Evoluzione e prospettive delle applicazioni biotecnologiche nella protezione delle piante: agenti fitopatogeni

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1 Università degli Studi Bari Consiglio Nazionale delle Ricerche Evoluzione e prospettive delle applicazioni biotecnologiche nella protezione delle piante: agenti fitopatogeni Giovanni P. Martelli Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata Università di Bari, Isitituto di Virologia Vegetale del CNR, Unità Organizzativa di Bari

2 BIOTECNOLOGIE: DEFINIZIONE OCSE Applicazione di principi scientifici e di ingegneria per la produzione di materiali a partire da agenti biologici,, utilizzando conoscenze derivanti dalla biologia, dalla biochimica, dalla genetica, dalla microbiologia, dall ingegneria biochimica, dalla chimica combinatoria e dai processi di separazione

3 BIOTECNOLOGIE FITOPATOLOGICHE 1973 Boyer & Cohen Mettono a punto la metodologia del DNA ricombinante Biotecnologia molecolare Progressi in altri settori della biologia Diagnosi Ingegneria genetica

4 DIAGNOSI Nei dizionari di lingua anglosassone la diagnosi é definita come l'arte di identificare una malattia dai suoi sintomi

5 Applicazioni biotec alla diagnosi sierologica: anticorpi monoclonali. Utilizzati soprattutto per la diagnosi delle infezioni virali

6 Subunità proteica di TMV Una subunità proteica di del virus del mosaico del tabacco ha 7 derminanti antigenici ciascuno dei quali induce la formazione di uno specifico anticorpo. L immunizzazione di un animale di laboratorio con siffatto materiale darà origine ad un antisiero policlonale

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8 USO DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI Monitoraggio ed identificazione di ceppi virali dotati di specifiche caratteristiche di pericolosità: Sharka delle drupacee Tristeza degli agrumi

9 DIAGNOSI MOLECOLARE In fitopatologia la diagnosi molecolare si è sviluppata negli anni 80. Le principali tecniche sono: Metodi elettroforetici (dsrna) Ibridazione molecolare (dot( blot, southern blot, northern blot) Amplificazione genica (= PCR, reazione a catena della polimerasi )

10 IBRIDAZIONE MOLECOLARE Consiste nell appaiamento di una sequenza genomica (RNA o DNA, molecola bersaglio) con una sequenza complementare marcata (sonda) di acido nucleico (cdna o crna)

11 IBRIDAZIONE MOLECOLARE L energia emessa dalla sonda marcata impressiona una lastra per raggi X Sonda marcata

12 AMPLIFICAZIONE GENICA (reazione a catena della polimerasi PCR) La PCR sfrutta la possibilità di ottenere una sequenza complementare di DNA (cdna) da una sequenza di acido nucleico (molecola bersaglio) presente nei tessuti vegetali infetti duplicandola in vitro, teoricamente all infinito, con la DNA polimerasi

13 TNA PCR a singolo stadio Estratto di pianta Trascrizione inversa (RT) Primer specifico antisenso as cdna Denaturazione as Primers specifici Senso ed antisenso Renaturazione DNA polimerai nucleotidi s as Estensione PCR s as M

14 PCR con inneschi virus-specifici specifici su estratti di acido nucleico totale da campioni olivo infetti OLV-1 SLRSV CMV ArMV OLRSV CLRV OLV-2 OYLaV Healthy

15 Diagnosi CTV in campioni prelevati in pieno campo con Real-time PCR Campioni infetti Campioni sani

16 Inneschi (primers) utilizzati per la PCR Virus: sequenze nucleotidiche di specifici geni quali proteina capsidica, polimerasi, proteina di movimento Batteri: Spaziatori interni (ITS) del gene dell RNA ribosomiale Funghi: Spaziatori interni (ITS) e/o spaziatori intergenici (IGS) del gene dell RNA ribosomiale Internal Transcribed Spacer (ITS) regions (650 bp) 18S(SSU) IG10F IGS 1 Intergenic Spacers Regions (IGS) IGS 2 IG13R 5.8S 28S (LSU) 5S 18S(SSU)

17 DNA BARCODING Il codice a barre del DNA: la nuova frontiera molecolare

18 Il DNA barcoding é un metodo tassonomico e diagnostico che usa un corto marchio genetico nel DNA mitocondriale dell'organismo che lo identifica come appartenente ad una specie particolare. E basato su di un concetto semplice: il DNA delle cellule lule eucariotiche ha un tasso relativamente veloce di mutazione, che provoca variabilità significativa nelle sequenze fra le specie ma comparativamente piccola all'interno della specie. Una regione 648-bp del gene mitocondriale citocromo ossidasi I è stata proposta come ' barcode ' potenziale.

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21 TRASFORMAZIONE GENETICA Organismi Geneticamente Modificati (OGM): Cosa sono? Gli OGM, rappresentano uno dei prodotti delle biotecnologie avanzate. Sono organismi il cui DNA è stato modificato in modo mirato attraverso tecniche (DNA ricombinante) che permettono l isolamento e il trasferimento da un organismo ad un altro di singoli geni.

22 Incrocio classico Ingegneria genetica Pianta donatrice Pianta da migliorare Donatore (pianta o altro) Pianta da migliorare

23 Organismi Geneticamente Modificati (OGM): Come si ottengono? Le metodologie sono svariate, ma la più antica e comune sfrutta un sistema di trasformazione naturale mediato da Agrobacterium tumefaciens, un batterio fitopatogeno

24 Tumori indotti da Agrobacterium tumefaciens Sistema trasformante naturale

25 Nascita di una pianta transgenica

26 Rispetto alle piante non trasformate quelle transgeniche (PGM) contengono in più il gene estraneo che è stato trasferito e che si è inserito stabilmente nel loro genoma. Le PGM di nuova generazione non hanno geni di resistenza agli antibiotici un tempo usati come marcatori di selezione

27 ESEMPI DI APPLICAZIONE DELLA TRASFORMAZIONE GENETICA IN CAMPO VEGETALE Modifica di specifiche caratteristiche della pianta: colore dei fiori, dimensione della taglia, aumentata capacità di radicazione, maggiore serbevolezza dei frutti, miglioramento delle proprietà organolettiche e/o del valore nutritivo di specifiche colture Produzione di sostanze farmacologiche o biomediche (antigeni per vaccini, anticorpi)

28 INDUZIONE DI RESISTENZA A : Erbicidi Avverse condizioni ambientali (salinità,, siccità, estremi termici) Parassiti (insetti, nematodi) Agenti patogeni (batteri, crittogame, virus)

29 Geni usati per l ottenimento di PGM resistenti a: VIRUS: uno qualunque dei geni del virus contro cui si vuole indurre resistenza BATTERI: geni che codificano proteine litiche CRITTOGAME: geni che esprimono molecole antifungine (proteine e tossine), geni R, ovvero manipolazione di geni SAR (resistenza sistemica acquisita).

30 A tutt oggi sono state sperimentalmente trasformate 37 differenti specie vegetali per la resistenza a 59 diversi virus ma solo 4 di esse (papaia, zucchino, peperone e pomodoro) vengono coltivate commercialmente. Non vi sono ancora esempi di piante resistenti a batteri e crittogame in coltura commerciale

31 VIRUS DELLA MACULATURA ANULARE Papaia transgenica Papaia non transgenica

32 Virus del mosaico giallo dello zucchino Pianta non trasformata Pianta transgenica

33 Piante non transgeniche Resistenza del pomodoro al virus del mosaico del cetriolo mediata dalla proteina virale capsidica Piante transgeniche

34 Plum pox virus (PPV) Sharka o vaiolatura del susino

35 COLTIVAZIONE DI PGM NEL MONDO In solo dieci anni l area l globale coltivata a PGM è aumentata di 50 volte passando dagli 1,7 milioni di ettari del 1996 ai 125 milioni di ettari del 2007 (ben oltre il triplo della superficie agraria italiana). Nel 2007 la coltura delle PGM ha interessato oltre 10 milioni di aziende in 23 diversi Paesi, 10 industriali ed 13 in via di sviluppo Gli Stati membri UE transgenici sono: Portogallo, Spagna, Francia, Germania, Polonia, Repubblica Ceca, Slovacchia, Romania

36 Area globale di colture transgeniche (milioni di ettari) Soybean Maize Cotton Canola Source: Clive James, 2008

37 Area globale di colture transgeniche resistenti (milioni di ettari) Herbicide Tolerance Insect Resistance Herbicide Tolerance/Insect Resistance Source: Clive James, 2008

38 Paesi che coltivano piante transgeniche (2007)

39 La coltivazione di PGM nel decennio dato un beneficio economico di 27 miliardi di dollari USA agli agricoltori (13 miliardi nei i Paesi in via di sviluppo e 14 miliardi nei Paesi industrializzati)

40 La trasformazione genetica, è innaturale? La trasformazione genetica, non fa altro che imitare, sia il tradizionale miglioramento genetico (trasferimento di geni di resistenza naturali da una pianta all altra mediante incrocio) sia un fenomeno, anch esso naturale, consistente nello scambio di materiale genetico tra piante e patogeni che si verifica nel corso della coevoluzione tra i due partners.

41 Il fenomeno in questione è ben documentato nel caso di fitovirus a DNA in cui sembra possa dar vita a dei veri e propri transgeni naturali che mettono al riparo le piante, che ne hanno acquisito in parte le sequenze, dalle infezioni dei virus da cui essi derivano

42 GRAZIE PER L ATTENZIONEL