TGS TA HSV 1/2 IgM REF YB TGS TA HSV 1/2 IgM

Transcript

1 REF YB TGS TA HSV 1/2 IgM ISTRUZIONI PER L USO 100 FINALITA D USO Il test TGS TA HSV 1/2 IgM è un test immunologico chemiluminescente (CLIA) per la determinazione quantitativa, con strumentazione dedicata TGS TA Analyser, degli anticorpi specifici di classe IgM diretti contro antigeni degli Herpes Virus di tipo 1 e 2 (HSV 1/2) in campioni di siero o plasma umano (EDTA, Sodio Citrato). Questo dosaggio viene impiegato come ausilio diagnostico nella valutazione della infezioni da Herpes Virus di tipo 1 e 2. ATTENZIONE: Qualunque decisione medica non può essere basata sul risultato di questo solo test, ma va fondata sulla valutazione dell insieme di tutti i dati clinici e di laboratorio disponibili. SIGNIFICATO CLINICO I virus Herpes Simplex di tipo 1 e 2 (HSV 1, HSV 2) appartengono alla famiglia delle Herpesviridae, alla sottofamiglia degli Alphaherpesvirus ed entrambi sono patogeni per l uomo. Sono virus di grosse dimensioni ( nm) con DNA lineare a doppia elica. La loro distribuzione è ubiquitaria e la trasmissione interumana è diretta da individuo infetto ad individuo suscettibile. Circa un terzo della popolazione è ospite del virus in forma latente ed è fonte di diffusione nei periodi di attivazione produttiva del virus. Le infezioni da HSV sono classificate come primarie e ricorrenti e sono altamente prevalenti nella popolazione 1. L HSV 1 è di solito associato alle infezioni nell area orofaringea e negli occhi mentre l HSV 2 è causa della maggior parte delle infezioni genitali e neonatali 2,3. La specificità tessutale non è tuttavia assoluta. L HSV 2 può essere isolato, seppur occasionalmente, dall area orofaringea e circa il % delle infezioni genitali primarie possono essere causate da HSV 1 4,5. L infezione primaria da HSV 1 si verifica generalmente durante l infanzia (entro i primi 5 anni di vita) 6, quando gli individui suscettibili vengono a contatto ravvicinato, come attraverso il bacio, con soggetti (genitori, parenti, etc.) che eliminano il virus. Con la stessa modalità viene generalmente contratta l infezione dagli adolescenti che sono sfuggiti alla stessa durante l infanzia. L infezione primaria da HSV 2 si verifica prevalentemente attraverso i rapporti sessuali ed il momento del contagio è spostato generalmente fino all inizio dell attività sessuale, cioè all adolescenza ed alla giovane età adulta. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 1 di 13

2 La diagnosi di laboratorio delle infezioni da HSV 1 e da HSV 2 ha cominciato a diventare una parte sempre più rilevante del trattamento del paziente dal momento in cui si sono rese disponibili possibilità terapeutiche sempre più efficaci (Acyclovir, Valaciclovar, e Farmiciclovir) (WHO Meeting, 1991). Tra le tecniche diagnostiche, oltre all isolamento del virus tramite PCR, che consente sia il rilevamento quantitativo genomico che la classificazione del genotipo, ed al test IFA, il dosaggio sierologico può essere utile per la diagnosi di infezioni HSV primarie e per la determinazione dell evidenza di precedenti infezioni. La diagnosi dell infezione primaria si basa sulla rilevazione degli anticorpi specifici di classe IgM oltre che alla dimostrazione della sieroconversione o di un significativo aumento della concentrazione tra sieri acuti e convalescenti 7. Il dosaggio sierologico risulta meno utile per la diagnosi di infezione ricorrente da HSV, poiché questa infezione spesso non si riflette in una modifica dei livelli anticorpali 7. Molti dei test sierologici presenti sul mercato utilizzano, come antigeni, lisati virali purificati. Poiché la crossreazione tra i due sierotipi HSV è altamente significativa, l utilizzo dei lisati virali non consente di differenziare correttamente tra HSV 1 e HSV 2 8. Poiché la maggior parte degli individui adulti sono stati infettati con HSV 1, spesso, in assenza di sintomi clinici, lo stato immunitario anti-hsv 2 risulta difficile da valutare. L utilizzo di glicoproteine ricombinanti di membrana specifiche per il tipo di virus rende possibile distinguere con esattezza lo stato immunologico del paziente. Le glicoproteine ricombinanti specifiche sono la gg1 per il virus di tipo 1 e la gg2 per il virus di tipo 2. Esse sono utilizzate sia per monitorare l infezione primaria, con rilevazione delle IgM specifiche, che lo stato immunologico del paziente, con rilevazione delle IgG specifiche 9. PRINCIPIO DEL METODO Il kit TGS TA HSV 1/2 IgM per la determinazione quantitativa delle IgM specifiche anti-herpes Virus 1 e 2 utilizza un metodo immunologico indiretto a due step basato sul principio della chemiluminescenza. Due antigeni specifici sono utilizzati per rivestire le particelle magnetiche (fase solida) ed un anticorpo anti- IgM umane è marcato con un derivato dell estere di acridinio (coniugato). I campioni sono pre-trattati con un anticorpo anti-igg per eliminare le immunoglobuline G (IgG) e il Fattore Reumatoide (RF) umani. Durante la prima incubazione gli anticorpi specifici presenti nel campione, nei calibratori o nei controlli si legano alla fase solida. Durante la seconda incubazione il coniugato reagisce con gli anticorpi anti HSV 1 e anti HSV 2 IgM sequestrati dalla fase solida. Dopo ciascuna incubazione, il materiale non legato alla fase solida è rimosso mediante aspirazione e susseguente lavaggio. La quantità di coniugato marcato rimasto legato alla fase solida viene valutata mediante attivazione della reazione di chemiluminescenza e misura del segnale luminoso. Il segnale generato, espresso in unità relative di luce (RLU, Relative Light Unit), è indicativo della concentrazione degli anticorpi specifici presenti nel campione, nei calibratori e nei controlli. AUTOMAZIONE Lo strumento TGS TA Analyser esegue in automatico tutte le operazioni previste dal protocollo di dosaggio: aggiunta nel contenitore di reazione dei campioni, calibratori, controlli, particelle magnetiche, coniugato e IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 2 di 13

3 soluzioni di attivazione della chemiluminescenza; separazione magnetica e lavaggio delle particelle; misura della luce emessa. Il sistema calcola i risultati del dosaggio per i campioni ed i controlli mediante curva di calibrazione memorizzata e stampa un rapporto che include tutte le informazioni relative al dosaggio ed al paziente. MATERIALI E REAGENTI Materiali e reagenti forniti REAG 1 MP 2.5 ml Particelle magnetiche rivestite con glicoproteine ricombinanti gg1 e gg2 in Tampone Fosfato contenente proteine stabilizzanti, tensioattivo, Pro-Clin 300 e sodio azide (< 0.1 %) come conservanti. REAG 2 CONJ 25 ml Anticorpo monoclonale di topo anti-igm umane marcato con un derivato dell estere di acridinio (coniugato), in Tampone Fosfato contenente proteine stabilizzanti e sodio azide (< 0.1 %) come conservante. REAG 3 DIL 25 ml Soluzione Diluente Campioni: Tampone Fosfato contenente sieroalbumina bovina, un tensioattivo, un colorante blu inerte, Pro-Clin 300 e Gentamicina SO 4 come conservanti. REAG 4 SORB 18 ml Siero (di pecora) specifico per eliminare le immunoglobuline G (IgG) e il Fattore Reumatoide (RF) dai campioni in Tampone Glicina e sodio azide (< 0.1 %) come conservante. REAG 5 CAL A 1.6 ml Siero umano con bassa concentrazione di anticorpi anti-herpes 1 e 2 IgM in Tampone Fosfato contenente sieroalbumina bovina, un tensioattivo, un colorante blu inerte, Pro-Clin 300 e Gentamicina SO 4 come conservanti. REAG 6 CAL B 1.6 ml Siero umano con elevata concentrazione di anticorpi anti- Herpes 1 e 2 IgM in Tampone Fosfato contenente sieroalbumina bovina, un tensioattivo, un colorante blu inerte, Pro-Clin 300 e Gentamicina SO 4 come conservanti. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 3 di 13

4 Tutti i reagenti sono pronti per l uso. I reagenti 1, 2, 3 e 4 sono assemblati in un unico insieme che costituisce la cartuccia reagenti. Le concentrazioni dei Calibratori sono espresse in UA/mL (Unità Arbitrarie) e tarate contro uno standard di riferimento interno. I valori delle concentrazioni, specifici per lotto di prodotto, sono registrati nel DATA DISK inserito nel kit. DATA DISK Mini-CD contenente le informazioni riguardanti tutti i prodotti della Linea TGS TA (Reagenti, Calibratori, Sieri di controllo) aggiornati all ultimo lotto produttivo con l esclusione dei prodotti scaduti alla data di compilazione del nuovo DATA DISK. E sufficiente conservare il DATA DISK con il numero di lotto più elevato per mantenere aggiornate le informazioni richieste per il corretto funzionamento del sistema. Materiali e reagenti richiesti ma non forniti nel kit - TGS TA Analyzer 120 Cod. No. TGS IDS-iSYS Cuvette Cube * Cod. No. IS-CC1000 Confezione da 960 cuvette. - IDS-iSYS System Liquid * Cod. No. IS-CS bottiglia da 5 litri di soluzione, pronta per l uso. - IDS-iSYS Wash Solution * Cod. No. IS-CW bottiglia da 10 litri di soluzione, pronta per l uso. - IDS-iSYS Trigger Set * Cod. No. IS-CT flacone da 250 ml di Trigger A (soluzione di preattivazione) 1 flacone da 250 ml di Trigger B (soluzione di attivazione) - TGS TA D-SORB Solution Cod. No. YC Confezione da 2 bottiglie da 1 litro di soluzione pronta per l uso. - IDS-iSYS Cartridge Checking System * Cod. No. IS TGS TA ImmunoCleaner Cod. No. YC flaconi da 27 ml ciascuno. - TGS TA Top Cap Set Cod. No. YC tappi superiori per la chiusura dei contenitori dei calibratori dopo il primo utilizzo. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 4 di 13

5 (*) Lo strumento TGS TA Analyzer e gli accessori identificati dall asterisco sono fabbricati da Immunodiagnostic Systems S.A., Rue E. Solvay, 101, B-4000 Liège, Belgium e distribuiti da Technogenetics Srl. Altri Reagenti Raccomandati TGS TA HSV 1/2 IgM CONTROL SET Cod. No. YB fiale da 1.5 ml di siero umano negativo e 3 fiale da 1.5 ml di siero umano positivo per anticorpi IgM anti- HSV 1/2. AVVERTENZE E PRECAUZIONI I reagenti forniti nel kit TGS TA HSV 1/2 IgM sono solo per uso diagnostico in vitro e non per uso in vivo in uomini o animali. Questo prodotto deve essere utilizzato in stretta osservanza alle istruzioni riportate nel presente documento da utilizzatori professionali. Technogenetics non può essere ritenuta responsabile di perdite o danni generati da un uso non conforme alle istruzioni fornite. Precauzioni di sicurezza Questo prodotto contiene materiale di origine animale e pertanto deve essere manipolato come se contenesse agenti infettanti. Questo prodotto contiene componenti di origine umana. Tutte le unità di siero o plasma utilizzate per la fabbricazione dei reagenti di questo kit sono state analizzate con metodi FDA approvati e trovate non reattive per la presenza di HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 ed anti-hiv2. Tuttavia, poiché nessun metodo di analisi è in grado di garantire l assenza di agenti patogeni, tutto il materiale di origine umana deve essere considerato potenzialmente infetto e manipolato come tale. In caso di imballaggio danneggiato con fuoriuscita dei reagenti provvedere alla decontaminazione dell area interessata con una soluzione diluita di Ipoclorito di Sodio dopo essersi protetti con idonei dispositivi di protezione individuale (camice, guanti, occhiali). Provvedere allo smaltimento del materiale utilizzato per la pulizia e dei rifiuti di imballaggio coinvolti nella fuoriuscita, in base alle norme nazionali per lo smaltimento dei rifiuti potenzialmente infetti. Alcuni reagenti contengono sodio azide come conservante. Poiché la sodio azide può reagire con piombo, rame e ottone piombato formando azidi esplosive nelle tubature, si raccomanda di non eliminare reagenti o rifiuti negli scarichi ma di seguire le norme nazionali in materia di smaltimento rifiuti potenzialmente pericolosi. Precauzioni operative Per ottenere risultati affidabili è necessario attenersi strettamente alle presenti Istruzioni per l uso e seguire scrupolosamente quanto indicato nel manuale operativo dello strumento. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 5 di 13

6 I reagenti forniti nel kit devono essere utilizzati esclusivamente con il sistema TGS TA Analyzer. I componenti della cartuccia reagenti non possono essere rimossi dalla cartuccia e riassemblati. Non usare il kit oltre la data di scadenza. PREPARAZIONE DEI REAGENTI I reagenti forniti nel kit sono tutti pronti per l uso. CONSERVAZIONE E STABILITA DEI REAGENTI Conservare i reagenti forniti nel kit a 2-8 C in posizione verticale ed al buio. In queste condizioni la cartuccia reagenti ed i calibratori non aperti sono stabili sino alla data di scadenza. La cartuccia reagenti dopo apertura può essere utilizzata per 60 giorni se conservata in frigorifero a 2-8 C oppure a bordo macchina. I calibratori dopo apertura possono essere utilizzati per 60 giorni se conservati in frigorifero a 2-8 C e se la permanenza a bordo non supera le 6 ore per seduta. Non congelare i reagenti ed i calibratori. PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio deve essere eseguito su campioni umani di siero e plasma (EDTA Sodio Citrato). Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, emolizzati e torbidi. Se il dosaggio viene eseguito dopo più di 8 ore, separare il siero o il plasma dal coagulo, dai globuli rossi e dalle provette di separazione con gel. Prima di essere analizzati i campioni possono essere conservati in frigorifero a 2-8 C per 7 giorni al massimo. Se il dosaggio viene eseguito dopo più di 7 giorni, conservare i campioni congelati (< - 20 C). Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. PROCEDIMENTO OPERATIVO Per ottenere prestazioni analitiche affidabili attenersi scrupolosamente alle istruzioni riportate nel manuale operativo dello strumento. Caricamento dei reagenti Tutti i reagenti forniti nel kit sono pronti per l uso. Prima di inserire la cartuccia reagenti nel sistema, il contenitore delle particelle magnetiche deve essere agitato per rotazione orizzontalmente in modo da favorire la risospensione delle particelle. Eseguire l operazione evitando la formazione di schiuma. Posizionare la cartuccia reagenti nell area reagenti dello strumento utilizzando l apposita guida e lasciare in agitazione per almeno 40 minuti prima dell uso. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 6 di 13

7 Il posizionamento della cartuccia reagenti determina contemporaneamente la lettura del codice a barre identificativo. In caso di danneggiamento dell etichetta della cartuccia o in caso di mancata lettura, i dati identificativi della cartuccia reagenti possono essere inseriti manualmente. Lo strumento mantiene automaticamente in agitazione continua le particelle magnetiche. Se la cartuccia reagenti viene rimossa dallo strumento, conservarla verticalmente al buio a 2-8 C. Caricamento dei calibratori I calibratori TGS TA sono pronti per l uso. Lasciare i calibratori a temperatura ambiente per 10 minuti ed agitare delicatamente il contenuto, manualmente o mediante vortex, evitando la formazione di schiuma. Nel caso i calibratori fossero utilizzati per la prima volta, eliminare il sigillo di garanzia ed il tappo bianco di chiusura prima del loro inserimento sullo strumento. Nel caso i calibratori fossero già stati utilizzati, il contenitore sarà provvisto del tappo superiore (tappo rosso) senza il sigillo di garanzia. Eliminare il tappo di chiusura rosso prima del loro inserimento sullo strumento. Inserire nello strumento i calibratori nell area campioni; per la loro identificazione sullo strumento consultare il manuale d uso dello strumento. I dati del bar code devono essere inseriti manualmente in caso di danneggiamento dell etichetta o in caso di mancata lettura. I valori della concentrazione degli anticorpi IgM anti-hsv1/2 presente nei calibratori sono registrati nel DATA DISK ed automaticamente trasferiti nell analizzatore. Al termine della seduta i contenitori dei calibratori devono essere chiusi con gli appositi tappi superiori (tappi rossi) e trasferiti a 2-8 C sino al loro successivo impiego. I calibratori possono essere utilizzati per un massimo di quattro volte. Caricamento dei controlli Inserire i controlli nell area campioni dello strumento. Per la loro identificazione sullo strumento consultare il manuale d uso dello strumento. In caso di mancanza del bar code sul controllo o in caso di mancata lettura, i dati identificativi del controllo possono essere inseriti manualmente. Qualora siano utilizzati i Controlli TGS TA, consultare le relative istruzioni d uso. I valori della concentrazione degli anticorpi IgM anti-hsv1/2 presente nei controlli TGS TA sono registrati nel DATA DISK ed automaticamente trasferiti nell analizzatore. Selezionare per ogni controllo i parametri richiesti. Caricamento dei campioni Inserire i campioni nello strumento, nell area campioni; per la loro identificazione sullo strumento consultare il manuale d uso dello strumento. In caso di mancanza del bar code sul campione o in caso di mancata lettura, i dati identificativi del campione possono essere inseriti manualmente. Selezionare per ogni campione i parametri richiesti. Calibrazione Lo strumento TGS TA Analyzer utilizza una curva di calibrazione memorizzata (master curve), generata dal produttore per ogni lotto di cartuccia reagenti. I parametri delle master curve, unitamente ai valori delle concentrazioni dei calibratori, sono memorizzati nel DATA DISK e trasferiti nel database dello strumento. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 7 di 13

8 I calibratori A e B sono utilizzati per ricalibrare la master curve in funzione sia dello strumento utilizzato che dei reagenti a bordo. Per eseguire la ricalibrazione analizzare in triplicato i due calibratori A e B ed in singolo i controlli. I valori di concentrazione ottenuti con i controlli permettono di validare la nuova calibrazione. Una volta che la ricalibrazione della master curve sia stata accettata e memorizzata, tutti i campioni successivi possono essere analizzati senza ulteriore calibrazione, tranne nei seguenti casi: - quando è caricata a bordo dello strumento una cartuccia reagenti con un nuovo lotto; - quando i valori dei controlli non rientrano nell intervallo di accettabilità; - quando è eseguita la procedura di manutenzione dello strumento; - quando è scaduta la validità della master curve ricalibrata. La validità della master curve ricalibrata per il kit TGS TA HSV 1/2 IgM è di 21 giorni. La gestione della ricalibrazione è attuata in automatico dallo strumento. Dosaggio Premere il tasto di avvio. 1. Il sistema aspira, 100 µl di Diluente Campioni, 20 µl di Particelle Magnetiche, 86 µl di Diluente Campioni e 18 µl di Campione o controllo pretrattati a bordo in diluizione 1:14 con il reagente Sorbent (per i calibratori, il siero positivo è fornito prediluito con il Diluente Campioni ed il volume prelevato è di 104 µl). Le soluzioni e la sospensione aspirate sono dispensate nella cuvetta di reazione. 2. La cuvetta di reazione è incubata nel rotore a 37 C per 20 minuti. 3. Dopo questa fase di incubazione, le particelle magnetiche sono separate e lavate. 4. Nella cuvetta vengono dispensati 200 µl di coniugato. 5. La cuvetta di reazione è incubata nel rotore a 37 C per 10 minuti. 6. Dopo questa ultima fase di incubazione, le particelle magnetiche sono separate e lavate e la cuvetta viene trasferita nella camera di lettura. 7. La quantità di coniugato legato alla fase solida, espressa in RLU, è direttamente proporzionale alla concentrazione di IgM anti-hsv 1/2 presente nel campione. 8. Le risposte ottenute sono interpolate sulla curva di taratura e trasformate in concentrazioni. Campioni con valori di concentrazione più elevati del limite superiore dell intervallo di misurabilità possono essere diluiti e ritestati. Il nuovo valore ottenuto viene moltiplicato, per ottenere il risultato finale, per il fattore di diluizione utilizzato. CONTROLLO QUALITA Per assicurare la validità del dosaggio, sieri di controllo a differenti livelli di concentrazione (almeno un siero negativo ed un siero positivo) devono essere misurati ogni giorno in cui si esegue il dosaggio. Se il proprio laboratorio richiede, per la verifica dei risultati del dosaggio, un uso più frequente o un numero più elevato di controlli, seguire le procedure del controllo qualità ivi stabilite. Se vengono utilizzati i sieri di controllo TGS TA, i valori medi attesi ed i limiti di accettabilità sono quelli riportati nel DATA DISK presente anche nella confezione dei controlli. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 8 di 13

9 Qualora venissero utilizzati sieri di controllo diversi, è necessario, prima del loro impiego, definire i valori attesi con reagenti e sistema TGS TA. Qualora il valore dei controlli non rientri nel range di accettabilità specificato, i relativi risultati del dosaggio non sono validi ed i rispettivi campioni devono essere rianalizzati. In questo caso è necessario eseguire prima della ripetizione del dosaggio una procedura di ricalibrazione. CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Calcolo dei risultati La concentrazione degli anticorpi IgM anti-hsv 1 e HSV 2 presente nei campioni in esame è calcolata automaticamente dal sistema. I valori possono essere visualizzati mediante lettura sul video o attraverso stampa. Le concentrazioni sono espresse in UA/mL. Il calcolo della concentrazione di analita nel campione avviene attraverso lettura della risposta ottenuta per ogni campione su una curva di calibrazione elaborata mediante un sistema di fitting logistico a quattro parametri (4PL, Y ponderato), corretta periodicamente in funzione delle risposte ottenute nel dosaggio dei calibratori. Per informazioni dettagliate su come il sistema calcola i risultati, consultare il manuale operativo del sistema. Interpretazione dei risultati Il range di misurabilità del dosaggio TGS TA HSV 1/2 IgM è: UA/mL. I valori inferiori a 0.0 UA/mL sono valori estrapolati,compare il messaggio OMR- e/o ORA e sono riportati con valore uguale a 0.0 UA/mL. I valori superiori a 90 UA/mL hanno il messaggio OMR+ e/o ORA e possono essere ritestati dopo opportuna diluizione. I risultati dei campioni possono essere interpretati nel seguente modo: (UA/mL) Interpretazione < 10 Il campione è da considerare Negativo per la presenza di IgM anti HSV 1 e HSV 2 10 Il campione è da considerare Positivo per la presenza di IgM anti-hsv 1 e HSV 2 I valori sopra riportati sono da considerare solo valori suggeriti. Ciascun laboratorio deve stabilire i propri intervalli di riferimento. LIMITI DEL DOSAGGIO Per scopi diagnostici, i risultati ottenuti con il kit TGS TA HSV 1/2 IgM ed il sistema TGS TA Analyzer devono essere utilizzati unitamente agli altri dati clinici e di laboratorio a disposizione del medico. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 9 di 13

10 La contaminazione batterica dei campioni e l inattivazione al calore possono influenzare il risultato del dosaggio. Gli anticorpi eterofili presenti nei campioni di siero umano possono reagire con i reagenti a base di immunoglobuline, causando interferenze nei dosaggi immunologici in vitro. Questi campioni possono dar luogo a valori anomali se analizzati con il kit TGS TA HSV 1/2 IgM. VALORI ATTESI Sono stati analizzati 129 campioni selezionati non immuni per verificare l assenza di anticorpi IgM anti-hsv 1 e 2. Tutti i campioni analizzati sono risultati negativi, con un valore medio di 1,5 UA/mL ed una deviazione standard di 1,84 UA/mL. Con i risultati ottenuti è stato calcolato il Limit of Blank (LoB = il più alto valore che possiamo attenderci in una serie di campioni che non contengono l analita). Il Limit of Blank, determinato come 95 percentile della popolazione negativa, è risultato pari a 5,1 UA/mL con il Lotto di reagenti n. 1. PRESTAZIONI Avvertenza: i dati presentati non rappresentano le specifiche del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal produttore. Precisione e Riproducibilità La precisione e riproducibilità del kit TGS TA HSV 1/2 IgM sono state valutate impiegando un protocollo basato sulle linee guida del documento EP5-A2 del Clinical and Laboratory Standards (CLSI). La precisione è stata calcolata analizzando i risultati di 20 replicati di quattro sieri (uno negativo e tre positivi con diverse concentrazioni di IgM anti-hsv 1 e 2) eseguiti con due diversi lotti di reagenti nella stessa seduta sperimentale. La concentrazione del siero anti-hsv 1/2 IgM negativo (HSM-NC-01) è risultata compresa nell intervallo da 0,5 a 2,4 UA/mL e a 0 UA/mL rispettivamente con il Lotto di reagenti n. 1 e n. 2. In Tabella si riportano i risultati ottenuti con i 3 sieri positivi. Campione Reagenti Lot. no. Concentrazione media (UA/mL) SD CV % 1 23,8 2,25 9,5 2 26,2 2,00 7,6 1 22,7 1,57 6,9 2 24,6 1,32 5,4 1 31,2 1,75 5,6 2 30,7 1,96 6,4 IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 10 di 13

11 La riproducibilità è stata calcolata analizzando i risultati della determinazione di cinque sieri (uno negativo e quattro positivi con diverse concentrazioni di anti-hsv 1/2 IgM) eseguita in doppio, in 15 sedute diverse, con due lotti di reagenti. La concentrazione del siero anti-hsv 1/2 IgM negativo (HSM-N3) è risultata compresa nell intervallo da 0,0 a 1,1 UA/mL. In Tabella si riportano i risultati ottenuti con i 4 sieri positivi. Campione Concentrazione media (UA/mL) SD (UA/mL) CV % 1 26,8 1,87 7,0 2 24,2 1,50 6,2 3 33,4 1,67 5,0 4 36,8 2,26 6,1 Sensibilità Analitica La sensibilità analitica del kit TGS TA HSV 1/2 IgM, è stata valutata utilizzando due protocolli basati sulle linee guida del documento EP17-A del Clinical and Laboratory Standards (CLSI). In un caso espressa come limite di rilevazione (Limit of Detection LoD: ossia la più piccola quantità di analita che il metodo è in grado di misurare) si è applicata la formula per il calcolo LoD = LoB + C β SD s (dove LoB rappresenta il valore del Limit of Blank, SD s la deviazione standard stimata della distribuzione del campione a bassa concentrazione e C β è derivato dal 95 percentile della distribuzione standard gaussiana). Sono stati utilizzati 3 campioni a bassa concentrazione di analita, determinati in singolo con un Lotto di reagenti in 15 esperimenti diversi. Il Limite di rilevazione del kit TGS TA HSV 1/2 IgM è risultato pari a 9,1 UA/mL. Nell altro protocollo è previsto il calcolo della Minima Concentrazione misurabile o MDC (Minimum Detectable Concentration): sono stati utilizzati 20 replicati della soluzione dello Standard 0 UA/mL della curva Master. Si sono elaborate la media e la deviazione standard (DS) su un lotto di kit. Il valore di RLU relativo alla media DS è stato interpolato sulla curva e se ne è ricavata la relativa concentrazione. La sensibilità analitica espressa come Minima Concentrazione misurabile è 4,9 UA/mL. I valori del limite di rilevazione, unitamente a considerazioni di carattere clinico ed ai risultati di comparazione con metodi di riferimento hanno contribuito alla definizione del valore cut-off. Specificità Analitica: Interferenze Uno studio basato sulle linee guida del documento EP7-A2 del CLSI ha dimostrato che le prestazioni del dosaggio non sono influenzate dalla presenza nel campione delle sostanze potenzialmente interferenti elencate nella seguente tabella, sino alla concentrazione sperimentata. IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 11 di 13

12 Sostanze Potenzialmente Interferenti Bilirubina libera Bilirubina coniugata Emoglobina Trigliceridi Massima concentrazione sperimentata 20 mg/dl 20 mg/dl 1000 mg/dl 3000 mg/dl L uso di campioni lipemici, emolizzati o torbidi viene comunque sconsigliato. Fattore Reumatoide (RF) E stato dimostrato che su 5 campioni, la presenza di Fattore reumatoide ( con concentrazione compresa tra 796 e 1831 UI/mL ) non interferisce nel dosaggio. Specificità Analitica: Reazioni crociate Per valutare le potenziali reazioni crociate dell antigene utilizzato per sensibilizzare le microparticelle, è stato condotto uno studio con 31 campioni, tutti con anticorpi IgM positivi per antigeni erpetici e antigeni del complesso TORCH ed IgM negativi per HSV1/2. I campioni utilizzati erano così suddivisi: 6 EBV VCA, 5 Rubella, 6 Toxoplasma, 4 CMV, 2 VZV, 3 parotite (Mumps). Lo studio non ha mostrato alcuna significativa reazione crociata dell antigene in fase solida con gli altri autoanticorpi. Sensibilità e Specificità Relative La presenza di anticorpi anti-hsv 1/2 IgM è stata determinata utilizzando il kit TGS TA HSV 1/2 IgM ed un metodo di dosaggio immunochemiluminescente disponibile in commercio in 141 campioni. 5 campioni hanno dato luogo a risultati discordanti tra il dosaggio TGS TA ed il dosaggio disponibile in commercio. La concordanza relativa è risultata pertanto essere pari al 96,5% (Intervallo di Confidenza al 95%: 91,6 98,7%) (136/141). La sensibilità relativa è risultata pari al 77,8 % (Intervallo di Confidenza al 95%: 40,2 96,1%) (7/9). La specificità relativa è risultata pari al 97,7% (Intervallo di Confidenza al 95%: 93,0 99,4%) (130/133). BIBLIOGRAFIA 1. Xu F, Sternberg MR, Kottiri BJ, et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. JAMA 2006; 296: [PubMed: ] 2. Chayavichitslip P, Buckwalter JV, Krakowski AC, Friedlander SF. Herpes Simplex. Pediatr Rev. 2009; 30(4): Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines MMWR 2002: 51 (No. RR-6) IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 12 di 13

13 4. Lamey Pj, Hyland PL. Changing epidemiology of herpes simplex type 1 infections. Herpes 199; 6: Nieuwenhuis RF,van Doorum Gj, Mulder PG, et al. Importance of herpes simplex virus type 1 (HSV 1) in primary genital herpes. Acta Derm Venereol 2006;86: [PubMed: ] 6. Lycke E and Jeansson S: Herpes Simplex Virus. in EH Lenette, P Halonen and FA Marphy, eds. Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases: Principals and Practice, vol. II: Viral, Rickettsial and Clamydial diseases, Springer-Verlag, Berlin, pp211, Drew WL and Rawls WE. Herpes simplex viruses, in EH Lenette, A Ballows, WJ Hausler and HJ Shadomy, eds, Manual of Clinical Microbiology, 4 th ed., American Society for Microbiology, Washington, DC, pp 705, Arvin A, C Prober. Herpes Simplex Virus In Murray P, E Baron, M Pfaller, F Tenover, and R Yolken (eds). Manual of Clinical Microbiology. 6 th Ed. ASM, Washington D.C. (1995). 9. Bergström T, Trybala E. Antigenic differences between HSV 1 and HSV 2 glycoproteins and their importance for type-specific serology. Intervirology. 1996; 39 (3): TECHNOGENETICS S.r.l. Via Vanvitelli, Milano Italia Sito operativo: Via della Filanda, Lodi Italia IFU039TGS TA-Versione: marzo 2013 Pagina 13 di 13