Applicazioni Industriali della Cinetica Enzimatica

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Battista Bianchi
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1 Applicazioni Industriali della inetica Enzimatica La produzione di enzimi Gli enzimi sono di norma confinati all interno di singole cellule o di tessuti; in alcuni casi però (p. es., enzimi del succo gastrico, del succo pancreatico, della saliva, ed anche enzimi prodotti da organismi monocellulari) ) possono venire secreti da cellule e trovarsi liberi nell ambiente esterno. L estrazione degli enzimi comporta dunque la necessaria rottura di tessuti e la lisi di cellule, ottenute per via meccanica o con l intervento di altri enzimi: queste operazioni, se non sono condotte con opportuni accorgimenti, possono compromettere l attività catalitica degli enzimi stessi. La liberazione del liquido cellulare può avvenire, di volta in volta, per omogeneizzazione, per agitazione con polveri abrasive, con l uso di ultrasuoni, per surgelazione e successiva fusione, per forzatura attraverso un orifizio, per differenza di pressione osmotica (shock( osmotico), con detergenti che solubilizzano le membrane biologiche, ed infine con enzimi che idrolizzano i polisaccaridi delle pareti cellulari. inetica enzimatica - 4 1

2 La dispersione macromolecolare così ottenuta, all interno della quale sono compresi anche gli enzimi, va poi depurata di tutte le particelle solide sospese (centrifugazione) e concentrata: il metodo classico di concentrazione consiste nell aggiungere alla soluzione un sale solubile (solfato di ammonio) che, presente in grande quantità, riduce la solubilità degli enzimi. on introduzioni graduali di sale si realizza una precipitazione frazionata della parte proteica della soluzione. In realtà, le procedure di precipitazione comportano una relativa riduzione dell attività enzimatica a causa di una parziale denaturazione degli enzimi. Un metodo più recente e migliore per la concentrazione degli enzimi è rappresentato dall ultrafiltrazione attraverso membrane; le membrane più semplici possono essere paragonate a dei veri e propri filtri i cui pori consentono il passaggio di molecole di dimensioni comprese fra 50 e 500 µm. Va detto che questa tecnica può risentire delle ostruzioni provocate dalla presenza di molecole di diametro maggiore e risulta efficace solo quando si possa operare in condizioni di bassa selettività. inetica enzimatica - 4 2

3 Assai più vantaggiosa è l ultrafiltrazione con sottili membrane gelatinose attraverso le quali solventi e soluti migrano per effetto diffusivo; come è noto, la velocità di diffusione è proporzionale alla differenza di concentrazione ai due lati della membrana. In realtà il fenomeno della diffusione può venire alterato da una lunga serie di fattori e risulta perciò piuttosto complesso; questa tecnica di concentrazione è però assai apprezzata perché non modifica le strutture molecolari, non richiede reagenti chimici e può essere condotta a bassa temperatura. Altre metodologie di concentrazione sono l evaporazione sotto vuoto, il congelamento e la liofilizzazione. Una volta concentrati, gli enzimi vanno purificati con metodi che sono sostanzialmente cromatografici.. I metodi cromatografici consentono di separare gli enzimi, ottenendoli alla fine con elevati gradi di purezza. inetica enzimatica - 4 3

4 I biosensori I biosensori sono dei dispositivi che, coniugando un mediatore biologico ed un elemento di trasduzione, consentono di riconoscere specificamente alcuni substrati organici. Il mediatore biologico, ottenuto per immobilizzazione di enzimi su opportune membrane, funge da elemento di riconoscimento molecolare e provoca, alla presenza del substrato selettivamente individuato, una reazione chimica; il trasduttore converte l informazione biologica in segnale elettrico, rilevando (in genere, per via elettrochimica) la presenza dei prodotti della reazione enzimatica. Ad esempio, il biosensore per il glucosio, utilizza l enzima glucosio ossidasi per provocare la reazione di riduzione del ferrocene in presenza di glucosio; il ferrocene ridotto viene poi ossidato all elettrodo e in virtù di questa reazione redox si può risalire alla concentrazione di glucosio; lo schema del processo è il seguente: glucosio + ferrocene (ox) Glucosio ossidasi acido gluconico + ferrocene (red) elettrodo ferrocene (red) ferrocene (ox) + n. e inetica enzimatica - 4 4

5 Pt (+) In alternativa, si può ricorrere ad un diverso schema di reazione: glucosio + O 2 Glucosio ossidasi acido gluconico + 2 O 2 2 O 2 Anodo di Pt O n. e Acetato di cellulosa Membrana con enzima Membrana di poliuretano o policarbonato In modo del tutto analogo funzionano i biosensori per urea e per piruvato: O 2 N N 2 Ureasi O 3 + N 4 + piruvirato + 3 PO 4 + O 2 Piruvirato ossidasi acetilfosfato + 2 O 2 + O 2 In taluni casi si immobilizzano intere cellule e microrganismi. inetica enzimatica - 4 5

6 Industria alimentare Il settore dell industria alimentare è uno di quelli in cui il ruolo degli enzimi immobilizzati riveste maggiore importanza, anche perché i catalizzatori tradizionali spesso non risultano compatibili con i requisiti di sicurezza richiesti da cibi e bevande. Uno dei processi per via enzimatica condotti su scala industriale che hanno conosciuto maggiore successo è quello per la produzione di uno sciroppo ad elevato contenuto in fruttosio, mediante isomerizzazione del glucosio. Il prodotto che si ottiene ha un potere dolcificante analogo a quello dello sciroppo di glucosio e ha trovato largo impiego nel settore delle bevande, degli alimenti e dei dolci. La glucosio-isomerasi isomerasi è un enzima intracellulare abbastanza stabile anche se soggetto a diversi inibitori; la necessità di estrarlo da cellule lo rende più costoso di altri enzimi extra-cellulari. inetica enzimatica - 4 6

7 La reazione di isomerizzazione ha una costante di equilibrio che, a temperatura di 50, assume valore circa unitario e non varia sensibilmente al variare della temperatura; in questo modo, il prodotto contiene glucosio e fruttosio in rapporto 1:1. O 2 O O O glucosio isomerasi O O O O O O 2 O 2 O D-Glucosio D-Fruttosio Molti degli step richiesti prima della isomerizzazione sono legati alle necessità caratteristiche dell enzima: allo scopo di ottimizzare la stabilità del α-amilasi usata nella fase di liquefazione (condotta a circa 105 ) vengono aggiunti ioni a ++. D altra parte questi ioni inibiscono la glucosio isomerasi e devono perciò essere rimossi prima che lo sciroppo venga introdotto nel reattore di isomerizzazione. inetica enzimatica - 4 7

8 Amido greggio Saccarificazione Raffinazione Evaporazione Liquefazione Filtrazione Scambio ionico Isomerizzazione Evaporazione Raffreddamento Scambio ionico Prodotto finale inetica enzimatica - 4 8

9 Industria chimica fine La crescente richiesta di L-amminoacidi per applicazioni nell industria alimentare e farmaceutica ha suggerito di affiancare ai processi batterici la sintesi chimica, che però presenta il grande inconveniente di fornire miscele racemiche contenenti sia l amminoacido L che quello D. Una delle più interessanti applicazioni industriali della catalisi enzimatica riguarda appunto la separazione di miscele racemiche; il processo è stato messo a punto negli anni 70 ed è noto con il nome dell industria che lo ha realizzato, la Tanabe Seiyaku o. di Osaka. Va sottolineato che si tratta del primo processo commerciale con enzimi immobilizzati pubblicamente annunciato. La reazione sulla quale il processo si basa è catalizzata dall enzima amminoacilasi e segue il seguente schema: 2 O + OO R amminoacilasi R OO + R OO NOR N 2 NOR D,L-Acilammino acido L-Ammino acido D-Acilammino acido L enzima è dunque in grado di idrolizzare selettivamente il solo isomero L; la miscela di ammino acidi liberi e acilati può essere ora facilmente separata sulla base della diversa solubilità dei due composti. L acil-amminoacido D viene quindi nuovamente racemizzato per riscaldamento e riciclato all inizio del processo. inetica enzimatica - 4 9

10 Gli autori a quali si deve il brevetto, hibata e Tosa, sperimentarono diverse condizioni di immobilizzazione dell enzima: quella in uso riguarda una matrice DEAE-Sephadex Sephadex, che manifesta proprietà di elevata attività, di facile preparazione e rigenerazione e di grande stabilità. Acetil D, L ammino acido Flusso p Temp. Scambiatore olonna con enzimi Evaporatore ristallizzatore Separatore D-amino acido Racemizzazione L-amino acido inetica enzimatica

11 Applicazioni mediche Numerose malattie sono, come è noto, imputabili alla mancanza di attività di un enzima e potrebbero perciò essere curate somministrando l enzima carente, purché di provenienza umana per evitare reazioni immunitarie. Nel trattamento di alcune leucemie, viene somministrata asparaginasi microincapsulata che è in grado di decomporre la L-asparagina, sottraendo questo amminoacido alle cellule tumorali. Un principio di azione analogo è stato messo a punto per la somministrazione di insulina in pazienti diabetici. inetica enzimatica

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