BIO-FLASH. BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n Lliçà d Amunt - Barcelona - SPAIN
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1 VEDI CAMBI RISALTATI BIO-FLASH HBsAg tests BIO-FLASH HBsAg è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la determinazione qualitativa dell antigene di superficie dell epatite B (HBsAg) nel siero e nel plasma umano con lo strumento BIO-FLASH. Introduzione L'epatite B è un'infezione del fegato prodotta dal virus dell'epatite B (HBV) e che rappresenta un grave problema di salute globale. Il virus provoca una serie di malattie del fegato, che vanno dall epatite acuta e cronica alla cirrosi e al cancro epatico primario. Le malattie causate dal virus dell'epatite B hanno una distribuzione globale: si stima che circa un terzo della popolazione mondiale sia stato infettato con l HBV. Di questa quantità, circa 350 milioni di persone sono cronicamente infette e a rischio di grave malattia e di morte, soprattutto a causa di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare. L infezione da HBV varia notevolmente nelle diverse aree geografiche, e la prevalenza di HBV cronica può variare dallo 0,2% al 15%. Le principali modalità di trasmissione dell'hbv sono l'esposizione perinatale alla madre infetta, orizzontale, parenterale e sessuale, i cui tassi relativi variano nelle diverse aree del mondo. La trasmissione parenterale e la sessuale predominano nei paesi industrializzati, mentre la trasmissione orizzontale e la perinatale predominano nei paesi in via di sviluppo. 1,2 Durante l infezione virale appaiono diversi marcatori sierologici, tra i quali l antigene di superficie dell epatite B (HBsAg). L HBsAg, un complesso di determinanti antigenici che si trova sulla superficie del virus HBV, rappresenta il più precoce indicatore di un infezione acuta ed è indicativo di un infezione cronica, nel caso in cui la sua presenza persista per un periodo superiore a sei mesi. Negli adulti, la maggior parte delle infezioni acute da HBV sono auto-limitate e i pazienti guariscono completamente, sviluppando anticorpi specifici (anti-hbs) ed eliminando l HBsAg dal flusso sanguigno. Una ridotta percentuale di pazienti sviluppa l epatite B acuta grave; tale rischio può essere maggiore in persone infettate in concomitanza dal virus dell epatite C (HCV) o D. Una limitata percentuale (<5%) sviluppa infezioni croniche da HBV con replicazione virale continua nel fegato. Le infezioni croniche si presentano in quasi tutti i bambini infettati da epatite B durante l esposizione perinatale e fino al 50% dei bambini vengono infettati ad un età compresa tra 1 e 5 anni. L infezione cronica da HBV è definita dalla persistenza dell HBsAg per un periodo superiore a sei mesi. 3,4 La misurazione dell HBsAg viene utilizzata per l analisi del sangue o di prodotti ematici, al fine di impedire la trasmissione dell HBV, oltre che per diagnosticare sospette infezioni da HBV o tenere sotto controllo lo stato dei soggetti infetti. I Centri per la prevenzione e il controllo delle malattie (U.S. Centers for Disease Control and Prevention, CDC) raccomandano il test di routine dell HBsAg per persone nate in zone con una prevalenza superiore al 2%, persone non vaccinate, nate negli Stati Uniti e con genitori provenienti da zone con una prevalenza superiore all 8%, donne in gravidanza e, tra l altro, soggetti con esposizione perinatale e comportamentale all HBV. La determinazione degli anticorpi HBsAg, anti-hbc e anti-hbs è raccomandata anche in caso di pazienti immunodepressi, ad esempio in soggetti affetti da HIV ed immunosoppressi, a causa di un aumento del rischio di riattivazione dell'epatite B. 5 Principio Quando le microparticelle paramagnetiche del BIO-FLASH HBsAg si mescolano e si incubano con il campione, se esso presenta HBsAg, quest ultimo si combina con gli anticorpi specifici anti-hbs che ricoprono le microparticelle. Dopo una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residu o, si aggiunge un tracciatore consistente in un anticorpo IgG anti-hbs marcato con isoluminolo, che si unisce all HBsAg catturato dalle microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL), che sono direttamente proporzionali alla concentrazione di HBsAg del campione. Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC) per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori.
2 Schema della reazione: Attivatori (Triggers) URL Particella magnetica Campione Tracciatore Emissione di luce Componenti Cartuccia reagenti Il kit BIO-FLASH HBsAg contiene una cartuccia reagenti per 100 determinazioni (REF ). Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE ) Composizione della cartuccia reagenti: La cartuccia è composta da 3 contenitori, così composti: A. 1 contenitore cilindrico per la sospensione di microparticelle ricoperte con anticorpo di cavia IgG anti-hbs. Contiene < 0,1% di sodio azide. B. Posizione vuota. C. 1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in un anticorpo di capra IgG anti-hbs marcato con isoluminolo. Contiene Bronidox. D. 1 contenitore vuoto. Preparazione Si veda la seguente figura. Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare affinché si risospendano. La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate). Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità. Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto. Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore (parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la cartuccia aperta. Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento. Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.
3 Precauzioni I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO. Uso esclusivo per utilizzatori professionali. La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua. ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO. Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante. Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori. Raccolta e conservazione dei campioni Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA, Li-eparina, Na-eparina, Na-citrato e ACD). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni. Siero I campioni di siero possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non presentino bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Plasma I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. Scongelare il plasma a 37 C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non presentino bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Volume di campione Il volume di campione necessario per condurre un'unica prova con BIO-FLASH HBsAg varia in base al tipo di recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF ), per un test saranno necessari almeno 200 µl più il volume morto, equivalente a 200 µl. Altri materiali I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente. REF REF BIO-FLASH HBsAg Calibrators (Calibratori) BIO-FLASH HBsAg Controls (Controlli) Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni.
4 Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test BIO-FLASH HBsAg sono incluse nei codici a barre dei contenitori. L uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti. Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità sufficiente dei seguenti consumabili: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette) Nota: il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE ) REF REF REF BIO-FLASH Triggers (Attivatori) BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema) BIO-FLASH Special Wash Solution (Soluzione detergente speciale) Strumento / conduzione del test Nella Guida per l Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test. Calibrazione Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL. Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l Utente del BIO-FLASH. Controllo di qualità Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano due livelli di controllo. I controlli BIO-FLASH HBsAg negativo e positivo sono stati progettati per il suddetto programma. I controlli devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Assicurarsi che i risultati dei controlli si trovino all interno del range di accettazione, perché in caso contrario si potranno avere risultati non validi e l utente dovrà adottare misure correttive. In questo caso esaminare tutti i risultati ottenuti dall ultima verifica positiva del controllo di qualità dell analita in questione. Può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al. 6 Conservazione e stabilità I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della cartuccia se conservati ad una temperatura di 2-8 C e in posizione verticale. Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8 C è di 12 settimane. Interpretazione dei risultati La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del BIO-FLASH HBsAg sono espressi in S/CO (rapporto segnale/cut-off). Si tratta di un test qualitativo, in cui il valore numerico del risultato è solamente indicativo del numero di antigeni presenti. I campioni con un risultato < 0,95 S/CO si considerano non reattivi (negativi). I campioni con un risultato 0,95 e < 1,00 S/CO si considerano indeterminati (zona grigia). I campioni con un risultato 1,00 S/CO si considerano reattivi (positivi). I campioni con risultato inizialmente reattivo o indeterminato devono essere rianalizzati in duplicato. Se entrambi i valori della ripetizione sono inferiori a 0,95, l'interpretazione finale del test è negativa per HBsAg. Se uno dei risultati della ripetizione del duplicato è positivo o indeterminato, il campione deve essere ulteriormente analizzato con test supplementari per avere una conferma del risultato. Un risultato positivo ripetuto indica un infezione da HBV. I campioni con concentrazioni di HBsAg superiori a 1000,00 S/CO sono indicati come >1000,00. Campioni con valori molto elevati non sono frequenti, ma possono causare un effetto di trascinamento che renda reattivo o indeterminato un campione negativo HBsAg. Per questa ragione, è opportuno testare nuovamente i campioni reattivi o indeterminati in fasi separate, iniziando dai campioni con un valore iniziale <1000,00 S/CO e passando successivamente ai campioni con un valore >1000,00.
5 Limitazioni Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un infezione da HBV. Pertanto, oltre ai risultati del BIO-FLASH HBsAg, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l anamnesi clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Un risultato negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HBV. Come in tutti i test immunologici sensibili vi è la possibilità di ottenere risultati positivi non ripetibili. Risultati attesi L incidenza di infezioni croniche da HBV varia nel mondo in base a differenze geografiche. Nella maggior parte dei Paesi europei, nella zona più a sud dell America Meridionale, in Messico, Australia, Nuova Zelanda e Nord America, la prevalenza di HBV è inferiore al 2%. Una prevalenza intermedia, compresa tra il 2% e il 7%, è stata osservata in Europa orientale e meridionale, in Russia, in Asia meridionale, centrale e sud-occidentale, in Giappone, in Israele, nella maggior parte delle zone circostanti il bacino del Rio delle Amazzoni, in Honduras e in Guatemala. La più elevata prevalenza di infezioni croniche da HBV ( 8%) è stata rilevata in Asia sud-occidentale, nelle isole del Pacifico meridionale ed occidentale, in Medio Oriente, eccetto Israele, all interno del bacino del Rio delle Amazzoni, in determinate aree dei Caraibi (Haiti e Repubblica Dominicana) e nella totalità dell Africa. 2 Caratteristiche funzionali NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati. Specificità La valutazione della specificità si basa sul test di campioni di siero da donatori di sangue non selezionati, inclusi coloro che donano per la prima volta, e da pazienti ospedalizzati. In totale sono stati testati 5181 campioni freschi di siero non selezionati di due banche del sangue, 3681 del Banc de Sang i de Teixits de Catalunya (Spagna) e 1500 del centro EFS Centre Atlantique di Tours (Francia). Inoltre sono stati valutati 222 campioni di siero non selezionati provenienti da pazienti ricoverati nell ospedale di Santa Creu i Sant Pau (Spagna). I campioni Ripetutamente reattivi sono stati ritestati ricorrendo ad un altro metodo commerciale. Quindi è stata calcolata la specificità, con i risultati illustrati nella seguente tabella. Campioni testati Inizialmente reattivi (IR) Ripetutamente reattivi (RR) RR risultanti indeterminati RR risultanti positivi Specificità n n n n n % Donatori di sangue ,96 Pazienti ospedalizzati ,55 Sensibilità È stato testato con BIO-FLASH HBsAg un pannello di campioni dalla positività HBsAg accertata, composto da 29 campioni freschi dello stesso giorno ( 1 giorno dalla raccolta). La sensibilità è stata quindi calcolata per ciascun gruppo di campioni, con i risultati riportati nella seguente tabella: Campioni Gruppo di campioni testati Reattivi Sensibilità n n % Non divisi per sottotipo Sottotipo ad Sottotipo ay Sensibilità alla sieroconversione Sono stati eseguiti ulteriori studi di sensibilità testando i campioni di 30 pannelli di sieroconversione per l'epatite B. I risultati del BIO-FLASH HBsAg sono stati confrontati con quelli di altri metodi disponibili in commercio. La reattività precoce è stata osservata con nove (9) pannelli, mentre la reattività equivalente con ventuno (21). Precisione Si valutò in conformità alle direttive CLSI EP05-A2, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Media (S/CO) Intra-test Totale Controllo negativo 0,57 0,038 SD 0,047 SD Controllo positivo 12,53 4,0% CV 6,7% CV Intorno al valore di cut-off 0,88 3,9% CV 7,6% CV
6 Riproducibilità È stata valutata la riproducibilità tra duplicati, tra lotti e tra strumenti, utilizzando 50 campioni. I risultati si mostrano nella seguente tabella: n Co-negatività Co-positività Duplicato 2 vs. Duplicato % 100% Lotto 2 vs. Lotto % 100% Strumento 2 vs. Strumento % 100% Interferenze Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A2 hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non alterano i risultati del test BIO-FLASH HBsAg: Sostanza potenzialmente interferente Concentrazione % Interferenza Emoglobina 500 mg/dl 10 Bilirubina indiretta 18 mg/dl 10 Bilirubina diretta 18 mg/dl 10 Trigliceridi mg/dl 10 Fattore reumatoide 700 UI/mL 10 HAMA 1 µg/ml 10 Reattività crociata Sono stati analizzati con BIO-FLASH HBsAg un totale di 121 campioni positivi per una serie di cross-reagenti e campioni di donne in stato interessante. Si suppone che un potenziale cross-reagente provochi una reattività crociata, quando la diagnosi passa da negativa a positiva o viceversa. I campioni reattivi sono stati comparati ad un test di riferimento per il quale non è stata dimostrata alcuna reazione crociata con la sostanza potenzialmente interferente. Tutti i campioni reattivi HBsAg sono stati confermati, eccettuando due campioni positivi all IgM anti-hsv. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Reattività crociata potenziale Concordanza ANA (anticorpi antinucleari) 5/5 anti-cmv (anticorpi contro il virus citomegalovirus) 4/4 anti-ebv (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr) 4/4 anti-hav-igg (anticorpi contro il virus dell'epatite A) 6/6 anti-hav-igm (anticorpi contro il virus dell'epatite A) 5/5 anti-hcv (anticorpi contro il virus dell Epatite C) 6/6 anti-hdv IgG (anticorpi contro il virus dell'epatite D) 5/5 anti-hev (anticorpi contro il virus dell'epatite E) 4/4 Anti-HIV (anticorpi contro il virus dell'immunodeficienza umana) 10/10 IgG anti-hsv (virus Herpes simplex) 7/7 IgM anti-hsv (virus Herpes simplex) 15/17 anti-rubella 8/8 anti-toxoplasma 3/3 anti-vzv (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster) 4/4 IgG elevate 5/5 IgM elevate 5/5 Mononucleosis 4/4 Donne in gravidanza (incluse multipare) 9/9 RF (fattore reumatoide) 4/4 RPR (Rapid Plasma Reagin) 10/10 Limite di rilevamento e sensibilità analitica In conformità alle direttive CLSI EP17-A, il limite di rilevamento (LR) si situa a 0,74 S/CO. La sensibilità analitica è stata calcolata con tre diversi materiali. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Secondo standard internazionale OMS Materiale di riferimento PEI HBsAg ad Standard lavorativo PEI HBsAg ay 0,035 UI/mL 0,010 PEI-U/mL 0,017 PEI-U/mL
7 I risultati sono stati determinati interpolando il cut-off del test nella linea di regressione, ottenuta testando diluizioni seriali del secondo standard internazionale della OMS per HBsAg, sottotipo adw2, genotipo A (codice NIBSC 00/588), il materiale di riferimento del Paul-Ehrlich-Institute (PEI) per HBsAg, sottotipo ad (100 U/mL), e lo standard lavorativo PEI per HBsAg, sottotipo ay ( U/mL). Il campione di monitoraggio per HBsAg (codice NIBSC 07/ ) nel test BIO-FLASH HBsAg ha dato come risultato 1,29 S/CO. Effetto prozona BIO-FLASH HBsAg è un test a due step. Il protocollo di analisi comprende una fase di lavaggio dopo l'incubazione del campione, che elimina l'effetto prozona. Sperimentalmente, non è stato osservato alcun effetto prozona con un campione di UI/mL.
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