Stretta correlazione tra Fisiologia vegetale e Biotecnologie vegetali

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1 Stretta correlazione tra Fisiologia vegetale e Biotecnologie vegetali Contributo della fisiologia vegetale La conoscenza dei processi fisiologici che regolano la crescita e lo sviluppo della pianta consente un intervento Biotec mirato per la selezione e manipolazione di uno specifico carattere di interesse

2 Contributo delle biotecnologie vegetali Es: per la verifica in planta del ruolo svolto da specifiche componenti (mediante la produzione di piante transgeniche)

3 Importanza della Fisiologia vegetale e Biotecnologie vegetali nel Miglioramento genetico delle piante coltivate per costituire varietà con migliorate caratteristiche e più ecocompatibili (es. più produttive, qualitativamente superiori, più resistenti (quindi utilizzo di meno sostanze chimiche per il controllo dei patogeni)

4 Biotecnologia L uso di organismi o parti di essi per la produzione di prodotti utili

5 La Biotecnologia ha origini molto antiche Processi fermentativi di cibi e bevande 6000 a.c. i Sumeri e Babilonesi producevano birra 4000 a.c. -gli Egiziani producevano pane lievitato -il vino era già conosciuto nei paesi del Vicino Oriente -diverse specie di muffe venivano usate per produrre formaggio

6 La capacità dei microrganismi di causare processi di fermentazione fu dimostrata da Pasteur fra il 1857 e il 1876 e quindi fu possibile effettuare un controllo più consapevole ed efficiente delle fermentazioni

7 Produzione biotecnologica di farmaci -negli anni 40, furono introdotte tecnologie per la coltura massiva di organismi microbici in condizioni sterili per la produzione di antibiotici (es. penicillina), vaccini, enzimi ecc. L agricoltura biologica usa prodotti Biotec? Produzione biotecnologica di pesticidi -es: produzione su larga scala del Bacillus thuringensis come insetticida contro la piralide del mais

8 Biotecnologie e Piante coltivate

9 Non c è niente di naturale in quello che coltiviamo o alleviamo indipendentemente dagli OGM

10 Azienda agraria

11 Foresta amazzonica

12 Azienda agraria Trattare con antiparassitari Irrigare Concimare

13 Pomodoro coltivato Pomodoro selvatico (circa 1 cm )

14 Mais coltivato Mais selvatico

15 Come si è arrivati a questo? Attraverso la domesticazione e il miglioramento genetico

16 a.c. Domesticazione delle piante e animali Cacciatore-raccoglitore Allevatore-agricoltore

17 L uomo primitivo Professione:allevatoreagricoltore- cominciò a selezionare le piante che più gli piacevano e presentavano delle caratteristiche utili alla loro raccolta

18 Esempio di domesticazione da parte dei nostri antenati primitivi Spiga di grano selvatico non matura Spiga di grano selvatico matura In condizioni naturali

19 Oh, guarda una spiga che non disarticola! Che bello ho trovato un MUTANTE!!! Uomo primitivo: Allevatore/agricoltore Ottimo: potremmo raccogliere 100 semi tutti insieme!

20 Esempio di domesticazione operato dai nostri antenati primitivi: Spiga di grano matura disarticolata Spiga di grano matura che non disarticola

21 Un chiaro esempio dell azione dell uomo sulle piante selvatiche Grano selvatico Grano coltivato

22 Dopo una lunga fase in cui l uomo ha operato come semplice selezionatore della variabilità naturale intorno al XVII-XVIII secolo ha iniziato a combinare in modo controllato la variabilità. Sono di questo periodo i numerosi incroci inter- e intra-specifici con lo scopo principale di studiare le funzioni del polline e ovulo (es: Josef Gottlieb Kolreuter nel 1760 produsse un ibrido tra la Nicotiana paniculata e N. rustica).

23 Dopo le scoperta da parte di Mendel delle leggi dell ereditabilità è stato possibile effettuare un miglioramento genetico più consapevole e mirato

24 Le varietà ad elevata resa prodotte in seguito sono il risultato dell applicazione delle conoscenze genetiche più avanzate di quel periodo, ovvero tramite: gli incroci intra- ed inter-specifici

25 Esempio di ibrido interspecifico artificiale: Triticale

26 Esempio di ibrido interspecifico artificiale: Mapo Origine: incrocio tra il mandarino Avana ed il pompelmo Duncan ottenuto da F. Russo presso l'istituto Sperimentale per l'agricoltura di Acireale, Italia

27 28 febbraio 1953: la scoperta della doppia elica del DNA da parte di James Watson and Francis Crick credo di aver scoperto il segreto della vita (Crick, nell'eagle Pub di Cambridge)

28 Questa scoperta determinò un radicale cambiamento anche nel settore del Miglioramento genetico vegetale, dove la continua ricerca di nuova variabilità da cui selezionare caratteri utili portò allo sviluppo delle tecniche di mutagenesi.

29 L uomo da semplice selezionatore e successivamente combinatore della variabilità naturale diventa l artefice della produzione di nuova variabilità su cui operare per la selezione di caratteri utili (anche se gli incroci inter-specifici avevano già rappresentato di fatto i primi tentativi di produrre nuova variabilità)

30 In agricoltura per sviluppare nuove varietà Uso di radiazioni per causare mutazioni casuali Raggi X, g

31 Es: Cariossidi di frumento irradiate con raggi gamma Raggi g Progenie genotipo selezionato Box 6

32 Box 7

33 Il grano duro Creso e' stato ottenuto da un incrocio tra una varieta' messicana, la Cymmit, e una italiana, la Cappelli, la quale e' stata precedentemente sottoposta a bombardamento con raggi X (è stato usato il mutante di Cappelli Cp B144). In generale, circa 2000 varietà coltivate derivano da questo trattamento

34 Più recentemente, le conoscenze soprattutto sui fitormoni hanno portato allo sviluppo di metodologie di Miglioramento genetico che utilizza colture cellulari

35 Da una singola cellula vegetale possiamo ottenere una pianta intera

36 Colture cellulari Variazione Somaclonale Colture aploidi Semi Artificiali Ibridi Interspecifici Embryo Rescue Fusione dei Protoplasti (ibridazione somatica) Micropropagazione

37 Esempio di varietà derivata da variazione somaclonale

38 Le tecniche del DNA ricombinante (ingegneria genetica) rappresentano un ulteriore affinamento delle tecniche di manipolazione genetica per il miglioramento genetico delle varietà coltivate.

39 Riassumendo. L agricoltura non è nata in seguito ad un processo di selezione naturale ma è una invenzione dell uomo Le piante coltivate non sono il risultato della selezione naturale ma della selezione artificiale operata dall uomo Le piante coltivate derivano da mutanti naturali sottoposti al processo di miglioramento genetico o da mutanti prodotti dall uomo sulla base delle tecniche di miglioramento genetico Le tecniche del miglioramento genetico si basano sulle conoscenze biologiche Le tecniche del DNA ricombinate sono metodologie del miglioramento genetico. Esse si basano sulle più attuali conoscenze biologiche

40 Produzione di piante transgeniche: Passaggi essenziali Isolamento del gene di interesse (es: inserimento in un plasmide) Preparazione di un costrutto per la trasformazione genetica Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale (Trasformazione genetica) Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di selezione) Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)

41 Produzione di piante transgeniche: caratteristiche essenziali di un costrutto genico gdna gene di interesse gdna Promotore Transgene specifico Terminatore Es. 1) CaMV 35S (343 bp) 2) Ubiquitina di mais (1992 bp) Es. NOS

42 Metodi di trasformazione Biologico (Agrobacterium): dicotiledoni Fisico (Biolistico): Monocotiledoni Elettroporazione Fusione con liposomi Microiniezione Vettori virali: solo per trasformazioni transienti

43 Metodo Fisico: trasformazione diretta Bombardamento o metodo biolistico (microprojectile or particle bombardment). Questa tecnica si basa sull uso di un bombardatore ( particle gun or gene gun ). Il costrutto viene precipitato su particelle d oro che vengono sparate nel tessuto vegetale. Nella amggior parte dei casi si osserva espressione transiente (il DNA non si integra nel genoma ma viene trascritto finchè non viene degradato). In una piccola percentuale di cellule il costrutto si integra nel DNA genomico e quindi si ha l espressione stabile. Uno dei principali limiti di questa tecnica è che spesso si ha l integrazione di copie multiple del transgene. Disco di rottura Valvola della pressione Disco con le particelle d oro ricoperte di DNA Linea per il vuoto Piastra di arresto Linea del gas Camera del vuoto Campione va qui

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48 Metodo biologico: Agrobacterium tumephaciens Possiede un megaplasmide in aggiunta al suo DNA cromosomico

49 Agrobacterium spp sono batteri del suolo Gram (-) responsabili di numerose malattie delle piante A. tumefaciens - crown gall disease galla del colletto rose grapevine A. rhizogenes - hairy root disease- radici pelose Meno studiato ma molto simile all A. tumefaciens

50 A volte il tumore può essere molto esteso!

51 Agrobacterium: un ingegnere genetico naturale Il trasferimento del T-DNA segue un preciso meccanismo con numerosi passaggi, alcuni dei quali sono stati chiariti

52 Agrobacterium e Ingegneria Genetia vegetale Osservazioni chiave Il T-DNA è permanentemente incorporato nel genoma della cellula ospite Nessuno dei geni codificati dal T-DNA sono necessari per questo; Soltanto i bordi del T-DNA e le funzioni vir sono necessari

53 Bordo di sinistra, LB Bordo di destra, RB Solo le due estremità circa 25 basi ciascuna - sono necessarie per il trasferimento e l integrazione del T-DNA

54 Operativamente per la trasformazione sono necessari: Il gene di interesse posto tra il LB e RB Geni Vir Questi due componenti devono essere presenti nell A. tumefaciens per poter trasferire il gene di interesse

55 Plasmide Ti Gene di interesse LB T-DNA B A C G D E vir Plasmide Ti RB ori

56 Sistema del Vettore binario Gene di interesse B A C G E D vir Plasmide Ti helper T-DNA LB RB Plasmide Ti ori ori

57 Sistema del Vettore binario Fig Watson et al DNA ricombinante

59 La necessità di usare i marcatori di selezione è dovuta al fatto che: Soltanto una piccola frazione delle cellule ospiti subisce la trasformazione

60 Capsula di Petri contenente terreno di coltura per la selezione (negativa) di piante trasformate (es. canamicina, erbicida) Funzione del marcatore di selezione Quindi, si usano condizioni di coltivazione in cui le cellule trasformate sopravvivono, mentre le cellule non trasformate muoino = pressione selettiva

62 Rigenerazione Il rapporto auxina /citochinina regola la morfogenesi nelle colture di tessuti

63 Piante e tessuti usati per la trasformazione La scelta del tessuto dipende dalla specie Il tessuto deve essere capace di generare callo (tessuto indifferenziato) da cui si potrà rigenerare la pianta intera Alcuni tessuti che si sono riscontrati trasformabili in più piante sono: Embrioni immaturi Dischi fogliari Meristemi apicali Es. I fiori di Arabidopsis possono essere semplicemente immersi in una soluzione contenente il costrutto genico (Floral dip transformation)

64 Metodo fisico Metodo biologico

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66 Cosa è stato fatto... Approvate per la commercializzazione negli USA: 12 specie di piante coltivate Mais Cotone Soia colza patata Pomodoro Barbabietola lino riso zucchine Papaya Cicoria

67 Sono stati modificati 6 caratteri Resistenza agli erbicidi Resistenza agli insetti (Bt) Resistenza ai virus Ritardo nella maturazione dei frutti Alterazione nel contenuto in olii Controllo nella produzione del polline 2010 Aumento nel contenuto in amilopectina

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74 Europa Unico evento autorizzato in EU è il mais Bt MON810 (coltivato in Spagna)

75 Resistenza agli insetti Mais resistente alla piralide (Ostrinia nubilalis) tramite la proteina Bt Esempio di: Unica pianta transgenica coltivata in Europa Implementazione dell espressione

76 Ciclo vitale della piralide: ciclo annuale

77 Ciclo vitale della piralide: danni della pianta

78 Infezioni secondarie su mais attaccata dalla piralide

79 Diffusione della piralide in Europa

80 Le piante di mais GM esprimono la proteina insetticida del Bacillus thuringensis Isolamento del gene Bt Preparazione del costrutto genico Trasformazione genetica Rigenerazione della pianta Cultivar resistente alla piralide

81 Madalità di azione della proteina Bt

82 Maisgard (Monsanto)

83 Maisgard (Monsanto) Sezione del fusto di mais transgenico per il gene Bt Pianta di mais NON transgenica

84 Resistenza agli erbicidi (carattere GM più diffuso) bromoxynil cotone glufosinato barbabietola, colza, mais, soia glifosato barbabietola, mais, cotone, soia sulfonil urea cotone, lino

85 Eritrosio-4-fosfato fosfoenolpiruvato 3-deidrochinato 3-deidroshichimato acido scichimico 3-fosfato fosfoenolpiruvato EPSP sintasi glifosato EPSP Corismato Triptofano Fenilalanina Tirosina

86 Modalità d azione delle piante di mais NK603 tolleranti al glifosato EPSPS: 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasi CTP: proteina di trasporto nel cloroplasto

87 Riso dorato Ricco di provitamina A

88 Patata d oro

89 AMFLORA Patata autorizzata alla coltivazione nel 2010, produce solo amilopectina

90 Principali preoccupazioni per ambiente e consumatori: 1. La diffusione di caratteri GM alle specie affini selvatiche; 2. La diffusione della resistenza agli antibiotici nelle popolazioni selvatiche di microrganismi; 3. Diffusione del materiale GM sulle coltivazioni biologiche : es: attraverso le api (che renderebbe la produzione biologica impossibile con l attuale normativa)

91 Limite 0.9%)

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94 I prodotti Biotech vengono Continuamente Controllati Scoperta Sviluppo del Prodotto Commercializzazione Isolamento del gene Trasform azione Valutazione della pianta in serra e in campo Selezione della linea Sviluppo della varietà Produzione in campo Market Post Market Es. negli USA NIH-Natinal Institute of Healt Linee guida USDA - U.S. Department of Agriculture Determina se è sicura da crescere EPA - U.S. Environmental Protection Agency Determina se è sicura per l ambiente FDA - U.S. Food and Drug Administration Determina se è sicura come cibo

95 Grazie a questi controlli non ci sono sul mercato i famosi mostri fragolapesce o pomodoro-pesce Cosi come non è presente in commercio la soia GE allergenica

96 Le piante GM sono più pericolose delle altre piante? No. Dagli studi pubblicati relativi alla sicurezza degli OGM (ca ) e dai dati ottenuti da una serie di studi finanziati dalla Comunità Europea durato 15 anni (70 milioni di, 400 Centri di ricerca pubblici coinvolti) emerge che gli OGM non manifestano un comportamento diverso da quello delle colture tradizionali

97 Regolamenti sulla Etichettatura degli alimenti contenenti OGM Stati Uniti: Concetto di alimenti OGM sostanzialmente equivalenti ai convenzionali. Se sostanzialmente equivalenti non c e necessità di etichettamento Europa: Alimenti contenenti >0.9% di OGM devono essere etichettati (49/2000) (solo per favorire la libera scelta del consumatore)

98 Controllo presenza OGM negli alimenti Si utilizza la tecnologia della reazione a catena della DNA Polimerasi (PCR) che consente di rilevare la presenza di OGM anche a livelli inferiori allo 0.1%

99 Analisi OGM sugli alimenti Estrazione del DNA Allestimento della reazione Analisi PCR Risultato

100 Conclusioni Gli OGM offrono diversi potenziali benefici se utilizzati appropriatamente: Cibo più sano Minore impatto ambientale Minori costi di produzione La valutazione deve essere sicuramente fatta caso per caso

101 Inoltre, si può sempre migliorare.. Le piante cisgeniche: utilizzo della procedura di trasformazione genetica per l inserimento di geni proveniente da piante sessualmente compatibili