BIO-FLASH VEDI CAMBI RISALTATI

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1 BIO-FLASH CMV IgM tests BIO-FLASH CMV IgM è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la determinazione qualititativa degli anticorpi IgM anti-citomegalovirus nel siero e nel plasma umano con lo strumento BIO-FLASH. Introduzione Il citomegalovirus umano (CMV) appartiene al gruppo degli Herpes virus, che include anche gli Herpes virus simplex tipo 1 e 2, il virus della varicella Herpes zoster e il virus di Epstein-Barr. Una caratteristica comune di questi virus è che possono causare infezioni latenti. 1 Il CMV è un agente ubiquo che normalmente infetta soggetti di zone geografiche e ambiti economici diversi. La maggior parte della popolazione viene infettata dal virus nel corso della vita; nientemeno che l 81% degli statunitensi di età superiore ai 35 anni è stato esposto al virus. 2 Una caratteristica del CMV è che, dopo l infezione primaria, può persistere a lungo in modo latente e riattivarsi in un secondo momento. L'infezione, la reinfezione o la riattivazione del CMV in soggetti normali, sia adulti che bambini, hanno carattere generalmente asintomatico. Tuttavia, le infezioni in pazienti immunodepressi od oncologici, o in conseguenza di un'infezione intrauterina o perinatale, possono derivare in casi clinicamente gravi di malattia. 1-8 Le trasfusioni di sangue e il trapianto di organi sono cause importanti di infezione da CMV in pazienti immunodepressi. 9 È possibile prevenire la trasmissione del CMV a riceventi di organi tramite la selezione dei donatori, che devono essere sieronegativi per gli anticorpi anti-cmv. La riattivazione, a causa di terapie immunosoppressive, di virus latenti endogeni è un'altra causa notevole di patologia in pazienti immunodepressi. 10 Il rilevamento di un aumento significativo di anticorpi IgG specifici per CMV in coppie di sieri e il rilevamento di anticorpi IgM specifici per CMV forniscono informazioni utili per la diagnosi sierologica di un'infezione da CMV. I test sierologici per il rilevamento di anticorpi anti-cmv sono importanti nella determinazione dell esistenza di un infezione previa, nella diagnosi di una infezione attiva o recente, e nell analisi del sangue per realizzare trasfusioni a neonati e soggetti immunocompromessi. 11 Principio Quando le microparticelle paramagnetiche del BIO-FLASH CMV IgM si mescolano e si incubano con il campione, se esso presenta anticorpi specifici anti-cmv, questi ultimi si combinano con gli antigeni del CMV che ricoprono le microparticelle. Dopo una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo, si aggiunge un tracciatore consistente in un anticorpo monoclonale anti-igm umana marcato con isoluminolo, che si unisce agli anticorpi IgM anti-cmv catturati dalle microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL), che sono direttamente proporzionali alla concentrazione di IgM anti-cmv del campione. Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC) per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori. Schema della reazione: VEDI CAMBI RISALTATI Attivatori (Triggers) URL Particella magnetica Campione Tracciatore Emissione di luce

2 Componenti Cartuccia reagenti Il kit BIO-FLASH CMV IgM contiene una cartuccia reagenti per 50 determinazioni (REF ). Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE ) Composizione della cartuccia reagenti: La cartuccia è composta da 4 contenitori, così composti: A. 1 contenitore cilindrico per la sospensione di microparticelle ricoperte con antigene di CMV in tampone glicina. Contiene < 0,1% di sodio azide. B. 1 contenitore del tampone del test. Contiene < 0,1% di sodio azide. C. 1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in un anticorpo monoclonale di topo anti-igm umana marcato con isoluminolo. Contiene < 0,1% di sodio azide. D. 1 contenitore vuoto. Preparazione Si veda la seguente figura. Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare affinché si risospendano. La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate). Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità. Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto. Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore (parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la cartuccia aperta. Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento. Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.

3 Precauzioni I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO. Uso esclusivo per utilizzatori professionali. La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua. ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO. Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante. Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori. Classe di pericolo Non classificato. Indicazioni di pericolo Nessuna. Consigli di prudenza P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso. P : IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Raccolta e conservazione dei campioni Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA, Li-eparina, Li-eparina in provetta con gel separatore, Na-eparina e Na-citrato). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. Gli anticoagulanti liquidi come il Na-citrato esercitano un effetto diluente e possono ridurre la concentrazione dei campioni dei pazienti. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni. Siero I campioni di siero possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Plasma I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. Scongelare il plasma a 37 C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Volume di campione Il volume di campione necessario per condurre un unica prova con BIO-FLASH CMV IgM varia in base al tipo di recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF ), per un test saranno necessari almeno 15 µl più il volume morto, equivalente a 200 µl. Altri materiali I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente. REF REF BIO-FLASH CMV IgM Calibrators (Calibratori) BIO-FLASH CMV IgM Controls (Controlli) Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni. Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test BIO-FLASH CMV IgM sono incluse nei codici a barre dei contenitori. L uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti. Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità sufficiente dei seguenti consumabili: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette) Nota: Il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE ) REF BIO-FLASH Triggers (Attivatori) REF REF BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema) BIO-FLASH Sample Diluent (Diluente dei campioni)

4 Strumento / conduzione del test Nella Guida per l Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test. Calibrazione Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL. Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l Utente del BIO-FLASH. Controllo di qualità Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano due livelli di controllo. I controlli BIO-FLASH CMV IgM negativo e positivo sono stati progettati per il suddetto programma. Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca la propria media e deviazione standard nonché un programma di controllo di qualità per il monitoraggio delle prestazioni di laboratorio. I controlli devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Se i controlli sono fuori range può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al. 12 Conservazione e stabilità I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della cartuccia se conservati ad una temperatura di 2-8 C in posizione verticale. Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8 C è di 14 settimane. Interpretazione dei risultati La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del BIO-FLASH CMV IgM sono espressi in S/CO (rapporto segnale/cut-off). Si tratta di un test qualitativo, in cui il valore numerico del risultato è solamente indicativo del numero di anticorpi presenti. La determinazione delle IgM anti-cmv con il test BIO-FLASH CMV IgM aiuta nella diagnosi di infezione recente. I campioni con un risultato < 0,90 S/CO si considerano non reattivi (negativi). I campioni con un risultato 0,90 e < 1,10 S/CO si considerano indeterminati (zona grigia). I campioni che sono stati interpretati come indeterminati devono essere nuovamente analizzati. Se anche con la seconda analisi si ottiene un risultato indeterminato, si deve riportare come tale e si deve condurre un altro test con un metodo alternativo, oppure si deve ottenere ed analizzare un secondo campione. I campioni con un risultato 1,10 S/CO si considerano reattivi (positivi). Come in tutti i test immunologici sensibili, vi è la possibilità di ottenere risultati positivi non ripetibili. Un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione da CMV. Una possibile sieroconversione deve essere confermata dalla determinazione quantitativa di IgG specifica, ad esempio con BIO-FLASH CMV IgG REF , mediante l esame di campioni paralleli prelevati ad intervalli di 2-4 settimane. Limitazioni Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un infezione primaria da CMV. Pertanto, oltre ai risultati del BIO-FLASH CMV IgM, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l anamnesi clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Gli anticorpi eterofili nel siero umano possono reagire con l immunoglobulina del reagente, interferendo con i test immunologici in vitro. 13 I dati ottenuti possono indicare che la presenza di anticorpi eterofili nel campione può portare a falsi positivi. Risultati attesi L'infezione da CMV si può presentare a qualsiasi età, anche nella fase fetale. Circa il 50% degli adulti giovani dell'europa Centrale sono infetti da CMV. La popolazione di maggiore età è sieropositiva nella misura del 70-80% circa. Dopo la nascita, l'indice di manifestazione dell'infezione da CMV è inferiore all'1% nei soggetti immunocompetenti. 14 In uno studio statunitense, la prevalenza di infezione da CMV è stata del 58,9% nei soggetti 6 anni. La sieroprevalenza del CMV aumenta progressivamente con l'età, dal 36,3% in bambini di 6-11 anni al 90,8% nei soggetti di età di 80 anni o più. Caratteristiche funzionali NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati.

5 Comparazione di metodi BIO-FLASH CMV IgM è stato valutato in studi comparativi con altri test in commercio. Valutazioni Vennero effettuate due valutazioni, una interna e una esterna presso il Servei de Microbiologia dell Ospedale Santa Creu i Sant Pau di Barcellona (Spagna). Nella valutazione interna sono stati analizzati con BIO-FLASH CMV IgM 154 campioni di differente provenienza, tra cui sieri positivi e negativi di anticorpi IgM anti-cmv. I risultati furono comparati con quelli ottenuti mediante un metodo EIA CMV IgM commerciale. Nella valutazione esterna sono stati analizzati con BIO-FLASH CMV IgM 311 campioni di differente provenienza, tra cui sieri positivi e negativi di anticorpi IgM anti-cmv. I risultati furono comparati con quelli ottenuti mediante un metodo ELFA CMV IgM commerciale. Sono riportati i risultati complessivi. Nei calcoli non si tenne conto dei risultati indeterminati. Metodo di riferimento BIO-FLASH CMV IgM IND NEG POS Totale IND NEG POS Totale Si ottennero i seguenti risultati iniziali di sensibilità e specificità relative e concordanza globale: Sensibilità relativa Specificità relativa Concordanza globale N Valore IC del 95% Valore IC del 95% Valore IC del 95% ,2% 85,3% a 96,6% 95,5% 92,8% a 97,4% 94,7% 92,3% a 96,6% I campioni discrepanti furono analizzati con un metodo ELFA CMV IgM disponibile in commercio. Quattro dei campioni sono stati risolti a favore del BIO-FLASH CMV IgM. Dopo il test supplementare si ottennero i seguenti risultati finali di sensibilità, specificità e concordanza globale: Sensibilità finale Specificità finale Concordanza globale finale N Valore IC del 95% Valore IC del 95% Valore IC del 95% ,2% 87,9% a 97,9% 96,9% 94,5% a 98,4% 96,3% 94,1% a 97,8% Precisione Si valutò, in conformità alle direttive CLSI EP05-A, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Media (S/CO) Intra-test Totale Controllo negativo 0,25 0,016 SD 0,023 SD Controllo positivo 2,65 4,4% CV 4,9% CV Intorno al valore di cut-off 0,77 6,5% CV 10,2% CV Interferenze Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non alterano i risultati del BIO-FLASH CMV IgM: Sostanza potenzialmente interferente Concentrazione % Interferenza Emoglobina 500 mg/dl 10 Bilirubina indiretta 18 mg/dl 10 Bilirubina diretta 18 mg/dl 10 Trigliceridi 1300 mg/dl 10 Fattore reumatoide 543 UI/mL 10 Reattività crociata Quando si analizzarono 109 campioni potenzialmente capaci di produrre reattività crociata con il test BIO-FLASH CMV IgM e si confrontarono i risultati con quelli di test commerciali per CMV IgM, si evidenziò la seguente concordanza:

6 Reattività incrociata potenziale Concordanza Anti-HIV (anticorpi contro il virus dell immunodeficienza umana) 5/5 HAMA (anticorpo umano antimurino) 5/5 SLE (lupus eritematoso sistemico) 8/10 ANA (anticorpi antinucleari) 5/5 Anti-EBV (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr) 4/5 Anti-PV B19 (anticorpi contro il Parvovirus B19) 7/7 Anti-HSV 1 (anticorpi contro il virus Herpes simplex di tipo 1) 5/5 Anti-VZV (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster) 5/5 Paraproteine IgG e IgM 5/6 IgG e IgM elevate 8/10 Anticorpi eterofili 9/13 RF (fattore reumatoide) 9/10 Donne in gravidanza (incluse multipare) 22/23