RISOLUZIONE OIV/ENO 343/2010

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1 RISOLUZIONE OIV/ENO 343/2010 METODO PER LA DETERMINAZIONE DEL RAPPORTO ISOTOPICO 13 C/ 12 C DELLA GLICERINA NEI VINI MEDIANTE GASCROMATOGRAFIA-COMBUSTIONE O CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE ACCOPPIATE A SPETTROMETRIA DI MASSA DEL RAPPORTO ISOTOPICO (GC-C-IRMS O HPLC-IRMS) L ASSEMBLEA GENERALE, Visto l articolo 2 paragrafo 2 iv dell Accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla creazione dell Organizzazione Internazionale della Vite e del Vino, Su proposta della Sotto-commissione Metodi di Analisi, DECIDE di integrare l Allegato A della Raccolta dei Metodi Internazionali di Analisi del Vino e del Mosto con il seguente metodo di tipo IV: Titolo Metodo per la determinazione del rapporto isotopico 13 C/ 12 C della glicerina nei vini tramite GasCromatografia-Combustione o cromatografia liquida ad alta prestazione accoppiate a Spettrometria di Massa del Rapporto Isotopico (GC-C-IRMS o HPLC-IRMS) Tipo di metodo IV 1. CAMPO D APPLICAZIONE I presenti metodi, basati sulla gascromatografia [1] o cromatografia liquida accoppiata a uno spettrometro di massa per rapporto isotopico (GC-C-IRMS o HPLC-IRMS), consentono le misurazioni del rapporto 13 C/ 12 C della glicerina. Se la sua quantificazione è richiesta simultaneamente a un rapporto isotopico 13 C/ 12 C, è possibile usare GC-IRMS. Anche l uso del 1,5 pentandiolo, come standard interno, consente la determinazione della concentrazione di glicerina durante la stessa analisi del rapporto 13 C/ 12 C. 1

2 2. DEFINIZIONI 13 C/ 12 C: rapporto tra gli isotopi carbonio-13 ( 13 C) e carbonio-12 ( 12 C) per un dato campione. δ 13 C: contenuto di carbonio-13 ( 13 C) espresso in parti per mille. GC-C-IRMS: Tecnica ifenata di combustione gascromatografica accoppiata alla spettrometria di massa dei rapporti isotopici. V-PDB: Vienna-P-D-Belemnite. PDB è il principale materiale di riferimento per la misurazione delle variazioni naturali del contenuto di isotopi carbonio-13, consistente di carbonato di calcio proveniente da uno scudo di belemnite del Cretaceo nella Formazione Pee Dee, nella Carolina del Sud (USA). Il suo rapporto isotopico 13 C/ 12 C, o R PDB è 0, Le riserve di PDB si sono esaurite da lungo tempo, ma esso è rimasto il riferimento principale per esprimere le variazioni naturali del contenuto di isotopo carbonio-13, e il materiale di riferimento disponibile presso l IAEA (Agenzia Internazionale per l Energia Atomica) di Vienna (Austria) è tarato proprio rispetto al PDB. Le indicazioni isotopiche del carbonio-13 naturalmente presente sono convenzionalmente espresse in rapporto al V PDB. 3. PRINCIPIO Esiste una notevole differenza tra il contenuto in carbonio-13 degli zuccheri delle piante a causa dei diversi cicli di fotosintesi C 3 (ciclo Calvin ) e C 4 (Hatch-Slack). In maggioranza, le piante come la vite e la barbabietola appartengono al gruppo C 3, mentre il mais e il giunco appartengono al gruppo C 4. I contenuti di carbonio-13 dello zucchero e dei relativi metaboliti ottenuti mediante fermentazione (etanolo, glicerina) sono correlati. La misurazione del contenuto di carbonio-13 della glicerina potrebbe consentire la possibile rilevazione di aggiunta di glicerina ottenuta dal mais (pianta C 4 ) o per via sintetica (sorgenti fossili) ai vini o alle bevande alcoliche. La separazione della glicerina dalla matrice del vino si ottiene con un gascromatografo o un cromatografo liquido. In GC-C-IRMS, dopo la separazione cromatografica, l effluente subisce una combustione e una fase di riduzione, passando attraverso l ossidazione e i forni di riduzione di un interfaccia di combustione. Componenti diversi dalla glicerina, in particolare il solvente, sono scaricati tramite una valvola di riflusso durante il percorso, per evitare danni ai forni e interferenze nei cromatogrammi. Il contenuto di carbonio-13 è determinato sul biossido di carbonio (anidride carbonica) gassoso risultante dall ossidazione della glicerina contenuta nel campione. Una volta ossidata la glicerina, si producono CO 2 e H 2 O. L acqua prodotta durante la combustione è eliminata con una trappola di rimozione dell acqua consistente in una membrana di Nafion. L anidride carbonica è eluita con una corrente di elio fino alla sorgente IRMS per l analisi 13 C/ 12 C. In HPLC-IRMS, dopo la separazione cromatografica, il campione viene ossidato mentre ancora si trova in fase mobile rispetto all interfaccia. La CO 2 così formatasi viene rimossa in linea dalla corrente del solvente, grazie ad una membrana di scambio gas, per essere inserita in una corrente di He. La corrente He attraversa una trappola ad acqua consistente in una membrana Nafion e viene quindi introdotta nella fonte ioni di IRMS attraverso uno split aperto. 2 / 15

3 Le varie possibili combinazioni degli isotopi 18 O, 17 O, 16 O e 13 C, 12 C determinano la massa 44 corrispondente all isotopomero 12 C 16 O 2, la massa 45 corrispondente alle specie 13 C 16 O 2 e 12 C 17 O 16 O e la massa 46 per l isotopomero 12 C 16 O 18 O ( 13 C 17 O 16 O e 12 C 17 O 2 possono essere trascurati data la loro bassissima abbondanza). Le correnti ioniche corrispondenti sono determinate in tre diversi collettori. La corrente ionica m/z 45 è corretta per il contributo del 12 C 17 O 16 O che è calcolato sulla base dell intensità di corrente misurata per m/z 46, considerando l abbondanza relativa di 18 O e 17 O (correzione di Craig). Il confronto con un materiale di riferimento calibrato rispetto allo standard internazionale V-PDB permette di calcolare il contenuto di carbonio-13 sulla scala relativa 13 C. 4. REAGENTI Devono essere utilizzati i reagenti e gli standard di lavoro elencati di seguito: 4.1 Etanolo anidro (numero CAS ). 4.2 Glicerina pura 99% (CAS ) ,5-pentandiolo (CAS ). 4.4 Soluzione di lavoro di 1,5-pentandiolo (4.3) in etanolo (4.1). Questa soluzione preparata a una concentrazione nota esattamente, nell intervallo tra 0,5 e 1,0 g L -1, è usata per diluire i campioni di vino. 4.5 Acido Ortofosforico. 4.6 Sodio Perossidisulfato utilizzato come reagente di ossidazione. 4.7 Elio per analisi utilizzato come gas vettore (CAS ). 4.8 Ossigeno per analisi utilizzato come gas rigeneratore per il reattore di combustione (CAS ). 4.9 Bombola di anidride carbonica per analisi, utilizzata come gas di riferimento secondario per il contenuto di carbonio-13 (CAS ) Campioni standard di lavoro di glicerina con rapporto 13 C/ 12 C calibrato rispetto ai materiali di riferimento internazionale Campioni standard di lavoro di 1,5-pentanediolo con rapporto 13 C/ 12 C calibrato rispetto ai materiali di riferimento internazionali. 5. APPARATO E ATTREZZATURE 5.1 Spettrometro di massa per rapporti isotopici Spettrometro di massa per rapporti isotopici (IRMS) in grado di determinare il contenuto relativo di 13 C nel gas CO 2 presente in natura con una precisione interna dello 0,05 o migliore, espresso come valore relativo (punto 8. Calcolo). La precisione interna è qui definita come la differenza tra due misurazioni dello stesso campione di CO 2. Lo spettrometro di massa utilizzato per misurare i rapporti isotopici è dotato di un triplo collettore per misurare contemporaneamente le intensità per m/z = 44, 45 e 46. L IRMS è dotato di software per il pilotaggio dell analisi, l acquisizione dei dati e l elaborazione dei risultati analitici per il calcolo dei rapporti isotopici. 3 / 15

4 5.2. Gascromatografo Gascromatografo (GC) accoppiato tramite un interfaccia di combustione ad uno spettrometro di massa per rapporti isotopici (5.1). Colonna capillare polare per gascromatografo che permette la separazione cromatografica della glicerina dagli altri componenti del vino (per es. colonna capillare di vetro di silice Chrompack WCOT riempita di polietilenglicole fissativo CP-Wax-57 CB, 25 m, 0,25 mm id, spessore dello strato interno 0,20 μm). Interfaccia di combustione generalmente composta di un reattore per ossidazione (tubo in ceramica contenente fili di nichel, platino e rame) e un reattore riduttore (tubo in ceramica contenente fili di rame) Cromatografo liquido Cromatografo liquido (LC) accoppiato tramite un interfaccia LC Isolink a uno spettrometro di massa per rapporti isotopici (5.1). Il cromatografo liquido deve essere dotato di una colonna che consenta la separazione cromatografica della glicerina dagli altri componenti del vino senza utilizzare solventi organici o additivi (ad es. HyperREZ Carboidrati H +, 30 cm, 8 mm). L interfaccia Isolink è composta di un reattore per ossidazione capillare e uno scambiatore a membrana (tre membrane) Materiale Normali attrezzature di laboratorio e in particolare le seguenti: -Siringhe per l iniezione di campioni o campionatore automatico -Beute calibrate, filtri da 0,2 μm, vials per cromatografia e siringa da 10 μl per liquidi. L attrezzatura di laboratorio sopra elencata funge da esempio e può essere sostituita da altre attrezzature aventi una performance equivalente. 6. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER I TEST 6.1 Determinazione 13 C/ 12 C della glicerina tramite GC-C-IRMS Ogni campione di vino è filtrato su un filtro da 0,2 μm e quindi un aliquota è diluita (rapporto 1:4) con etanolo. Ogni campione è poi versato in un appropriato vial cromatografico che viene quindi chiuso saldamente e conservato a T 4 C fino all analisi Rapporto 13 C/ 12 C della glicerina e sua quantificazione tramite GC-C-IRMS Ogni campione di vino è filtrato su un filtro da 0,2 μm e quindi un aliquota è diluita (rapporto 1:4) con la soluzione di lavoro di 1,5-pentandiolo (4.4). Ogni campione è poi 4 / 15

5 versato in un appropriato vial cromatografico che viene quindi chiuso saldamente e conservato a T 4 C fino all analisi Determinazione 13 C/ 12 C della glicerina tramite HPLC-IRMS Ogni campione di vino è filtrato su un filtro da 0,2 μm e quindi un aliquota è diluita con acqua. Ogni campione è poi versato in un appropriato vial cromatografico che viene quindi chiuso saldamente e conservato a T 4 C fino all analisi. 7. PROCEDURA 7.1. GC-C-IRMS La seguente descrizione si riferisce alle procedure utilizzate generalmente per la determinazione del rapporto isotopico 13 C/ 12 C della glicerina tramite l utilizzo di sistemi automatizzati GC-C-IRMS commerciali. Le procedure possono essere adattate secondo i cambiamenti introdotti dal produttore. Note: i volumi, le temperature, i flussi e i tempi sono indicativi. I valori corretti dovranno essere ottimizzati sulla base delle istruzioni del produttore Condizioni analitiche Utilizzando la colonna e l interfaccia di combustione descritte come esempio in (5.2), si possono applicare i seguenti parametri: A. La temperatura dell iniettore è fissata a 270 C. B. Il programma di temperatura è impostato come segue: temperatura iniziale della colonna di 120 C; un tempo di mantenimento di 2 min.; la temperatura aumenta poi allavelocità di 10 C min -1, fino al valore finale di 220 C, con un tempo di mantenimento finale di 2 min. Ogni ciclo richiede 14 min, senza considerare il tempo necessario per il raffreddamento. C. Usato come gas vettore. D. Le temperature dei reattori di combustione e riduzione dell interfaccia di combustione GC sono fissate, rispettivamente, a 960 e 640 C. E. In ciascuna iniezione, si introducono nella colonna 0,3 μl di soluzione campione in modalità high-split (120 ml min -1 ). La riossidazione del reattore di ossidazione deve essere eseguita ad intervalli regolari (ad es. una volta alla settimana) utilizzando O 2 (gli intervalli dipendono dalle quantità totali di sostanze che hanno attraversato il reattore) Rapporto 13 C/ 12 C della glicerina Durante ciascuna analisi 13 C/ 12 C, vengono immessi almeno due impulsi di CO 2 gassosa (4.9) dalla bombola. Questa CO 2 è preventivamente calibrata rispetto ad altri standard internazionali calibrati sul V-PDB rispetto agli standard internazionali IAEA. La CO 2 gassosa di riferimento può anche essere calibrata rispetto a standard interni. Ogni campione di vino (6.1) è iniettato 3 volte. È necessario includere riferimenti di controllo adeguati in ogni gruppo. 5 / 15

6 Qui di seguito si riporta un gruppo tipico: - Campione 1 - Campione 1 - Campione 1 - Campione 2 Ogni campione è misurato 3 volte Campione 6 - Campione 6 - Campione 6 Il Campione di controllo è una soluzione in etanolo di glicerina con un valore δ 13 C noto misurato in precedenza con precisione (con Analizzatore di Elementi-IRMS, per esempio) che consente di verificare gli eventuali spostamenti lungo la sequenza delle misurazioni e di correggere i risultati Rapporto 13 C/ 12 C della glicerina e sua quantificazione Se viene richiesta la quantificazione della glicerina contemporaneamente alla misura del rapporto isotopico 13 C/ 12 C, la procedura precedente (7.1.2) è applicata ai campioni preparati come descritto al punto 6.2. L 1,5-pentandiolo (4.3) permette di determinare la concentrazione di glicerina. Si possono inoltre usare i valori δ 13 C del riferimento interno per valutare la precisione delle iniezioni e il controllo qualitativo delle determinazioni isotopiche e della fase di reazione di combustione. La concentrazione di glicerina nei campioni di vino è determinata utilizzando il metodo dello standard interno. A questo scopo, si deve realizzare una curva di calibrazione utilizzando una concentrazione costante nota per lo standard interno, l 1,5-pentandiolo, e cinque soluzioni di glicerina a diverse concentrazioni note, da 0,50 a 10 g L -1. Queste soluzioni sono preparate pesando e sciogliendo la glicerina (4.2) e il 1,5-pentandiolo in etanolo (4.1) servendosi di beute graduate. Assicurarsi della linearità della risposta analizzando tre volte successivamente ciascuna soluzione standard di linearità contenente lo standard interno HPLC-IRMS La seguente descrizione si riferisce alle procedure utilizzate generalmente per la determinazione del rapporto isotopico 13 C/ 12 C della glicerina tramite l utilizzo di sistemi automatizzati HPLC-IRMS commerciali. Le procedure possono essere adattate secondo i cambiamenti introdotti dal produttore dello strumento. Note: i volumi, le temperature, i flussi e i tempi sono indicativi. I valori corretti dovranno essere ottimizzati sulla base delle istruzioni del produttore Condizioni di lavoro Utilizzando la colonna e l interfaccia descritte come esempio in (5.3), si possono applicare i seguenti parametri: 6 / 15

7 A. Il rapporto di flusso dell eluente è definito a 400 L min -1 B. Il rapporto di flusso dell acido e dei reagenti ossidanti nell interfaccia LC è definito, rispettivamente, a 40 e 30 L min -1. C. Le termperature del reattore di interfaccia e della colonna sono definite, rispettivamente, a 99,9 e 65 C. D. Il rapporto di flusso dell elio dell unità di separazione è definito a 1 L min -1. I contenitori del reagente sono degasati utilizzando elio durante la procedura cromatografia completa Rapporto 13 C/ 12 C della glicerina Durante ciascuna analisi 13 C/ 12 C, vengono immessi almeno due impulsi di CO 2 gassosa (4.9) dalla bombola (vedere un esempio di cromatogramma in 11.2). Questa CO 2 è preventivamente calibrata rispetto ad altri standard internazionali calibrati sul V-PDB rispetto agli standard internazionali IAEA. La CO 2 gassosa di riferimento può anche essere calibrata rispetto a standard interni. Ogni campione di vino (6.3) è iniettato 3 volte. È necessario includere riferimenti di controllo adeguati in ogni gruppo. Qui di seguito si riporta un gruppo tipico: - Campione 1 - Campione 1 - Campione 1 - Campione 2 Ogni campione è misurato 3 volte Campione 6 - Campione 6 - Campione 6 Il Campione di controllo è una soluzione di glicerina con un valore δ 13 C noto misurato in precedenza con precisione (con Analizzatore di Elementi-IRMS, per esempio) che consente di verificare gli eventuali spostamenti lungo la sequenza delle misurazioni e di correggere i risultati. 8. CALCOLI 8.1. Rapporto 13 C/ 12 C Rapporto isotopico 13 C/ 12 C può essere espresso tramite la sua deviazione da un riferimento operativo. La deviazione isotopica del carbonio-13 (δ 13 C) è quindi calcolata su una scala delta per mille (δ/1000 o δ ) confrontando i risultati ottenuti per il campione da misurare con quelli di un riferimento di lavoro precedentemente calibrato sulla base del riferimento internazionale principale (V-PDB). Durante le analisi 13 C/ 12 C, si introduce CO 2 gassosa di riferimento calibrata rispetto ad altri standard internazionali calibrati su PDB. I valori δ 13 C sono espressi rispetto al riferimento operativo nel modo seguente: 7 / 15

8 δ 13 C campione/rif = (R campione /R rif 1) x 1000 dove R campione e R rif sono rispettivamente i rapporti isotopici 13 C/ 12 C del campione e del biossido di carbonio utilizzato come gas di riferimento (4.9). I valori δ 13 C sono espressi rispetto al V-PDB nel modo seguente: δ 13 C campione/v-pdb = δ 13 C campione/rif + δ 13 C rif/v-pdb + (δ 13 C campione/rif δ 13 C rif/v-pdb )/1000 dove δ 13 C rif/v-pdb è la deviazione isotopica precedentemente determinata del riferimento di lavoro dal V-PDB. Possono verificarsi piccole variazioni durante la misurazione in linea dovute a cambiamenti nelle condizioni degli strumenti. In questo caso i valori δ 13 C dei campioni devono essere corretti secondo la differenza nel valore δ 13 C misurato del campione di lavoro standard e del reale valore di questo, calibrato in precedenza rispetto a V-PDB per confronto con uno dei materiali di riferimento internazionale. Tra due misurazioni del campione di lavoro standard, la variazione, e quindi la correzione da applicare ai risultati ottenuti dai campioni, può essere considerata come lineare. Il campione di lavoro standard deve essere misurato all inizio e alla fine della serie di campioni. Una correzione può quindi essere calcolata per ogni campione che utilizzi l interpolazione lineare Concentrazione di glicerina mediante GC-IRMS Quando si genera la curva di calibrazione, per ciascuna iniezione, il parametro misurato del quale si tiene conto è l area S (in V*S) fornita dallo spettrometro. Calcolare il rapporto R come espresso nell'equazione 1 qui sotto e tracciare un grafico di R in funzione del rapporto di concentrazione della glicerina rispetto allo standard interno (IS), C glic campione. Si deve ottenere un grafico lineare, con un coefficiente di correlazione di almeno 0,99. Equazione 1 Area glicerolo R Area SI Utilizzando le condizioni analitiche descritte (7.1.1), il 1,5-pentandiolo, essendo meno polare della glicerina, mostra un tempo di ritenzione di circa 310 s, mentre quello della glicerina è di 460 s (vedere un esempio di cromatogramma in 11.1). La concentrazione di glicerina di ciascuna iniezione è calcolata per mezzo della seguente equazione: 8 / 15

9 Equazione 2 Cglic K C campione 1, 5PD campione S S glic 1,5PD campione campione fattore di diluizione Dove: Cx campione, è la concentrazione g L -1 della specie nel campione; SX campione è l area dei picchi prodotta; K (il fattore di risposta) è calcolato come segue: Equazione 3 (vedere 8.2) C K C glics t 1,5PDS t S S 1,5PDSt Il suffisso St indica le concentrazioni e le aree di 1,5-pentandiolo e glicerina nelle cinque soluzioni Standard preparate per la calibrazione (7.1.3); Fattore di diluizione: considerando le condizioni di campionamento precedentemente descritte (7), il fattore di diluizione è 4. Il valore di concentrazione in g L -1 di ciascun campione è la media delle tre iniezioni. 9. GARANZIA DI QUALITÀ E CONTROLLI 9.1. GC-C-IRMS Per ogni campione, controllare che la deviazione standard (SD) nei tre vials, misurata in successione, sia inferiore a 0,6. Il risultato finale per un dato campione rappresenta il valore medio per le tre misurazioni. Se la deviazione è maggiore di 0,6, si deve ripetere la misurazione. I controlli relativi alle misurazioni corrette possono essere basati sulla corrente ionica dove m/z = 44, proporzionale alla quantità di carbonio inserita nel sistema. In condizioni standard, la corrente ionica dovrebbe essere quasi costante per i campioni analizzati. Una deviazione significativa potrebbe essere indicativa di una separazione imperfetta e dell ossidazione della glicerina oppure dell instabilità dello spettrometro di massa HPLC-IRMS Controllare che il valore 13 C per il riferimento di lavoro non differisca per più di 0,5 rispetto al valore ammissibile. Se ciò non succede, verificare le impostazioni dell apparato dello spettrometro e, se necessario, regolare queste ultime. Per ogni campione, controllare che la deviazione standard (SD) nei tre vials, misurata in successione, sia inferiore a 0,6. Il risultato finale per un dato campione rappresenta il valore medio per le tre misurazioni. Se la deviazione è maggiore di 0,6, si deve ripetere la misurazione. glicst 9 / 15

10 I controlli relativi alle misurazioni corrette possono essere basati sulla corrente ionica dove m/z = 44, proporzionale alla quantità di carbonio inserita nel sistema. In condizioni standard, la corrente ionica dovrebbe essere quasi costante per i campioni analizzati. Una deviazione significativa potrebbe essere indicativa di una separazione imperfetta e dell ossidazione della glicerina oppure dell instabilità dello spettrometro di massa. 10. CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE DEL METODO GC-C-IRMS Precisione Sono stati condotti studi preliminari su 4 soluzioni di vino sintetico (acqua-etanolo-glicerina), preparate usando campioni di glicerina di diversa origine e con il valore δ 13 C già determinato con EA- IRMS. Per le 3 ripetizioni, n=3, con la tecnica GC-C-IRMS è stata considerata accettabile una deviazione standard SD 0,6. La precisione può essere affetta da sovrapposizione tra il 1,5-PD e altri componenti del vino o da sottoprodotti quando si misurano i vini dolci Determinazione della concentrazione di glicerina Per la validazione di questo metodo, sono state usate 2 soluzioni di glicerina. Assumendo una concentrazione tipica della glicerina da 4 a 10 g L -1 nel vino secco, le 2 soluzioni sono rappresentative di questo intervallo. La prima soluzione è di 4,0 g L -1 e fornisce una concentrazione sperimentale di 3,6 g L -1 (SD=0,2, n=8). La seconda soluzione, 8,0 g L -1, fornisce un valore di 7,9 g L -1 (SD=0,3, n=8). Inoltre, 5 campioni di vino (A-E) già dosati per la concentrazione di glicerina utilizzando altri metodi* attraverso il test di idoneità BIPEA sono stati iniettati per testare questo metodo. Tabella 1: Confronto con la concentrazione di 5 vini dosati. Campione Tipo A B C D E Bianco Rosato Bianco Rosso Bianco Intervallo dato Valore medio con GC-C-IRMS * Sono state eseguite determinazioni BIPEA con HPLC e/o analisi enzimatica. Le concentrazioni sono fornite in g L -1. n>3 e SD < 0,6. Le concentrazioni di glicerolo trovate mediante GC-C-IRMS sono coerenti con i valori ottenuti usando altre tecniche analitiche come la determinazione enzimatica o l'utilizzo di HPLC. 10 / 15

11 10.2. HPLC-IRMS Precisione Validazione interna del metodo HPLC-IRMS Per la validazione del metodo HPLC-IRMS, sono stati utilizzati i seguenti campioni: uno di glicerina standard, tre di vini sintetici (concentrazioni di glicerolo comprese nei valori di concentrazioni tipici dei vini) e un vino. La precisione della misura della glicerina è stata determinata ripetendo l'analisi dieci volte su ogni campione, in condizioni di ripetibilità ed effettuando dieci analisi indipendenti sullo stesso campione in tre giorni differenti, in condizioni di riproducibilità (Tabella 2). 11 / 15

12 Tabella 2. Accuratezza e precisione dei valori δ 13 C di glicerina ottenuti mediante HPLC- IRMS a HPLC IRMS Campione Ripetizioni per campione Giorno 1 Giorno 2 Giorno 3 Precisione Media δ 13 C DS Media δ 13 C DS Media δ 13 C Glicerina (standard) b 10 27,99 0,05 27,94 0,04 27,95 0,08 0,17 0,18 DS r R Vino sintetico (6 g/l) Vino sintetico (8 g/l) Vino sintetico (10 g/l) 10 28,06 0,13 28,14 0,12 28,14 0,11 0,34 0, ,11 0,12 28,18 0,07 28,21 0,07 0,25 0, ,06 0,06 28,06 0,09 28,05 0,09 0,23 0,24 Vino 10 28,88 0,10 28,85 0,27 28,72 0,23 0,60 0,62 a I valori di δ 13 C sono espressi in vs V PDB b Risultato EA IRMS glicerina (standard): 28,02 + 0,09 I seguenti parametri di validazione per la determinazione del valore di δ 13 C di glicerina sono stati ottenuti da un campione di vino: - Ripetibilità r: 0,60 - Riproducibilità R: 0,62 12 / 15

13 11. ALLEGATO 11.1 Cromatogramma tipico di un analisi GC-C-IRMS della glicerina nel vino. segnali di riferimento della CO 2 gassosa 1,5-pentandiolo Glicerolo 13 / 15

14 11.2 Cromatogramma tipico di un analisi HPLC-IRMS del glicerolo 14 / 15

15 12. BIBLIOGRAFIA 1. Calderone G., Naulet N., Guillou C., Reniero F., Characterization of European wine glycerol: stable carbon isotope approach. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52, Cabanero AI, Recio JL, Ruperez M. Simultaneous stable carbon isotopic analysis of wine glycerol and ethanol by liquid chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry. 15 / 15