Le problematiche del campionamento

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1 Workshop sulle MICOTOSSINE IZS Umbria e Marche Dalla difficoltà in campo all analisi analisi delle risultanze di laboratorio Le problematiche del campionamento Carlo Brera (carlo.brera@iss.it) Istituto Superiore di Sanità Laboratorio Nazionale di Riferimento Perugia, 10 Luglio 2009

2 Sono sostanze dotate di elevato potere cancerogeno Sono sostanze che manifestano tossicità croniche e raramente acute Sono sostanze termostabili Sono fortemente elettrostatiche Sono ubiquitariamente presenti sul territorio Presentano una tipologia di contaminazione eterogenea (a macchia di leopardo) Non presentano difficoltà da un punto di vista di determinazione analitica

3 La filiera analitica Campionamento Preparazione Del campione Analisi Quali/ quantitativa

4 CAMPIONAMENTO: PERCHE Un campionamento inadeguato vanifica il lavoro e gli sforzi degli analisti e rende dubbie le conclusioni del risultato di analisi L attuazione di opportuni piani di campionamento deve risultare prioritario da parte di tutti gli operatori del settore

5 CAMPIONAMENTO: PERCHE Il principale obiettivo di un buon campionamento è quello di raccogliere dati che consentano di generalizzare all'intera popolazione i risultati ottenuti dal campione. Questo processo di generalizzazione è detto «inferenza inferenza» campionamento popolazione campione Analisi del campione Estensione del risultato a tutta la popolazione= INFERENZA (Estratto da: ~bottarel/epi epi/campion campion/met_cam.htm)

6 Campionamento: Fonti di errore Basso numero di campioni incrementali Scarsa rappresentatività dei punti di campionamento Errata grandezza del campione globale

7 7 t DAL CAMPO AL BANCONE 1 : % 30 t 5 kg 1 kg 50 grammi

8 Errore di campionamento L errore totale è dato dalla somma di tre componenti TV = SV + SPV + AV E ormai da tempo stato dimostrato che SV è il più ampio contribuente all errore totale come risultato della estrema eterogeneità delle unità contaminate. Usando 1 kg di campione di mais a 20 µg/kg di aflatossina B1, macinando il campione di laboratorio in apposito mulinetto ed analizzando tramite ELISA, i contributi della SV, SPV ed AV sono 75.6, 15.9 e 8.5% rispettivamente. L errore di campionamento aumenta al diminuire della concentrazione di micotossina e varia da micotossina a micotossina (AFLATOSSINE caso più critico)

9 Confronto fra le variabilità associate nelle varie fasi del campionamento, sottocampionamento ed analisi, in due diversi casi di analisi di aflatossine in arachidi sgusciate. Fase analitica Varianza Contributo percentuale alla varianza totale Campionamento: 5 kg 521,4 82 Sottocampionamento: macinazione di 250 g con AMS 59,2 9,4 Analisi in TLC 50,1 7,9 totale 630,7 100 Campionamento: 20 kg 130,4 74 Sottocampionamento: macinazione di 100 g con VCM 25,5 15 Analisi HPLC 20,1 11 totale 176,0 100

10 Coefficiente di variazione associato alle fasi di campionamento, sotto-campionamento ed analisi nel caso di contaminazione da micotossine (aflatossine in noccioline- Whitaker, 2004) 100 Coefficient of variation (%) Sampling (kg 21,8) Sub sampling (g 1100) Analysis (2 aliquots) Aflatoxin concentration in the lot (p.p.b.)

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12 DIFFICOLTA DEL CAMPIONAMENTO Come? Manuale o automatico? Statico o dinamico? Che cosa? Sfuso, in container, in sacchi Quando? Dopo la raccolta (mietitrebbia), centri di stoccaggio, allo scarico del camion, prima della trasformazione, al dettaglio? Costi (personale, tempi di stazionamento delle navi, costo delle materia prima)

13 Campionamento dinamico In base allo schema descritto dal Regolamento si dovranno prelevare campioni incrementali (CI) che saranno successivamente riuniti a formare un unico campione globale da destinare all analisi. Il numero di campioni incrementali dipenderà dalle dimensioni del lotto da testare e saranno prelevati ad intervalli regolari di tempo secondo la formula Durata dello scarico (in minuti) /N. di CI Secondo la formula citata, per un lotto di 40 q, si dovranno prelevare (ad es. per i cereali) minimo 40 campioni incrementali di 100 grammi ciascuno secondo frequenze di tempo costanti. Se ad es. la velocità di scarico fosse di 50 q all ora, la durata dello scarico di 40q sarebbe di 48 minuti e si dovrebbe prelevare ciascuno dei 40 CI ogni 1,2 minuti (72s). I campioni incrementali saranno riuniti a formare un campione globale di 4 kg. Il campione globale sarà omogeneizzato e macinato prima di effettuare l analisi.

14 CAMPIONAMENTO: dove Stive di nave (materiale sfuso o in sacchi) Camion Container Vagoni ferroviari Autotreni Silos Cisterne Impianti di lavorazione Depositi, magazzini Aziende agricole/zootecniche Dettaglio (pacchetti)

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26 Campionamento Procedure conformi al Regolamento CE/401/2006 Da evitare il controllo nei silos Da preferire quello sui camion in condizioni dinamiche piuttosto che statiche Campionatori automatici PER OTTENERE INFORMAZIONI ATTENDIBILI SI DEVE INVESTIRE SUL CAMPIONAMENTO

27 Prodotti alimentari REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006 DELLA COMMISSIONE del 23 febbraio 2006 relativo ai metodi di campionamento e di analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari L 70/12 - Gazzetta ufficiale dell Unione europea

28 REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006 Metodi di campionamento: campo di applicazione Cereali e prodotti derivati (AFs, OTA, FT) Frutta secca ed i prodotti derivati (AFs), uva passa e similari (OTA) Fichi secchi, Arachidi, Frutta a guscio (AFs) Spezie (AFs) Latte e prodotti lattiero-caseari, alimenti per lattanti e di proseguimento, compresi il latte (AFM 1 ) Caffè tostato e prodotti a base di caffè (OTA) Succhi di frutta (PAT), compresi i succhi d uva (OTA) e il sidro (PAT) Vino (OTA), e mosti d uva (OTA) Prodotti solidi a base di mela, succo di mela, prodotti solidi a base di mela destinati ai lattanti ed alla prima infanzia (PAT) Alimenti per bambini, ed alimenti trasformati a base di cereali destinati ai lattanti ed alla prima infanzia (AFs, OTA, FT, PAT)

29 REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006 Anche per i cereali la grandezza del campione elementare (CE) è di 100 grammi e quella del campione globale di 10 kg Il controllo è diversificato a seconda della micotossina da ricercare Viene introdotto il requisito relativo alla espressione della incertezza e dei fattori di recupero Viene rivoluzionato il concetto dell accettabilità di una partita

30 REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006 La procedura pertanto. individua nel laboratorio il luogo dove formare le aliquote ufficiali alla presenza dell Autorità preposta al prelievo e del delegato della Azienda prevede la stesura di due verbali, uno redatto all atto del prelievo dei campioni elementari ed un secondo all atto della formazione delle aliquote

31 Deve essere compilato un verbale di campionamento scritto in maniera chiara e riportante il numero del lotto del campione, la procedura di campionamento seguita, il riferimento normativo seguito, Concordare con il laboratorio il giorno della preparazione del campione per formare le aliquote Convocare la ditta Assistere alla formazione delle aliquote (omogeneizzazione, macinazione) Compilare in LAB un SECONDO verbale di campionamento recante le informazioni sulle ALIQUOTE formate, il riferimento al primo verbale di campionamento del CG

32 REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006 Prelevamento al dettaglio Se il peso dei CE è superiore a 100 g o 300 g, il peso del CG sarà superiore a 10 kg o 30 kg. Se il peso di un CE è molto superiore ai 100g o 300g si apre la confezione e si prelevano 100 g o 300 g. Nel caso di CE da 500 g o 1 kg si preleva un numero inferiore di CE purché il peso del CG sia quello previsto Se il peso del CE è inferiore a 100 g o 300 g e la differenza non è significativa una confezione può essere considerata come un CE Se il peso del CE è di molto inferiore a 100 g o 300 g un CE sarà formato da più confezioni aventi peso complessivo di 100 g o 300 g

33 CFZ Dettaglio - Modus operandi a) 1 kg = 1 CE = 4 aliquote b) = 1 campione elementare g

34 Come formare l aliquota 1. Campioni elementari (CI) 2. Aprire e mescolare i CI 3. Aliquote

35 Regolamento CE/401/2006

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37 B.3. Metodo di campionamento per i cereali e i prodotti derivati (partite 50 tonnellate) Nei casi in cui non è possibile applicare le modalità di prelievo qui descritte senza causare effetti commerciali inaccettabili dovuti al danneggiamento della partita (ad esempio a causa delle forme d imballaggio o dei mezzi di trasporto), si può ricorrere a un metodo alternativo, a condizione che il campionamento sia il più rappresentativo possibile e che il metodo applicato sia chiaramente descritto e debitamente documentato. Si può ricorrere a un metodo alternativo di campionamento anche nei casi in cui risulta praticamente impossibile applicare il metodo summenzionato. Ciò si verifica ad esempio quando grandi partite di cereali sono conservate in magazzini o quando i cereali sono immagazzinati in sili.

38 Campionamento Mangimi DM 20 aprile 1978 GU N. 165 del Modalità di prelevamento dei campioni per il controllo ufficiale degli alimenti

39 REGOLAMENTO (CE) N. 152/2009 DELLA COMMISSIONE del 27 gennaio 2009 Che fissa i metodi di campionamento e di analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali L 54/1 - Gazzetta ufficiale dell Unione europea

40 Laboratorio Nazionale di Riferimento per le micotossine negli alimenti e mangimi (I.S.S.) LINEE GUIDA PER IL CAMPIONAMENTO DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI - APPLICAZIONE DEL REGOLAMENTO (CE) 152/2009

41 Cosa c è di nuovo L espressione del risultato corretto per il recupero e con la indicazione della incertezza estesa Introduzione del criterio di accettazione identico a quello del Regolamento 401/2006

42 3. DEFINIZIONI Partita da campionare: quantità di prodotto costituente un'unità e avente caratteristiche presunte uniformi. Sottopartita: porzione di una grande partita designata per essere sottoposta a campionamento; ciascuna sottopartita deve essere fisicamente separata e identificabile; Campione elementare: quantità prelevata da un punto della partita campionata. Il peso del campione elementare deve essere correlato al numero dei campioni elementari fomanti il campione globale, in modo tale da ottenere un campione globale non inferiore ai 4 kg (tranne il caso dei formellati o mattonelle con peso unitario inferiore ad 1 kg); Campione globale: insieme di campioni elementari prelevati da una stessa partita campionata. Nel caso di prodotti in confezione è necessario aprire le singole confezioni e riunire tutti i campioni elementari formanti il campione globale; Campione ridotto: parte rappresentativa del campione globale, ottenuta mediante riduzione di quest'ultimo. Per le sostanze o i prodotti ripartiti in modo non uniforme è necessario ottenere il campione ridotto PREVIA MACINAZIONE DEL CAMPIONE GLOBALE Campione finale: parte del campione ridotto o del campione globale macinato e/o omogeneizzato.

43 4.2.1 MICOTOSSINE Campionamento per le micotossine di partite di t > 100 Sempreché le sottopartite possano essere separate fisicamente, ciascuna partita deve essere suddivisa in sottopartite conformemente alla tabella c) dell Allegato II. Se la partita non è o non può essere suddivisa fisicamente in sottopartite, da essa si preleva un minimo di campioni pari a 40 + numero di tonnellate costituenti la partita da campionare Ciascuna sottopartita deve essere oggetto di campionamento separato. In funzione delle risorse disponibili si può scegliere di campionare una sola delle sottopartite.

44 Accettazione di una partita o sottopartita per l analisi delle micotossine nei mangimi accettazione se il campione finale o la media dei campioni finali non supera il limite massimo, tenendo conto dell incertezza della misura e della correzione per recupero rifiuto se il campione finale o la media dei campioni finali supera il limite massimo oltre ogni ragionevole dubbio, tenendo conto dell incertezza della misura e della correzione per il recupero Il risultato delle analisi per l aflatossina B 1 e l ocratossina A, deve sempre corretto per il recupero.

45 CAMPIONE ELEMENTARE (CE) Numero minimo di campioni elementari CAMPIONE GLOBALE (CG) E costituito dalla somma dei (CE) Ogni CG deve essere di almeno 4kg Quando sono richiesti più CG le operazioni vanno ripetute per ogni CG CAMPIONE FINALE (CF) I campioni finali si ottengono dopo riduzione dal CG E prevista la formazione di almeno 4 CF per ciascun CG E richiesta l'analisi di almeno un CF per ogni CG Il peso del CF finale destinato all'analisi non deve essere inferiore a ALIMENTI ALLA RINFUSA <2,5 tonnellate 7 campioni elementari per ogni campione globale <1 tonnellata 1 Campione Globale 4 Campioni Finali 1-2,5 tonnellate 2 Campioni Globali (raccogliere 14 CE, ogni CG sarà formato da 7 CE) 4 Campioni Finali per ogni campione globale 8 Campioni Finali 2,5-100 tonnellate di 20 volte il numero di tonnellate costituenti la partita da campionare (nel caso arrotondare al numero intero superiore), con un massimo di 40 CE 2,5-10 tonnellate tonnellate 2 Campioni Globali 4 Campioni Finali per ogni campione globale 8 Campioni Finali 3 Campioni Globali 4 Campioni Finali per ogni campione globale 12 Campioni Finali >40 tonnellate 4 Campioni Globali 4 Campioni Finali per ogni campione globale 16 Campioni Finali

46 CAMPIONE ELEMENTARE (CE) Numero minimo di campioni elementari CAMPIONE GLOBALE (CG) E costituito dalla somma delle confezioni aperte e ben omogeneizzate Ogni CG deve essere di almeno CAMPIONE FINALE (CF) I campioni finali si ottengono dopo riduzione dal CG E prevista la formazione di almeno 4 CF per ciascun CG E richiesta l'analisi di almeno un CF per ogni CG Il peso del CF finale destinato all'analisi non deve essere inferiore a ALIMENTI IN CONFEZIONE Partite da 1-4 confezioni Partite da 5-16 confezioni Partite da oltre 16 confezioni Tutte le confezioni 4 del numero di confezioni costituenti la partita da campionare con un massimo di 40 confezioni 1-16 confezioni confezioni confezioni >800 confezioni 1 Campione Globale 4 Campioni Finali 2 Campioni Globali 4 Campioni Finali per ogni campione globale (almeno 8 Campioni Finali) 3 Campioni Globali 4 Campioni Finali per ogni campione globale (almeno 12 Campioni Finali) 4 Campioni Globali 4 Campioni Finali per ogni campione globale (almeno 16 Campioni Finali)

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48 ALIMENTI ALLA RINFUSA Es: partita da campionare del PESO di 2 tonnellate CAMPIONI ELEMENTARI (CE) Prelevare N. 14 CE di 600 g, circa, ciascuno CAMPIONE GLOBALE (CG) Costituito dalla somma dei campioni elementari ( somma c.e.) Ciascun CG deve avere un peso non inferiore a 4 Kg CG 1 CG CAMPIONE FINALE (CF) Costituito dalla riduzione di ciascuno dei 2 campioni globali Peso del campione finale destinato all analisi non inferiore a 500 g E prevista la formazione di CF per ciascun CG: 1 campione di I istanza, 1 campione di revisione di analisi, aliquote di legge) CF 1 CF 1 CF 1 CF 1 CF 1 CF 2 CF 2 CF 2 CF 2 CF 2 CF prima istanza CF revisione CF Autorità giudiziaria CF Importatore/ Produttore CF Allevatore CF prima istanza CF revisione CF Autorità giudiziaria CF Importatore/ Produttore DIPARTIMENTO DI SANITA PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE CF Allevatore

49 ALIMENTI ALLA RINFUSA - PESO di 150 tonnellate La partita sarà suddivisa in 3 sottopartite da 50 t ciascuna Per ciascuna delle 3 sottopartite 1 40 Ciascuna sottopartita deve essere oggetto di campionamento separato. In funzione delle risorse disponibili si può scegliere di campionare una sola delle sottopartite CAMPIONI ELEMENTARI (CE) Da ogni sottopartita: prelevare N. 40 CE di MINIMO 400 g ciascuno CAMPIONE GLOBALE (CG) Per ogni sottopartita: sono richiesti 4 CG (ciascuno avente peso non inferiore a 4 Kg), costituiti dalla somma dei campioni elementari CG 1 CG CAMPIONE FINALE (CF) Costituito dalla riduzione di ciascuno dei 4 campioni globali Peso del campione finale destinato all analisi non inferiore a 500 g E prevista la formazione di 4 CF per ciascun CG: 1 campione di I istanza, 1 campione di revisione di analisi, aliquote di legge) CF 2 CF CF 3 1 CF 1 CF 1 CF 1 CF 1 CF 4 CF 4 CF 4 CF 4 CF 4 CF prima istanza CF CF CF CF CF CF CF CF Autorità Importatore/ prima Autorità Importatore/ revisione Allevatore revisione giudiziaria Produttore istanza giudiziaria Produttore DIPARTIMENTO DI SANITA PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE CF Allevatore

50 Per ottenere l aliquota l macinata (50 grammi) Campione globale (1 kg) A. Prendere 50 g dal campione globale omogeneizzato B. Macinare il campione globale e poi prendere 50 g

51 Perché? 50 grammi di mais corrispondono a circa chicchi Posto che le aliquote provengono da un campionamento correttamente effettuato Applicando una corretta procedura di omogeneizzazione e macinazione del CG, l aliquota di campione di 50 grammi di chicchi conterrà un eguale numero di frammenti rappresentativi di tutti i chicchi del campione globale Viceversa in 50 grammi di campione, prelevato dal CG non macinato (maniera non corretta), sarà contenuto un numero di frammenti rappresentativi di non più di chicchi dell intero CG che statisticamente non configura una condizione di rappresentatività

52 Tipico schema di campionamento per le micotossine Identificazione della partita o della sottopartita Valutazione della grandezza della partita o sottopartita Calcolo dei campioni incrementali da prelevare Valutazione del tipo di campionamento da effettuare (statico vs dinamico) Prelievo dei campioni incrementali Formazione del campione globale combinando tutti I campioni incrementali Omogeneizzazione del campione globale Macinazione del campione globale Formazione delle aliquote (a secco o tramite formazione dello slurry)

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54 Preparazione del campione Macinazione del campione globale fino a granulometria fine Omogeneizzazione del campione macinato a secco o con acqua Prelievo in modo rappresentativo di un aliquota da destinare all analisi

55 Fonti di errore Differente granulometria dei campioni macinati (macinazione a secco) Errato grado di frantumazione (macinazione a secco) Errato rapporto acqua/matrice (slurry) Cross-contamination tra campioni sequenziali

56 Obiettivo della Preparazione del campione Secondo il principio di inferenza una aliquota da saggio DEVE mantenere tutte le informazioni contenute nel campione aggregato. Solo in questo caso l aliquota da saggio può essere considerata RAPPRESENTATIVA del lotto

57 Pertanto Pertanto. Una non corretta preparazione del campione (scarsa RAPPRESENTATIVITA ) può inficiare significativamente la attendibilità e la attendibilità dei risultati

58 Preparazione del campione Due opzioni: a secco o tramite slurry? Disponibilità di strumentazione (omogeneizzatori industriali, molinetti lab-scale, setacci) Tempo necessarioa alla frantumazione dei campioni Valutazione della ripetibilità e riproducibilità Grandezza del campione da sottoporre all analisi (sample intake) Composizione della matrice

59 Come ridurre la varianza Aumentando la grandezza del campione Aumentando il grado di macinazione con un conseguente aumento del numero di particelle per unità di massa Omogeneizzando (formazione dello slurry) Aumentando la grandezza della aliquota Aumentando il numero delle aliquote (aumento della ripetibilità)

60 Formazione dello slurry Allo scopo di aumentare l omogeneità della concentrazione delle micotossine presente nel campione globale, si ricorre alla formazione di uno slurried sample,ottenuto utilizzando un omogeneizzatore industriale Lo slurry é formato aggiungendo acqua di rubinetto al campione non macinato generalmente con un rapporto che varia da 1:1 (farine, chicchi di mais, mangimi, frutta secca senza guscio) a 1:2 (frutta secca con guscio)

61 Macinazione con acqua (slurry)

62 Casi particolari Pistacchio è consigliabile congelare il campione prima di sottoporlo a macinazione a secco Fichi secchi è necessario usare un tritacarne per evitare la formazione di grumi (clogging)

63 Lo scenario ideale per il miglior campionamento finalizzato all analisi delle micotossine dovrebbe essere predisposto secondo i seguenti criteri: campionare la matrice non trasformata campionare possibilmente nella fase del raccolto campionare in modo dinamico prelievi di campioni elementari in automatico predisporre la raccolta di un elevato numero di campioni elementari calcolato in funzione della grandezza del lotto/partita prevedere la macinazione del sottocampione con molini che garantiscano un particolato fine (20 mesh o 0,5 mm) effettuare l omogeneizzazione per mezzo della formazione dello slurry Ogni standardizzazione di procedura di campionamento dovrebbe essere guidata al fine di ridurre la variabilità tenendo conto delle le esigenze in termini di costi e fattibilità. Poichè ogni fase ha costi diversi, è importante valutare quanto pesa ogni fase per ottimizzare gli sforzi e le risorse e produrre buoni piani di campionamento.

64 Conclusioni Al dettaglio sarebbe strategico non campionare i singoli negozianti ma centri all ingrosso, supermercati, centri di distribuzione, aziende, ecc. Campionare anche i soli ingredienti Controllare secondo una valutazione del rischio Controllare secondo un criterio di rappresentatività (Circolare n. 10 del giugno 1999?????)

65 3 Congresso Nazionale Le micotossine nella filiera agroalimentare e zootecnica Istituto Superiore di Sanità settembre 2009

66 Carlo Brera Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Reparto OGM e Micotossine Tel Fax : carlo.brera@iss.it

67 Cosa scaturisce dalla normativa? I limiti per le Fusariotossine si applicano ai cereali non trasformati commercializzati per la prima trasformazione (la decorticazione è considerata parte della prima trasformazione) Disponibilità di metodi multi-micotossina Disponibilità di metodi rapidi /o di screening Identificazione del punto di campionamento per il controllo (autocontrollo ed ufficiale) Conoscenza dell effetto del processo tecnologico Conoscenza della correlazione origine qualità sanitaria

68 Cosa scaturisce dalla normativa? (II) Non essendo possibile la miscelazione di lotti non conformi con lotti conformi, è necessario un controllo di lotti con frequenza costante Conoscenza degli effetti di trattamento fisico sul cereale per definire in modo più accurato il livello soglia aziendale Necessità di prevedere la possibile correlazione tra cambiamenti climatici e contaminazione

69 Nuovo criterio di conformità