INSEGNAMENTO DIAGNOSTICA MOLECOLARE E GENETICA MEDICA MODULO. Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica con. Laboratorio

Transcript

1 INSEGNAMENTO DIAGNOSTICA MOLECOLARE E GENETICA MEDICA MODULO Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica con Laboratorio Rosa Di Noto, Ricercatore della Facoltà di Scienze Biotecnologiche dell Università Federico II di Napoli Sezione Colture Cellulari, CEINGE-Biotecnologie Avanzate di Napoli 081/ ; dinoto@dbbm.unina.it

2 INSEGNAMENTO DIAGNOSTICA MOLECOLARE E GENETICA MEDICA MODULO Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica con Laboratorio Collega cui fare riferimento per le slides e/o eventuali comunicazioni urgenti da me effettuate: Cesaro Filomena Cellulare: 328/ Telefono: 081/ filomenacesaro@hotmail.it

3 MODULO Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica con Laboratorio 1. Il Laboratorio di Biochimica Clinica 2. Il laboratorio di Biologia Molecolare Clinica 3. Esempi di Integrazione tra la Diagnosi di Laboratorio di Biochimica Clinica e di Biologia Molecolare Clinica

4 Testo Consigliato: Biochimica e Biologia Molecolare Principi e Tecniche A cura di Keith Wilson e John Walker Nuova Edizione Italiana a cura di Mirella S. Pilone e Loredano Pollegioni Raffaello Cortina Editore

5 I termini Biochimica Clinica, Patologia Chimica e Chimica Clinica sono spesso utilizzati in qualità di Sinonimi La Biochimica Clinica rappresenta una branca della Medicina di Laboratorio in cui i metodi chimici e biochimici vengono utilizzati per lo studio della malattia

6 Storia del Paziente Esame Clinico Analisi per Immagini Servizi Diagnostici Servizi di Laboratorio Esami Fisiologici: ECG, EEG, Funzione Polmonare Ematologia, Istopatologia, Immunologia e Microbiologia Biochimica Clinica Esami Specialistici Servizi di Emergenza Biochimica di Base

7 La Medicina di Laboratorio è una scienza clinica applicata che studia con metodi chimici, fisici e biologici le alterazioni dell organismo nello stato di malattia La Medicina di Laboratorio si pone le stessa finalità di quella clinica: La Diagnosi della Malattia La Cura del Paziente Informazioni utili A scopo diagnostico A scopo terapeutico A scopo riabilitativo A scopo preventivo

8 Oggetto degli Esami di Laboratorio Liquidi o Tessuti Biologici che costituiscono i vari sistemi dai quali ricavare informazioni Sangue Urine Liquido Cefalorachidiano Liquido Seminale Liquido Amniotico Feci Escreato Succo Gastrico o Duodenale Sudore Frammenti di Tessuto Bioptico Sistemi

9 1. Sistemi I Liquidi o Tessuti prelevati dal paziente sono definiti campioni sui quali il laboratorista esegue il dosaggio dei vari costituenti o analiti secondo la richiesta che perviene dal clinico Utilità dell Esame di Laboratorio: Scopi Diagnostici (conoscenza dei valori di riferimento della popolazione di cui il paziente fa parte e limiti decisionali per la patologia oggetto dell indagine) Scopi Prognostici Esame di Urgenza Valutazione generale (per esempio: esami pre-operatori) Identificare Patologie allo stato sub-clinico (per es. curva da carico di glucosio per un diabete latente) Follow-up di un trattamento farmacologico

10 2. Sistemi I Liquidi o Tessuti prelevati dal paziente sono definiti campioni sui quali il laboratorista esegue il dosaggio dei vari costituenti o analiti secondo la richiesta che perviene dal clinico L Esame di Laboratorio deve essere utile per: Valutazione della posologia di farmaci a rischio Ripetizione dei valori che si sono manifestati borderline Scopi medico-legali sia per giustificare una rapida dimissione che per talune controversie Attività di ricerca strettamente dipendente però dal Consenso Informato del paziente stesso dal quale proviene il campione biologico

11 3. Sistemi I Liquidi o Tessuti prelevati dal paziente sono definiti campioni sui quali il laboratorista esegue il dosaggio dei vari costituenti o analiti secondo la richiesta che perviene dal clinico L Esame di Laboratorio deve essere utile per: Esigenze particolari della comunità in qualità di screening per possibili patologie neonatali come la fenilchetonuria, l ipotiroidismo e la mucoviscidosi. Molti handicap neuromotori di origine metabolica potrebbero scomparire o assumere aspetti meno limitanti se fossero diagnosticati rapidamente alla nascita; ciò consentirebbe un immediato intervento dietetico o farmacologico

12 La correttezza del risultato analitico dipende dal mantenimento delle caratteristiche chimiche, biologiche e morfologiche del campione in esame Trattamento pre-analitico del campione Tappe Fondamentali Trasporto e Spedizione Accettazione e Verifica dell Idoneità Centrifugazione e Sieratura Smistamento secondo le Analisi Richieste Eventuali Trattamenti Specifici Conservazione

13 Trasporto e Spedizione Tappe Fondamentali Trasporto Intramurale Il trasferimento del materiale dal sito di prelievo a quello di analisi viene effettuato da infermieri o da personale specializzato che utilizzano Provette o Appositi Contenitori Fogli ed Etichette di Identificazione Esso impone: Trasporto Extramurale Contenitori Infrangibili in Propilene o Polietilene con Tappi a Tenuta Contenitori con Ghiaccio Sintetico o Azoto Liquido Contenitori Schermati per il Trasporto di Sostanze Radioattive

14 Tappe Fondamentali Accettazione e Verifica dell Idoneità del Campione L addetto all accettazione deve verificare scrupolosamente il rispetto di tutte le misure previste nella manipolazione pre-analitica Ha la facoltà di respingere il campione

15 Centrifugazione e Sieratura Tappe Fondamentali La centrifugazioe va eseguita entro un ora dal prelievo a 3000 rpm per 10 min sia per quanto riguarda il siero che il plasma allo scopo di separarli dalla parte corpuscolata Il siero si separa dal sangue coagulato: Lasciare il campione a T.A. per 30 min oppure 15 min dopo l aggiunta di promotori dell attività piastrinica oppure 5 min dopo l aggiunta di trombina Lasciare il campione per più tempo se è stato posto a +4 C o in ghiaccio (vantaggi: diminuita microemolisi e aumento della resa in siero)

16 Siero e Plasma Il siero rappresenta il liquido estruso dal sangue coagulato con composizione corrispondente all incirca a quella del plasma, ma a differenza di questo risulta privato del fibrinogeno e degli altri fattori della coagulazione. Siero e Plasma Il siero si ottiene prelevando il sangue periferico in assenza di anticoagulante Il plasma, invece, si ottiene prelevando il sangue periferico in presenza di anticoagulanti quali ad esempio: Eparina EDTA Citrato di Sodio

17 Centrifugazione e Sieratura Tappe Fondamentali Accorgimenti Aver cura di conservare le provette ben chiuse allo scopo di evitare l evaporazione, la formazione di aerosol o la contaminazione Utilizzare pipette in plastica monouso E possibile utilizzare provette contenenti gel o palline di polistirolo o ancora sostanze con peso specifico intermedio fra quello dei globuli rossi e quello del siero allo scopo di evitare il rimescolamento delle due fasi In linea generale si usa indifferentemente il siero oppure il plasma Alcuni parametri però possono variare

18 Conservazione Tappe Fondamentali La conservazione del campione è indispensabile al fine di: Ripetere le analisi risultate imprecise o dubbie Ripetere un test a dubbio esito dal punto di vista fisiopatologico Ripetere le analisi a conferma di una successiva ipotesi diagnostica Ripetere le analisi contemporaneamente su campioni prelevati in momenti diversi

19 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Le cause di variazione possono schematicamente distinguersi in cause di tipo Fisico Chimico-fisico Biochimico oppure Biometabolico

20 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Alterazioni di Natura Fisica Riguardano principalmente cambiamenti di stato liquidosolido, liquido-vapore: Fenomeni di Evaporazione Fenomeni di Solubilità Fenomeni di Adsorbimento Fenomeni di Desorbimento Fenomeni di Diffusione

21 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Alterazioni di Natura Fisica I fenomeni di evaporazione fanno aumentare la concentrazione di tutti gli analiti presenti nel campione e dipendono da Temperatura Ambiente (TA) Flusso dell Aria La Geometria e la Percentuale di Riempimento del Contenitore La Modalità Operativa dello Strumento (tappi di gomma perforabili)

22 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Alterazioni di Natura Fisica I fenomeni di solubilità si osservano nel corso del tempo soprattutto a carico dei campioni di urine. L abbassamento della TA o quella del frigorifero oppure la variazione del ph provoca la precipitazione di alcuni costituenti: Calcio-fosfato Calcio Ossalato Acido Urico Ciò non avviene nel siero, nel plasma o nel sangue dove la componente proteica funziona da stabilizzante

23 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Alterazioni di Natura Fisica I fenomeni di adsorbimento interessano soprattutto gli elementi oligominerali ed i cationi che vengono adsorbiti sulle pareti dei contenitori. Il fenomeno dipende: Natura dello Ione ph Dal Tempo di Contatto Dalla Temperatura

24 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Alterazioni di Natura Fisica I fenomeni di desorbimento riguardano la cessione di materiale inquinante, per es. metallo in tracce rilasciato da strumenti usati per il prelievo oppure da tappi e superfici dei contenitori

25 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Alterazioni di Natura Fisica I fenomeni di diffusione riguardano soprattutto: Gli eritrociti nel momento in cui vengono conservati insieme al siero oppure al plasma; da essi fuoriescono i costituenti presenti ad alta concentrazione I campioni biologici durante il congelamento non adeguato

26 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Alterazioni di Natura Chimico-Fisica Riguardano i processi che modificano la composizione o la struttura di alcuni costituenti biochimici. L effetto fotochimico è dovuto alle radiazioni della luce solare che possono alterare la struttura di molecole quali le porfirine, la bilirubina e le vitamine. Il campione dovrà essere conservato al buio per evitare la degradazione fotolitica; La denaturazione dipende dal mezzo, dalla temperatura, dal tempo e dal ph; conduce alla modificazione sterica dei siti attivi di proteine. Il fenomeno può essere annullato attraverso l aggiunta di conservanti; La polimerizzazione o aggregazione si realizza a carico di molecole complesse quali le proteine in cui si può assistere alla formazione di legami a basso contenuto energetico (forze di Van der Waals, legami idrogeno).

27 Conservazione Tappe Fondamentali Cause di Alterazione dei Campioni Biologici Alterazioni di Natura Biochimica o Biometabolica Conducono alla modificazione della concentrazione di analiti per cui H+, acido lattico, acido piruvico, adenosina difosfato, adenosina monofosfato e NH4+ possono aumentare Glucosio e adenosina trifosfato possono diminuire E necessario adottare opportuni accorgimenti quali la refrigerazione, congelamento, deproteinizzazione e aggiunta di stabilizzanti

28 Tappe Fondamentali Conservazione: Ulteriori Accorgimenti La Temperatura di 0 C Riduce la velocità di tutte le reazioni chimiche ed enzimatiche Si può ottenere con una miscela di acqua e ghiaccio È essenziale per i campioni destinati al dosaggio di analiti quali la gastrina, l insulina, la renina, l ammoniaca e l acido lattico Nel caso di campioni numerosi si può fare ricorso a temperature di -20 c oppure -70 C La Temperatura Ambiente (per una durata di 4 h) oppure 4 C (per una durata di 24 h) È indicata per i costituenti sierici o plasmatici quali metaboliti, enzimi, elettroliti e minerali Casi Estremi: -150 C e -196 C

29 Tappe Fondamentali Conservazione: Ulteriori Accorgimenti La Liofilizzazione Richiede apparecchiature sofisticate raramente presenti nei laboratori E molto utilizzata presso le industrie farmaceutiche per la conservazione di prodotti diagnostici quali sieri e sostanze biologiche particolarmente instabili

30 Tappe Fondamentali Conservazione: Ulteriori Accorgimenti La modificazione del ph del materiale biologico si ottiene mediante l aggiunta di: Sostanze Acide o Basiche Soluzioni Tamponanti Miscele Tamponanti Soluzione: miscela omogenea di due o più componenti delle quali quella presente in maggiore quantità è detta solvente e le altre soluti Miscela: combinazione di due o più sostanze generalmente solubili fra di loro in assenza di reazioni chimiche. Nella miscela i diversi componenti conservano le loro proprietà chimiche

31 Tappe Fondamentali Conservazione: Ulteriori Accorgimenti La modificazione del ph serve a mantenere stabile nel tempo la solubilità, la stabilità chimica e l attività biologica dell analita Il mantenimento della solubilità è particolarmente indicato nella conservazione delle urine per Preservare le sostanze endogene quali acido urico e sali di calcio Preservare sostanze esogene quali i farmaci E essenziale Raccogliere le urine nelle 24 h in presenza di acido cloridrico diluito al 50-75% in acqua così da evitare la precipitazione del calcio, degli ossalati e dei fosfati Raccogliere le urine nelle 24 h in presenza di sodio bicarbonato così da mantenere in soluzione l acido urico sotto forma di urato monosodico

32 Tappe Fondamentali Conservazione: Ulteriori Accorgimenti La modificazione del ph serve a mantenere stabile nel tempo la solubilità, la stabilità chimica e l attività biologica dell analita Il mantenimento della stabilità chimica è particolarmente indicato nella conservazione delle urine per Preservare mediante acidificazione le catecolamine e l acido vanilmandelico Preservare mediante alcalinizzazione le porfirine Il mantenimento dell attività biologica è particolarmente indicato per la conservazione delle attività enzimatiche Alcalinizzazione delle urine Moderata acidificazione del siero con citrato monosodico per il dosaggio della fosfatasi acida prostatica

33 Tappe Fondamentali Conservazione: Ulteriori Accorgimenti Uso di Sostanze Chimiche I glicostatici vengono utilizzati per il dosaggio del glucosio Al fine di inibire gli enzimi cellulari della glicolisi anaerobica Nel momento in cui il plasma non viene separato dagli eritrociti Sono rappresentati dal fluoruro ed il monoiodoacetato accoppiati all EDTA come anticoagulante Sostanze ad azione batteriostatica Timolo, acido borico, sodio mertiolato ed acido benzoico per le urine Streptomicina per il sangue

34 Sistemi Misti di Conservazione In alcuni casi è necessario utilizzare contemporaneamente sistemi di conservazione differenti Deproteinizzazione e Raffreddamento per il dosaggio di acido lattico e piruvico Glicostatici e Raffreddamento per il dosaggio del glucosio Modificazione del ph e Raffreddamento per il dosaggio della fosfatasi acida Buio e Raffreddamento per conservare la bilirubina