BIO-FLASH VEDI CAMBI RISALTATI
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- Emilio Marchi
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1 BIO-FLASH anti-hcv test BIO-FLASH anti-hcv è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la determinazione qualititativa degli anticorpi IgG contro il virus dell'epatite C (HCV) nel siero e nel plasma umano con lo strumento BIO-FLASH. Introduzione L epatite C è un infezione virale del fegato che era stata correlata alla trasmissione parenterale della epatite non A, non B, fino all identificazione dell agente causale nel La scoperta e la caratterizzazione del virus dell epatite C (HCV) ha condotto alla comprensione del suo ruolo primario nell epatite post-trasfusionale e la tendenza a indurre un infezione persistente. 1 Il virus dell epatite C (HCV) è un virus a RNA incapsulato, a filamento singolo, a senso positivo. Il virus infetta le cellule epatiche e può causare una grave infiammazione del fegato con complicazioni croniche. 2 L insorgenza della malattia è generalmente insidiosa, con anoressia, un vago disagio addominale, nausea e vomito, febbre e fatica, fino all ittero in circa il 25% di pazienti. Tra quelli esposti all HCV, circa il 40% guarisce completamente, mentre i restanti (sia che abbiano sintomi o meno) diventano portatori cronici. Il 20% di questi sviluppa la cirrosi. Tra quelli affetti da cirrosi, una percentuale che può arrivare fino al 20% svilupperà un tumore del fegato. 3,4 L HCV è la principale causa di epatite acuta e di malattie epatiche croniche, tra cui la cirrosi e il tumore del fegato. Si stima che a livello globale 170 milioni di persone siano infette dall HCV e che 3-4 milioni di persone siano infettate ex novo ogni anno. L HCV si diffonde principalmente tramite il contatto diretto con il sangue umano. Le cause maggiori di infezione da HCV in tutto il mondo sono rappresentate dall uso di sangue non selezionato per le trasfusioni e il riutilizzo di aghi e siringhe non adeguatamente sterilizzati. 5 La presenza di anticorpi anti-hcv non può essere confermata fino a settimane dopo l esposizione e questo crea un periodo finestra di sieronegatività e potenziale infettività. 6 Principio Quando le microparticelle paramagnetiche del BIO-FLASH anti-hcv si mescolano e si incubano con il campione, se esso presenta anticorpi specifici anti-hcv, questi ultimi si combinano con gli antigeni del HCV che ricoprono le microparticelle. Dopo una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo, si aggiunge un tracciatore consistente in un anticorpo monoclonale anti-igg umana marcato con isoluminolo, che si unisce agli anticorpi IgG anti-hcv catturati dalle microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL), che sono direttamente proporzionali alla concentrazione di IgG anti-hcv del campione. Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC) per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori. Schema della reazione: VEDI CAMBI RISALTATI Attivatori (Triggers) URL Particella magnetica Campione Tracciatore Emissione di luce
2 Componenti Cartuccia reagenti Il kit BIO-FLASH anti-hcv contiene una cartuccia reagenti per 100 determinazioni (REF ). Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE ) Composizione della cartuccia reagenti: La cartuccia è composta da 4 contenitori, così composti: A. 1 contenitore cilindrico per la sospensione di microparticelle ricoperte con HCV ricombinante che rappresentano epitopi di HCV: Core, NS3, NS4 e NS5. B. 1 contenitore del tampone del test. Contiene < 0,1% di sodio azide e 1,0% di Triton X-100. C. 1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in un anticorpo monoclonale di topo anti-igg umana marcato con isoluminolo. Contiene < 0,1% di sodio azide e 8,0% di etilenglicole. D. 1 contenitore con diluente dei campioni. Contiene < 0,1% di sodio azide. Preparazione Si veda la seguente figura. Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare affinché si risospendano. La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate). Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità. Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto. Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore (parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la cartuccia aperta. Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento. Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.
3 Precauzioni I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO. Uso esclusivo per utilizzatori professionali. Il tampone del test contiene < 0,1% di sodio azide e 1,0% di Triton X-100. Nocivo in caso di ingestione (R22). Rivolgersi ad un medico in caso di ingestione (S46). Il tracciatore contiene < 0,1% di sodio azide e 8% di etilenglicole. Nocivo in caso di ingestione (R22). In case of ingestion, obtain medical attention (S46). La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua. ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO. Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante. Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori. Raccolta e conservazione dei campioni Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA, Li-eparina, Na-eparina, citrato e ACD). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni. Siero I campioni di siero possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Plasma I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. Scongelare il plasma a 37 C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Volume di campione Il volume di campione necessario per condurre un unica prova con BIO-FLASH anti-hcv varia in base al tipo di recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF ), per un test saranno necessari almeno 26 µl più il volume morto, equivalente a 200 µl. Altri materiali I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente. REF REF BIO-FLASH anti-hcv Calibrators (Calibratori) BIO-FLASH anti-hcv Controls (Controlli) Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni. Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test BIO-FLASH anti-hcv sono incluse nei codici a barre dei contenitori. L uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti. Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità sufficiente dei seguenti consumabili: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette) Nota: Il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE ) REF REF BIO-FLASH Triggers (Attivatori) BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema) Strumento / conduzione del test Nella Guida per l Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test. Calibrazione Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL. Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l Utente del BIO-FLASH.
4 Controllo di qualità Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano due livelli di controllo. I controlli BIO-FLASH anti-hcv negativo e positivo sono stati progettati per il suddetto programma. I controlli devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Assicurarsi che i risultati dei controlli si trovino all interno del range di accettazione, perché in caso contrario si potranno avere risultati non validi e l utente dovrà adottare misure correttive. In questo caso esaminare tutti i risultati ottenuti dall ultima verifica positiva del controllo di qualità dell analita in questione. Può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al. 7 Conservazione e stabilità I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della cartuccia se conservati ad una temperatura di 2-8 C in posizione verticale. Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8 C è di 6 settimane. Interpretazione dei risultati La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del BIO-FLASH anti-hcv sono espressi in S/CO (rapporto segnale/cut-off). Si tratta di un test qualitativo, in cui il valore numerico del risultato è solamente indicativo del numero di anticorpi presenti. La determinazione delle IgM anti-hcv con il test BIO-FLASH anti-hcv è interpretato come segue: I campioni con un risultato < 0,90 S/CO si considerano non reattivi (negativi). I campioni con un risultato 0,90 e < 1,00 S/CO si considerano indeterminati (zona grigia). I campioni con un risultato 1,00 S/CO si considerano reattivi (positivi). I campioni con risultato inizialmente reattivo o indeterminato devono essere rianalizzati in duplicato. Se entrambi i valori della ripetizione sono inferiori a 0,9 l interpretazione finale del test è negativa per gli anticorpi HCV. Se uno dei risultati della ripetizione del duplicato è positivo o indeterminato il campione deve essere ulteriormente analizzato con test supplementari per avere una conferma del risultato. Un risultato ripetutamente positivo indica un infezione da HCV. Limitazioni Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un infezione primaria da HCV. Pertanto, oltre ai risultati del BIO-FLASH anti-hcv, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l anamnesi clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Un risultato negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HCV. Come in tutti i test immunologici sensibili vi è la possibilità di ottenere risultati positivi non ripetibili. Risultati attesi L incidenza dell HCV su scala globale non è ben conosciuta in quanto l infezione acuta è generalmente asintomatica. 5 Le persone cronicamente infettate (e che non sanno di esserlo) potrebbero essere almeno 2-4 milioni negli Stati Uniti, 5-10 milioni in Europa e circa 12 milioni in India. Ogni anno si verificano nuovi casi negli USA e in Europa occidentale, e circa in Giappone. Di questi circa il 25% sono sintomatici, e il 60-80% può progredire ad una patologia epatica cronica, mentre il 20% sviluppa la cirrosi. Alla fine circa il 5-7% dei pazienti può morire a causa delle conseguenze dell infezione. 1,2 La maggior parte dei paesi europei riporta una prevalenza dell HCV tra lo 0,5% e il 2% nella popolazione generale. 1 L OMS stima che circa il 3% della popolazione mondiale sia stata infettata dall HCV e che esistano oltre 170 milioni di portatori cronici a rischio per lo sviluppo di cirrosi epatica e/o tumore del fegato. 3 Tasso molto elevati di reattività anticorpale HCV (>70%) sono stati osservati nei tossicodipendenti e negli emofiliaci. Nei pazienti sottoposti ad emodialisi è stata osservata una prevalenza intermedia tra il 20 e il 30%. 1 L incidenza è in calo, dato che la trasmissione tramite emoderivati è stata praticamente ridotta a zero e nel settore sanitario si ricorre a precauzioni universali. 3 Caratteristiche funzionali NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati.
5 Specificità La valutazione della specificità si basa sul test di campioni di siero da un donatore di sangue non selezionato, inclusi coloro che donano per la prima volta, e da pazienti ospedalizzati. Stato sottoposto a test un totale di 5022 campioni non selezionati provenienti da due banche del sangue, 3509 dalla Banc de Sang i de Teixits de Catalunya (Spagna), e 1513 dal EFS Centre Atlantique site de Tours (Francia). Inoltre sono stati valutati 250 campioni di siero non selezionati provenienti da pazienti ricoverati nell ospedale di Santa Creu i Sant Pau (Spagna). I campioni Ripetutamente Reattivi sono stati ritestati ricorrendo ad un test supplementare. Quindi è stata calcolata la specificità, con i risultati illustrati nella seguente tabella. Campioni testati Inizialmente reattivi (IR) Ripetutamente reattivi (RR) RR risultanti indeterminati RR risultanti positivi Specificità n n n n n % Donatori di sangue ,7 Pazienti ospedalizzati Sensibilità La sensibilitè à stata valutata testando i campioni con positività anti-hcv verificata. successivamente è stata calcolata la sensibilità per ogni gruppo di campioni, con i risultati illustrati nella seguente tabella: Campioni testati Reattivi Sensibilità n n % Non genotipizzati giorno dopo il campionamento genotipo genotipo genotipo genotipo 4 (non-c, non-d) genotipo 4c/4d genotipo genotipo Totale campioni genotipizzati Sensibilità alla sieroconversione Sono stati eseguiti ulteriori studi di sensibilità testando i campioni di 30 pannelli commerciali di sieroconversione HCV. I risultati sono stati comparati ai metodi commerciali autorizzati. In nove (9) pannelli è stata osservata una reattività precoce, in venti (20) pannelli è stata osservata una reattività equivalente, e solo in un (1) pannello di sieroconversione il BIO-FLASH anti-hcv ha evidenziato una reattività ritardata. Precisione Si valutò in conformità alle direttive CLSI EP05-A2, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Media (S/CO) % CV Intra-test % CV Totale Controllo negativo 0,26 7,1 12,3 Controllo positivo 3,16 4,3 9,2 Intorno al valore di cut-off 0,94 4,6 8,1 Riproducibilità Si valutò la riproducibilità tra duplicati, tra lotti e tra strumenti è stata valutata utilizzando 50 campioni. I risultati si mostrano nella seguente tabella:
6 N Co-negatività Co-positività Duplicato 2 vs. Duplicato % 100% Lotto 2 vs. Lotto % 100% Strumento 2 vs. Strumento % 100% Interferenze Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non alterano i risultati del BIO-FLASH anti-hcv: Sostanza potenzialmente interferente Concentrazione % Interferenza Emoglobina 500 mg/dl 10 Bilirubina indiretta 18 mg/dl 10 Bilirubina diretta 18 mg/dl 10 Trigliceridi 1300 mg/dl 10 Fattore reumatoide 800 UI/mL 10 HAMA 1 µg/ml 10 Reattività crociata 134 campioni positivi per una serie di cross-reagenti e campioni di donne in stato interessante sono stati analizzati con BIO-FLASH anti-hcv. Si suppone che un potenziale cross-reagente provochi una reattività crociata quando la diagnosi passa da negativa a positiva o viceversa. I campioni reattivi sono stati comparati ad un test di riferimento per il quale non è stata dimostrata alcuna reazione crociata con la sostanza potenzialmente interferente. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Reattività crociata potenziale Concordanza anti-toxoplasma 6/6 anti-cmv (anticorpi contro il virus citomegalovirus) 6/6 anti-rubella 6/6 anti-hdv IgG (anticorpi contro il virus dell'epatite D) 8/8 IgG elevate 4/4 Mononucleosis 5/5 RF (fattore reumatoide) 5/5 ANA (anticorpi antinucleari) 5/5 anti-hbs 6/6 anti-hbc 5/5 anti-vzv (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster) 5/5 RPR (Rapid Plasma Reagin) 5/5 Donne in gravidanza 7/7 Donne in gravidanza (incluse multipare) 5/5 anti-ebv (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr) 4/4 IgM elevate 6/6 anti-hev (anticorpi contro il virus dell'epatite E) 5/5 HBsAg 6/6 HAV-IgG (anticorpi contro il virus dell'epatite A) 6/6 HAV-IgM (anticorpi contro il virus dell'epatite A) 5/5 anti-hiv (anticorpi contro il virus dell immunodeficienza umana) 3/3 anti-hsv 1 (anticorpi contro il virus Herpes simplex di tipo 1) 6/6 anti-e. coli 15/15 Limite di rilevamento In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di rilevamento (LR) si situa a 0,08 S/CO.
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