sangue intero essicato su carta fattori interferenti biologici Chimico fisici: Farmacologici l'emolisi extravasale,

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1 Claudia De Croce Per effettuare il prelievo venoso si utilizza un ago a doppia punta, una viene inserita su un supporto, mentre l'altra si infila nella vena. Una volta che l' ago è in vena (non si incontra più resistenza), si inserisce la provetta nel supporto e si fa entrare l'ago dentro la provetta, creando quindi una continuità tra l'interno della vena e l'interno della provetta. All'interno della provetta è presente il vuoto e la quantità di sangue aspirato è proporzionale al vuoto. Il vuoto viene creato in relazione all'anticoagulante utilizzato, infatti alcuni devono essere mescolati con il sangue in quantità stechiometricamente uguali, altri invece devono essere mescolati con quantità più o meno maggiori di sangue. Questo è importante in quante se l'anticoagulante è insufficente rispetto al sangue, questo coagula, se invece l'anticoagulante è in eccesso rispetto al sangue, questo risulta troppo diluito. Può succedere che la provetta sia difettosa e che quindi non abbia il vuoto giusto, per ovviare a questo problema le provette con anticoagulante presentano un segno che indica il livello che il sangue deve raggiungere. Se il livello di sangue supera questo segno, il campione va buttato in quanto il rapporto stechiometrico è scorretto. Questo sistema detto "vacutainer" consente di sostituire le provette una dopo l'altra evitando così traumatismi al paziente e di velocizzare il prelievo. Inoltre il sangue entra a pressione nella provetta, perciò anche se l'anticoagulante è in polvere, questo viene mescolato perfettamente. Le provette presentano tappi con colori diversi e il colore dipende dal tipo di anticoagulante presente nella provetta; la provetta con il tappo di colorazione rosaviola contiene EDTA, un chelante del calcio.questo sequestra il calcio non rendendolo più disponibile per la coagulazione. Il tipo di anticoagulante utizzato dipende dal tipo di esame richiesto; per esempio nel campione trattato con EDTA non si può dosare la calcemia in quanto il calcio è sequestrato. Le provette contenti eparina hanno il tappo verde e si usano per ottenere il plasma; quelle contenenti citrato trisodico hanno tappo azzurro o nero (in quelle con il tappo nero il sangue è più diluito). Infine vi sono provette contenti miscele di anticoagulanti che vengono utilizzate per la determinazione dei gruppi sanguigni. Vi sono provette che all'interno non contengono anticoagulante, queste hanno tappo semplice in gomma e le pareti sono rivestite da silicone per evitare che l'urto del sangue determini lisi dei globuli rossi e quindi alterazione degli esami. Una variante di queste ultime è data da provette contenenti all'interno una resina che presenta densità intermedia tra la parte corpuscolate e la parte liquida del sangue. Queste provette vengono utilizzate per ottenere il siero; infatti in seguito alla centrifugazione si ha la separazione tra la parte corpuscolata disposta sul fondo e il siero disposto superficialmente. La resina si dispone tra le due fasi mantenendole separate e permette quindi di aspirare il siero senza contaminazione con elementi figurati.

2 Per l'analisi del sangue oltre a poter utilizzare sangue venoso intero, plasma e siero si può utilizzare anche il sangue intero essicato su carta; in questo caso si punge il polpastrello del paziente e si fa cadere una goccia di sangue su un pezzo di carta da filtro. Si usa questo test per studiare malattie metaboliche rare in quanto esistono pochi centri che fanno questi test e questa metodica permette che il campione possa essere spedito per posta. Esistono quelli che sono definiti fattori interferenti che sono fattori che alterano il risultato delle analisi, che perciò risulta essere al di fuori del range di riferimento in assenza di malattia. Tali fattori intervengono nella fase preanalitica e sono distinti in: biologici: l'assunzione di cibo e bevande altera gli esami del sangue, infatti questi devono essere effettuati a digiuno dalle 22 della sera prima in quanto in caso contrario ci potrebbero essere alterazioni della glicemia, lipemia e dei markers epatici. Inoltre bisogna assumere solo acqua in quanto bevande diverse come i succhi alterano la glicemia, mentre gli alcolici le ɤGT e gli enzimi epatici. Un altro fattore interferente biologico è l'intenso esercizio fisico che può causare variazioni nei livelli degli enzimi muscolari quali le CPK e le LDH. Ancora la postura; in posizione eretta la distribuzione dei liquidi fra il settore vascolare e quello interstiziale si modifica e il volume plasmatico diminuisce, mentre quello interstiziale aumenta. Per questa ragione nei pazienti ambulatoriali rispetto a quelli ospedalizzati si osserva un aumento delle sostanze che circolano legate alle proteine quali il Calcio, il colesterolo e la bilirubina. Anche gli stati psicologici per esempio lo stress possono interferire causando aumento della glicemia; la gravidanza causa riduzione dell'emoglobina e dei globuli rossi, aumento della VES e variazioni degli ormoni. Altri fattori sono l'età e il sesso, infatti l'emoglobina e i globuli rossi presentano delle variazioni in relazione all'età e al sesso. Chimico fisici:un esempio è dato dall' aggiunta di EDTA ad un campione su cui si deve dosare il calcio, oppure la somministrazione di penicillina che interferisce ossidando alcuni reattivi. Farmacologici: per esempio l'assunzione di diuretici causa riduzione degli elettroliti oppure l'assunzione di antidepressivi causa aumento della prolatina. Una delle cause più frequenti di interferenza è l'emolisi extravasale, con conseguente passaggio nel siero o nel plasma di Hb e di tutte le sostanze contenute all'interno dei globuli rossi. Bisogna distinguere l'emolisi extravasale da quella intravasale; la prima si verifica una volta che è stato prelevato il sangue a causa per esempio di sostanze contenute nelle provette oppure a causa di sbalzi termici o dell'utilizzo di aghi troppo sottili con rottura della membrana eritrocitaria. Quella intravasale si verifica all'interno dei vasi e la causa è di natura patologica, si verifica per esempio nei soggetti G6PD carenti a seguito dell'assunzione di alcuni farmaci. Alcune sostanze contenute all'interno dei globuli rossi hanno una concentrazione maggiore rispetto a quella del siero e del plasma, perciò si osserva un'aumento di tali sostanze quali il potassio che nel sangue ha una concentrazione molto bassa di circa 3,5 milliequivalenti/l, le LDH, le transaminasi. In caso di emolisi questo viene indicato dal laboratorio, infatti un campione emolizzato è facilmente riconoscibile:

3 la parte liquida del sangue da giallognola e trasparente diviene rossa a causa del rilascio di emoglobina dai globuli rossi. Questo non avviene in caso di emolisi intravasale in quanto Hb libera è tossica e viene immediatamente metabolizzata. L'utilizzazione clinica dei test di laboratorio presuppone il confronto dei valori ottenuti con i valori di riferimento. Questi rappresentano i risultati dei test considerati nel 95% di una popolazione non affetta dalla patologia che si vuole identificare con quel test. Il restante 5% avrà un risultato diverso ma non necessariamente patologico, allo stesso modo valori che rientrano nel range di riferimento, non necessariamente escludono la malattia. Una popolazione non affetta dalla malattia ha una distribuzione gaussiana dei risultati (curva a campana), ovvero la maggior parte delle persone ha una valore vicino alla media dei risultati, mentre man mano che ci si allontana dalla media diminuiscono il numero di persone con quel valore. In base alla teoria di Gauss si ricava che tra la media e il range compreso tra -2 deviazioni standard e +2 deviazioni standard rientra il 95% della popolazione. Se si prende come esempio un campione di persone non diabetiche con glicemia media di 80 e deviazione standard di 5, il range di riferimento sarà tra 70 e 90. infatti per costruire un range di riferimento si fà : valore medio -2 deviazioni standard = limite inferiore del range valore medio +2 deviazioni standard = limite superiore del range. Quindi in base alla legge di Gauss il 95% della popolazione avrà valori compresi tra 70 e 90, del restante 5% il 2,5% avrà valori più bassi rispetto a 70, l'altro 2,5% avrà valori più alti di 90. L'esame emocromocitometrico fornisce informazioni sulle cellule del sangue e sulle loro caratteristiche. Viene effettuato su sangue intero raccolto in EDTA negli adulti e su sangue capillare nei neonati.

4 Parametro Unità di misura Valori di riferimento eritrociti(gr o RBC) 10^6/µL M 4,3-5,9 F 4,0-5,1 Emoglobina (Hb) g/dl M 13,0-17,0 F 12,0-16,0 Ematocrito (Hct) % M F Volume corpuscolare medio (MCV) Emoglobina corpuscolare media (MCH) Concentrazione emoglobinica corpuscolare media (MCHC) Ampiezza di distribuzione degli elettrociti (RDW) fl M F pg % % ,6 Reticolociti % 0,5-2,5 Per quanto riguarda l'ematocrito, questo rappresenta il rapporto tra la parte corpuscolata e il plasma; la parte corpuscolata è rappresentata principalmente dai globuli rossi. Si calcola: Hct = MCV x GR/mm³ 1000 Il volume corpuscolare medio rappresenta il volume medio del globulo rosso; si calcola: MCV = HCT x 1000 GR Un suo aumento è indice di macrocitosi ( valori superiori a 100 fl ), una dimiuizione è indice di microcitosi ( valori inferio a 70 fl ); si parla di normocitosi per valori intermedi. L'anemia mediterranea è caratterizzata da microcitosi, mentre l'anemia da carenza di vitamina B12 da macrocitosi. Nell'anemia mediteranea si osserva anche una poliglobulia in quanto i globuli rossi sono più piccoli ma più numerosi per mantenere costante la Hb. L'emoglobina corpuscolare media indica la quantità di Hb presente in un unico globulo rosso. Si calcola: MCH = Hb GR/mm³ La concentrazione emoglobinica corpuscolare media rappresenta la quantità di Hb presente in un dato volume di globuli rossi; si calcola: MCHC = Hb/dl Hct

5 Il coefficente di distribuzione degli eritrociti fornisce una stima del grado di anisocitosi, cioè della diversità di forma dei globuli rossi. Parametro Unità di misura Valore di riferimento Globuli bianchi (WBC) 10^3/µL 4 10 Neutrofili % Linfociti % Monociti % 3 11 Eosinofili % 0,7 Basofili % 0,1 Grandi cellule non colorate (LUC) % 0-4 Piastrine (PLT) 10^3/µL Volume piastrinico medio (MPV) fl 7 13 Piastrinocrito % Per quanto riguarda le grandi cellule non colorate se aumentano sono dei blasi. PCT è il rapporto tra piastrine e parte liquida del sangue. I primi contaglobuli venivano detti di coulter, in quanto il primo fu ideato da Wollace H. Coulter che ipotizzò la possibilità di analizzare particelle sospese nei liquidi attraverso un sistema impendenziometrico: secondo questo principio una particella in grado di interropere un campo elettrico determina una variazione nel voltaggio quantificabile e associabile al numero e al tipo di cellule che lo avevano interrotto. [fonte wikipedia] Il sangue solubilizzato in un solvente che conduce la corrente veniva fatto passare attraverso uno strettissimo canale; ciascuna cellula, che attraversa singolarmente questo canale, interrompe la conducibilità e in base alla variazione di voltaggio i contaglobuli contavano i numero di cellule e le diversificavano in base alle dimensioni (i globuli rossi sono le più piccole). I contaglobuli attualmente più utilizzati prevedono una fonte luminosa che è un laser; questo viene fatto incidere sulla soluzione del campione che passa sempre attraverso uno stretto canale. Quando il fascio laser incontra una cellula avvengono un insieme di fenomeni ottici noti come "light scattering" e i contaglobuli sono provvisti di misuratori di luce diffusa posti anteriormente e posteriormente alle cellule. Dalla luce misurata anteriormente si ricavano informazioni sulle dimensioni cellulari, da quella misurata posteriormente si ricavano informazioni sulla costituzione della cellula, cioè sulla granulosità. Inoltre questi contaglobuli sono provvisti di fluorocromi che marcano le cellule e ci danno informazioni sulla tipologia cellulare.

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