o infiammatoria, tenendo conto la assoluta necessità di un eliminazione naturale per prevenire possibili effetti di lunga durata; - migliorare le tecniche per l'incapsulamento dei mezzi di contrasto per semplificare la loro somministrazione al sito di destinazione evitando un degrado progressivo nelle fasi di transizione o di traslocazione. 11

12 Un ulteriore approccio potenzialmente promettente è rappresentato dalla combinazione di diverse modalità di imaging (imaging multi-modale), ad esempio la tomografia ad emissione di positroni (o PET, dall'inglese Positron Emission Tomography [21]) con la risonanza magnetica, la risonanza magnetica con ultrasuoni o con la mappatura del cervello basata su elettroencefalogramma, l'ecografia con tecnologie ottiche. La fusione di risonanza magnetica e imaging ottico rimane tuttora una sfida. In linea di principio, ciò richiederà l'uso di nanoparticelle fluorescenti come emettitori di segnale, ma dotate anche di proprietà paramagnetiche. 12

13 Dispositivi impiantabili per la diagnostica in vivo La nanotecnologia ha anche molteplici implicazioni per i dispositivi di diagnostica in-ivo come ad esempio la pillola intelligente (si usa il termine smart pill ) ingoiabile e i nuovi strumenti di imaging endoscopici. I recenti progressi nell elettronica, nella fabbricazione dei microsistemi e nelle comunicazioni wireless, insieme a un approfondimento delle conoscenze nel campo della fisiologia, hanno aperto nuove frontiere nel settore dell esplorazione del corpo umano a scopi diagnostici. Microsistemi elettronici in grado di essere ingeriti per l esplorazione del canale gastrointestinale e in grado di trasmettere i dati acquisiti ad una base ricevente esterna sono attualmente disponibili sul mercato, sia per impiego umano che veterinario. Tali strumenti rappresentano una vera rivoluzione dal momento che attraverso le tecniche invasive standard di analisi una gran parte del tratto intestinale rimane tuttora inaccessibile. Nel caso degli esseri umani, ad esempio, gli unici strumenti disponibili sono la gastroscopia e la colonoscopia, rispettivamente per il monitoraggio dello stomaco e delcolon, ma non esiste soluzione per l intestino tenue. Questi microsistemi sono delle vere e proprie capsule ingoiabili, in grado di assolvere funzioni di monitoraggio di parametri o attuazioni di vario genere e sono in genere costituiti da diversi elementi: (i) i sensori o gli attuatori, (ii) il modulo elettronico di condizionamento del segnale, (iii) il processore per la digitalizzazione dei segnali e per la gestione dell intero sistema, (iv) il modulo di comunicazione (attraverso segnali a radiofrequenza, campi magnetici o ultrasuoni), (v) l alimentazione (basata sia su batterie che su accoppiamenti induttivi) e, infine, (vi) un adeguato mezzo di incapsulamento biocompatibile. La miniaturizzazione, la robustezza rispetto al rumore ambientale, la riduzione dei consumi, il miglioramento delle comunicazioni e degli incapsulamenti resistenti e biocompatibili sono attualmente gli aspetti più critici da affrontare e migliorare. L idea delle capsule ingoiabili apparve per la prima volta nel 1957 in un articolo sulle trasmissioni a radiofrequenza della temperatura e della pressione dall interno del corpo umano, mentre nel 1972 la Matsushita sviluppò ulteriormente e brevettò l idea originale per la realizzazione di capsule per la misura del ph, della temperatura e della pressione. Cionondimeno, la rivoluzione dei 13

14 semiconduttori e dei MEMS ha enormemente accelerato lo sviluppo delle capsule e oggi, anche se molti dei dispositivi precedentemente brevettati non sono mai usciti dai laboratori, alcuni dispositivi molto interessanti, seppur limitati, sono disponibili sul mercato. Tali capsule commerciali forniscono la misura del ph, della temperatura, della pressione, la possibilità di catturare immagini, mentre solo una è in grado di somministrare farmaci. Per ciò che riguarda la temperatura, uno dei primi successi commerciali fu la Ingestible Thermometer Pill [22] sviluppata alla fine degli anni 80 dalla John Hopkins University in collaborazione con la NASA per il monitoraggio degli astronauti che operavano nell ambiente ostile spaziale. Da allora, altri sistemi simili per la misura della temperatura, come ad esempio il VitalSense [23], sono apparsi. L endoscopia a capsula emerse tra gli anni 80 e 90 con l obiettivo di fornire un alternativa e un miglioramento rispetto all endoscopia standard. Gli endoscopi a capsula accoppiano dispositivi ottici con sorgenti luminose per la cattura di immagini del tratto gastrointestinale. I principali fornitori sono la Olympus Optical (EndoCapsule [24, 25] che ha ottenuto la European Conformity nel 2005), la Given Imaging [26] (PillCam con piena approvazione della FDA (Food and Drug Administration) statunitense) e la RF System Lab (Norika3) [27]. La Pharmaceutical Profiles ha brevettato la capsula Enterion [28] che è in grado di immagazzinare e somministrare fino ad 1 ml di farmaco in forma liquida o in polvere, attraverso l attuazione elettromagnetica di un pistone all interno della capsula. La SmartPill Co. [29] è la sola compagnia che è riuscita ad integrare diversi sensori (ph, temperatura e pressione) in un unico dispositivo commerciale. Ha ricevuto l approvazione FDA nel 2006 ed è uno degli elementi di un sistema completo che include anche un ricevitore wireless delle dimensioni di un cellulare, una stazione ricevente e un software apposito. Al di là di questo successo commerciale, la ricerca sta diventando sempre più ambiziosa, cercando ad es. di migliorare il controllo della movimentazione, la localizzazione e il controllo dell orientazione, oltre a cercare di integrare utensili per fornire possibilità terapeutiche in situ e, su tutti, cercare di integrare più sensori diversi sulla medesima piattaforma. Ad es. il progetto IDEAS (Integrated Diagnostics for Environmental and Analytical Systems) sta attualmente impiegando la tecnologia system-on-chip per integrare tutte le funzionalità dell elettronica e dei sensori su un singolo chip [30]. Il prototipo sviluppato ha a bordo una serie di sensori standard (temperatura, conducibilità e ph), insieme ad un sensore chimico per la misura dell ossigeno disciolto nell intestino. Ciononostante, il compromesso richiesto tra la miniaturizzazione e l integrazione di più sensori in grado di misurare parametri sia chimici che fisici rappresenta tuttora una sfida aperta. VECTOR (Versatile Endoscopic Capsule for Gastrointestinal Tumor Recognition and Therapy) [31] è un progetto sostenuto e finanziato dall'unione Europea nell'ambito del 6 programma quadro. Il consorzio comprende 19 partner industriali e organizzazioni di ricerca. L'obiettivo del progetto 14

15 VECTOR è quello di sviluppare capsule endoscopiche intelligenti con contenuti di innovazione micro e nanotecnologici. Il progetto VECTOR si propone di indagare e sviluppare una pillola robotica miniaturizzata per la diagnostica avanzata e la terapia del cancro nel tratto digestivo umano. La missione del progetto è quello di dare un contributo significativo per la diagnosi e il trattamento dei tumori dell'apparato digerente e dei loro precursori e per rafforzare la competitività dell'industria europea biomedica mediante tecnologie innovative. La capsula, chiamata "scarabeo robotico" (robotic bee), conterrà un sistema di endoscopia che impiega trasduttori ad ultrasuoni e sensori meccanici e bioanalitici. Mediante bracci robotici sarà possibile ottenere campioni di tessuto e somministrare trattamenti terapeutici mediante il rilascio di farmaci mirati e la distruzione termica del tessuto malato. Il progetto sta anche studiando un sistema di locomozione che utilizza zampe retrattili per controllare i movimenti della capsula, mentre un medico manovrerà la capsula stessa mediante un sistema di navigazione video. Importanti evoluzioni si registrano anche nel settore di nicchia della diagnostica oftalmica. ST Microelectronics sta collaborando con Sensimed AG (Losanna, Svizzera) per lo sviluppo e la commercializzazione di una lente a contatto intelligente in silicone realizzata con tecnologia MEMS [32]. E dotata di un sensore di pressione integrato e un antenna che trasmette in modalità wireless la pressione intraoculare all'interno dell'occhio, che può essere un sintomo del glaucoma. Il Sensimed Triggerfish (questo è il nome commerciale del sistema sviluppato) è un prodotto all'avanguardia per il monitoraggio continuativo della pressione intraoculare. La soluzione è basata su una lente a contatto "intelligente" che utilizza un piccolo sensore di pressione piezoresistivo integrato (una sorta di estensimetro) per monitorare la curvatura dell'occhio per un periodo di, tipicamente, 24 ore, fornendo preziose informazioni per la diagnosi e la gestione della malattia altrimenti non ottenibili con attrezzature oftalmiche convenzionali. L ingegnosa soluzione è un sistema in due parti che comprende la lente a contatto intelligente e un piccolo ricevitore indossato intorno al collo del paziente. Oltre all estensimetro la lente contiene un'antenna, un piccolo circuito elettronico di elaborazione dedicato e un trasmettitore RF per comunicare le misure al ricevitore. L elettronica e l estensimetro sulla lente sono alimentati tramite le onde radio inviate dal ricevitore e non sussiste quindi la necessità di impiego di una batteria. I componenti integrati sono posizionati sulla lente in modo da non interferire con la visione del paziente. La lente viene applicata dall oftalmologo e quando il paziente ritorna il giorno successivo (dopo 24 ore di normale attività, compreso il riposo notturno) viene rimossa la lente e il ricevitore. La lente a contatto intelligente ha ottenuto il marchio CE nel terzo trimestre del 2010 ed è quindi iniziata la sua 15

16 commercializzazione sul territorio europeo, mentre per il mercato statunitense le pratiche normative verranno espletate entro il Conclusioni La sostenibilità dei sistemi sanitari raccomanda di privilegiare la prevenzione, piuttosto che il trattamento acuto delle patologie. L evoluzione verso la medicina preventiva richiede tecniche di diagnostica molto più efficienti di quelle tradizionalmente in uso e la nanotecnologia rappresenta un insieme di possibilità per contribuire a rivisitare in questa chiave la diagnostica medica. Entro il prossimo decennio saranno disponibili nuovi mezzi basati sulle nanotecnologie, in grado di compiere migliaia di rilievi molto rapidamente e a buon mercato. La tendenza futura nella diagnostica spingerà l ulteriore miniaturizzazione della tecnologia dei biochip. La più comune applicazione clinica diagnostica sarà l'analisi delle proteine del sangue. Il sangue nella circolazione sistemica riflette lo stato di salute o di malattia di più organi. Il monitoraggio di molecole circolanti nel sangue è di grande interesse per alcune malattie croniche come il diabete o l'aids. Pertanto, il rilevamento dell impronta digitale molecolare del sangue fornirà una valutazione importante dello stato di salute e malattia. Le informazioni estratte da un gran numero di dispositivi in grado di scorerre passivamente nel sangue permetteranno analisi chimiche più approfondite in un volume di tessuto macroscopico e non preparato in laboratorio. La tendenza sarà quella di costruire i dispositivi diagnostici con tecniche dal basso verso l'alto (processo bottom-up), vale a dire assemblandoli cominciando dai mattoni più piccoli (atomi, molecole o macromolecole). La miniaturizzazione (per assicurare minore invasività), combinata con la funzionalizzazione della superficie e la 'biologicalizzazione' degli strumenti diagnostici, contribuirà ad aumentare la loro capacità di accettazione all interno del corpo. Attraverso la miniaturizzazione, e l ampliamento dell utilizzo delle tecnologie di produzione di massa sarà possibile fabbricare biosensori portatili, poco costosi, e molto sensibili, in grado di poter essere impiegati anche in Paesi poveri di risorse per la diagnosi di malattie come l'hiv/aids. La capacità di autoalimentarsi, di compiere autodiagnosi e di trasmettere dati verso centri di raccolta anche remoti, sono altri aspetti fondamentali per lo sviluppo e la diffusione di questi dispositivi. Nel prossimo futuro, l'uso di strumenti nanodiagnostici potrebbe ridurre i tempi di attesa per i risultati dei test. I pazienti potrebbero godere di diagnosi e prescrizioni rapide, diminuendo così il loro stato di ansia e favorendo l accettazione di questa innovazione tecnologica presso il grande pubblico. Nel prossimo decennio le nano biotecnologie svolgeranno un ruolo importante non solo nella diagnosi ma anche nel collegare la diagnosi al trattamento e allo sviluppo della medicina personalizzata. Un'altra fondamentale area di applicazione sarà quella della diagnostica del cancro. La diagnosi molecolare del cancro, comprensiva della profilatura genetica, sarà probabilmente disponibile entro l'anno In un futuro più lontano la Nanorobotica potrà essere applicata per la diagnosi precoce e il trattamento del cancro. Nanodispositivi per questo scopo sono ormai in fase di studio di fattibilità. Un nanodispositivo per la diagnosi e la terapia combinata potrà essere impiantato come misura profilattica in soggetti che non mostrano alcuna manifestazione evidente di cancro, e la sorveglianza del cancro potrebbe essere condotta con un monitoraggio esterno remoto. Tali mezzi di [20] controllo potranno circolare liberamente ed essere in grado di rilevare il cancro nelle prime fasi, quindi fornire adeguati interventi terapeutici. Questi dispositivi di monitoraggio dovranno essere biodegradabili e questo approccio massimizzerà la filosofia della prevenzione e della gestione personalizzata dei tumori. Cionondimeno, anche se la nanodiagnostica in-vitro ha già registrato molti successi, quella della diagnostica in-vivo sarà ancora una lunga strada da percorrere a causa dei dubbi ancora persistenti sulla eventuale tossicità sistemica. Bibliografia e link utili Si suggerisce la lettura del testo divulgativo Nano Tecnologie - La rivoluzione in Medicina di Carmine D Antonio e Pietro Di Gennaro, Zima Technology, 2006, disponibile e scaricabile liberamente al seguente sito: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 16

17 [10] [11] [12] [13] [14]http://www.st.com/internet/com/SALES_AND_MARKETING_RESOURCES/MARKETING_COMMUNICATION/M ARKETING_BROCHURE/brcheckin0609.pdf [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25]http://www.olympusamerica.com/msg_section/download_brochures/EndoCapsule_Brochure.pdf [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] 17

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