BIO-FLASH VEDI CAMBI RISALTATI
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- Severino Bonelli
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1 BIO-FLASH Toxo IgM tests BIO-FLASH Toxo IgM è un immunotest a chemiluminescenza a due step totalmente automatizzato per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgM anti-toxoplasma gondii nel siero e nel plasma umano con lo strumento BIO-FLASH. Introduzione La toxoplasmosi è una malattia infettiva, che si manifesta sia nell uomo che negli animali, causata dal protozoo Toxoplasma gondii. 1 La toxoplasmosi acquisita è normalmente asintomatica e benigna. 2 Nelle donne in gravidanza questa infezione acquista tuttavia un significato particolare, poiché il parassita può entrare nella circolazione fetale attraverso la placenta e dare luogo ad una toxoplasmosi congenita. Vari studi hanno dimostrato che il rischio e la gravità della toxoplasmosi congenita sono maggiori quando si acquisisce durante i primi tre mesi di gravidanza. 3-6 Le conseguenze della toxoplasmosi congenita vanno dall aborto spontaneo e dal parto prematuro fino a sintomi neurologici e generalizzati che spesso comportano complicanze oculari. I neonati affetti da toxoplasmosi congenita possono anche rimanere asintomatici per diverse settimane dopo la nascita. Diversi studi hanno indicato che la presenza di una determinata concentrazione di IgG materna anti-toxoplasma prima della gravidanza protegge il feto dall infezione causata dal parassita. Anche le analisi sierologiche possono servire per individuare le gravidanze a rischio; le donne sieronegative al momento della diagnosi della gravidanza possono essere monitorate durante tutto il periodo della stessa. L analisi degli isotopi degli anticorpi specifici anti-toxoplasma gondii può aiutare a determinare il momento nel quale è stata contratta l infezione. 7,8 In questo modo è possibile riscontrare un infezione recente, adottare le misure profilattiche necessarie e pianificare la terapia adeguata. Il rilevamento di IgM specifica rende possibile il monitoraggio della donna in gravidanza, poiché le infezioni dovute a toxoplasma non sono normalmente riscontrabili clinicamente. Il monitoraggio sierologico deve consentire il rilevamento precoce di una sieroconversione e, in base alla gravità dell infezione congenita del feto, l immediata adozione delle misure necessarie. La toxoplasmosi può essere letale in pazienti immunocompromessi (AIDS, trapianti di organi). Nei pazienti affetti da AIDS, la toxoplasmosi acuta di norma sopravviene come conseguenza della riattivazione di un infezione latente pregressa, sebbene esistano anche diagnostici di infezioni primarie. 9 Principio Quando le microparticelle paramagnetiche del BIO-FLASH Toxo IgM si mescolano e si incubano con il campione, se esso presenta anticorpi specifici anti-toxoplasma, questi ultimi si combinano con gli antigeni del toxoplasma che ricoprono le microparticelle. Dopo una separazione magnetica ed un lavaggio volto ad eliminare il campione residuo, si aggiunge un tracciatore consistente in un anticorpo monoclonale anti-igm umana marcato con isoluminolo, che si unisce agli anticorpi IgM anti-toxoplasma catturati dalle microparticelle. Dopo una seconda incubazione, una separazione magnetica ed un altro lavaggio, si aggiungono i reagenti che attivano la reazione chemiluminescente. Il luminometro del BIO-FLASH misura la luce emessa in unità relative di luce (URL), che sono direttamente proporzionali alla concentrazione di IgM anti-toxoplasma del campione. Il BIO-FLASH utilizza un metodo di riduzione dei dati con adattamento ad una curva logistica a 4 parametri (4PLC) per generare una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM). Questa curva è predefinita, dipende dal lotto e viene memorizzata nello strumento mediante il codice a barre della cartuccia. Con la misurazione dei calibratori (forniti in un kit a parte), la CCM predefinita si trasforma in una nuova e specifica Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL) per lo strumento. Le concentrazioni dei calibratori sono incluse nei codici a barre delle provette dei calibratori. Schema della reazione: VEDI CAMBI RISALTATI Attivatori (Triggers) URL Particella magnetica Campione Tracciatore Emissione di luce
2 Componenti Cartuccia reagenti Il kit BIO-FLASH Toxo IgM contiene una cartuccia reagenti per 50 determinazioni (REF ). Nota: il disegno della cartuccia è protetto da brevetto (US D565,741 / Disegno CE ) Composizione della cartuccia reagenti: La cartuccia è composta da 4 contenitori, così composti: A. 1 contenitore cilindrico per la sospensione di microparticelle ricoperte con antigene di Toxoplasma in tampone fosfato. Contiene < 0,1% di sodio azide. B. 1 contenitore del tampone del test. Contiene < 0,1% di sodio azide. C. 1 contenitore opaco del tracciatore, consistente in un anticorpo monoclonale di topo anti-igm umana marcato con isoluminolo. Contiene < 0,1% di sodio azide. D. 1 contenitore vuoto. Preparazione Si veda la seguente figura. Cartuccia: le microparticelle sedimentano durante il trasporto e lo stoccaggio, pertanto si devono mescolare affinché si risospendano. La prima volta che si utilizza la cartuccia la si deve capovolgere con cura per 30 volte senza che si formi schiuma (le bolle possono far sì che i sensori di liquido dello strumento diano letture errate). Verificare che le microparticelle si siano risospese completamente. In caso contrario, continuare a capovolgere la cartuccia finché le microparticelle non saranno risospese nella loro totalità. Se le microparticelle non si risospendono o se si riscontra la rottura del sigillo dei reagenti, NON UTILIZZARE LA CARTUCCIA. Dopo che le microparticelle si saranno risospese, collocare la cartuccia su una superficie solida e rimuovere con attenzione la linguetta rossa di sicurezza per il trasporto. Mantenendo la cartuccia sulla superficie solida, stringere le due linguette situate ai lati del tappo perforatore (parte grigia) e premere la parte superiore della cartuccia fino a raggiungere la posizione di bloccaggio. Una volta raggiunta la posizione di bloccaggio, le strisce dovranno rimanere nascoste. Non capovolgere la cartuccia aperta. Lasciare riposare la cartuccia per 5 minuti prima di caricarla nello strumento. Dopo aver caricato la cartuccia, lo strumento mescola il suo contenuto in modo automatico ad intervalli periodici.
3 Precauzioni I reagenti BIO-FLASH sono solo per uso diagnostico IN VITRO. Uso esclusivo per utilizzatori professionali. La sodio azide può reagire con i tubi e le tubature di scarico in piombo o rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Al momento dello smaltimento dei residui di reagenti, sciacquare con abbondante acqua. ATTENZIONE: MATERIALE A RISCHIO BIOLOGICO. Smaltire tutti i materiali usati in appositi recipienti per materiale biocontaminante. Si prega di non riutilizzare né reintrodurre alcun reagente nelle cartucce o nei contenitori. Classe di pericolo Non classificato. Indicazioni di pericolo Nessuna. Consigli di prudenza P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/il viso. P : IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Raccolta e conservazione dei campioni Usare siero fresco (possono essere utilizzate anche provette con gel separatore di siero) o plasma (EDTA, Li-eparina, Li-eparina in provetta con gel separatore, Na-eparina e Na-citrato). Controllare altri anticoagulanti prima del loro uso. Gli anticoagulanti liquidi come il Na-citrato esercitano un effetto diluente e possono ridurre la concentrazione dei campioni dei pazienti. I campioni non devono essere inattivati mediante calore. Le particelle in sospensione devono essere eliminate per centrifugazione. Consultare le direttive CLSI H18-A3 e H21-A5 per ulteriori informazioni relative a manipolazione, trasporto, processo e conservazione dei campioni. Siero I campioni di siero possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. I campioni possono essere congelati/scongelati al massimo 3 volte. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Plasma I campioni di plasma possono essere conservati tra 2 C e 8 C per 8 giorni. Per conservarli durante un periodo di tempo più lungo dovranno essere congelati ad una temperatura uguale o inferiore a -20 C. Scongelare il plasma a 37 C. Scongelare i campioni una volta sola. Mescolare accuratamente dopo lo scongelamento. Verificare che i campioni non vi siano bolle e, in caso contrario, eliminarle completamente prima dell analisi. Volume di campione Il volume di campione necessario per condurre un unica prova con BIO-FLASH Toxo IgM varia in base al tipo di recipiente utilizzato. Utilizzando il recipiente per campione raccomandato (REF ), per un test saranno necessari almeno 15 µl più il volume morto, equivalente a 200 µl. Altri materiali I seguenti materiali non vengono forniti con la cartuccia reagenti e devono essere acquistati separatamente. REF REF BIO-FLASH Toxo IgM Calibrators (Calibratori) BIO-FLASH Toxo IgM Controls (Controlli) Se si desiderano ulteriori informazioni, leggere attentamente le relative istruzioni. Non utilizzare altri calibratori. Le informazioni necessarie allo strumento BIO-FLASH per calibrare il test BIO-FLASH Toxo IgM sono incluse nei codici a barre dei contenitori. L uso di controlli di altri fabbricanti può originare risultati imprevisti. Prima di processare campioni, calibratori o controlli, assicurarsi che nello strumento BIO-FLASH vi sia una quantità sufficiente dei seguenti consumabili: REF BIO-FLASH Cuvettes (Cuvette) Nota: Il disegno delle cuvette è protetto da brevetto (US D560,816 / Disegno CE ) REF BIO-FLASH Triggers (Attivatori) REF REF BIO-FLASH System Rinse (Soluzione del sistema) BIO-FLASH Sample Diluent (Diluente dei campioni)
4 Strumento / conduzione del test Nella Guida per l Utente del BIO-FLASH si troveranno le istruzioni complete per condurre il test. Calibrazione Il codice a barre della cartuccia contiene una Curva di Calibrazione Memorizzata (CCM), valida per il lotto di reagenti. Tuttavia, per tutti i reagenti è necessaria una Curva di Calibrazione di Lavorazione (CCL), specifica per ciascun lotto e valida fino alla data di scadenza di quest ultimo. Quando i risultati dei controlli escono dal range di accettazione o quando sono state effettuate regolazioni sullo strumento, si deve ottenere una nuova CCL. Per configurare una CCL, leggere attentamente la Guida per l Utente del BIO-FLASH. Controllo di qualità Per effettuare un programma completo del controllo di qualità si raccomandano due livelli di controllo. I controlli BIO-FLASH Toxo IgM negativo e positivo sono stati progettati per il programma. Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca la propria media e deviazione standard nonché un programma di controllo di qualità per il monitoraggio delle prestazioni di laboratorio. I controlli devono essere analizzati almeno ogni 24 ore per giorno di uso. Se i controlli sono fuori range può rendersi necessaria la ricalibrazione dello strumento. Nella Guida per l Utente dello strumento si troveranno ulteriori informazioni. Per l individuazione e la risoluzione di situazioni anomale relative al controllo di qualità consultare Westgard et al. 10 Conservazione e stabilità I reagenti non ancora aperti si mantengono stabili fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della cartuccia se conservati ad una temperatura di 2-8 C in posizione verticale. Una volta aperta, la stabilità della cartuccia caricata nello strumento BIO-FLASH o conservata a 2-8 C è di 8 settimane. Interpretazione dei risultati La quantità di analita in ciascun campione si determina partendo dalla luce emessa (URL), mediante interpolazione nella Curva di Calibrazione di Lavorazione memorizzata. I risultati del BIO-FLASH Toxo IgM sono espressi in S/CO (rapporto segnale/cut-off). Si tratta di un test qualitativo, in cui il valore numerico del risultato è solamente indicativo del numero di anticorpi presenti. La determinazione delle IgM anti-toxoplasma con il test BIO-FLASH Toxo IgM aiuta nella diagnosi di infezione recente. I campioni con un risultato < 0,80 S/CO si considerano non reattivi (negativi). I campioni con un risultato 0,80 e < 1,00 S/CO si considerano indeterminati (zona grigia). I campioni che sono stati interpretati come indeterminati devono essere nuovamente analizzati. Se anche con la seconda analisi si ottiene un risultato indeterminato, si deve riportare come tale e si deve condurre un altro test con un metodo alternativo, oppure si deve ottenere ed analizzare un secondo campione. I campioni con un risultato 1,00 S/CO si considerano reattivi (positivi). Come in tutti i test immunologici sensibili, vi è la possibilità di ottenere risultati positivi non ripetibili. Un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione da toxoplasma. Una possibile sieroconversione deve essere confermata dalla determinazione quantitativa di IgG specifica, ad esempio con BIO-FLASH Toxo IgG REF , mediante l esame di campioni paralleli prelevati ad intervalli di 2-3 settimane. Limitazioni Il risultato di un unico campione non è sufficiente per diagnosticare un infezione primaria da toxoplasma. Pertanto, oltre ai risultati del BIO-FLASH Toxo IgM, si devono considerare altri dati, come ad esempio la sintomatologia, l anamnesi clinica, i risultati di altri test ed altre informazioni rilevanti. Gli anticorpi eterofili nel siero umano possono reagire con l immunoglobulina del reagente, interferendo con i test immunologici in vitro. 11 I dati ottenuti possono indicare che la presenza di anticorpi eterofili nel campione può portare a falsi positivi. Risultati attesi Circa un terzo della popolazione mondiale possiede anticorpi anti-toxoplasma, sebbene vi siano notevoli differenze tra le varie nazioni e addirittura all interno di esse. In Inghilterra e Galles la prevalenza aumenta con l età del 0,5% - 1,0% all anno, fino a raggiungere circa il 30% in soggetti di 40 anni. In Francia, invece, l 80% - 90% della popolazione risulta essere positiva a questa età. 12 In uno studio multicentrico condotto a Barcellona (Spagna) su oltre campioni di siero di donne in gravidanza, il 28,6% presentava anticorpi anti-toxoplasma. Si rilevarono anticorpi specifici IgM nel 2,2% delle donne con anti-toxoplasma. 13
5 In uno studio condotto in Norvegia tra il 1992 ed il 1994, al quale parteciparono donne in gravidanza, il 10,9% risultò essere positivo agli anticorpi anti-toxoplasma prima dell inizio della gravidanza. Lo 0,17% delle donne che prima non presentavano l infezione dimostrarono evidenza di infezione primaria durante la gravidanza. 14 Caratteristiche funzionali NOTA: i seguenti dati sono rappresentativi; i risultati dei singoli esperimenti possono variare rispetto a tali dati. Comparazione di metodi BIO-FLASH Toxo IgM è stato valutato in studi comparativi con altri test in commercio. Valutazioni Vennero effettuate due valutazioni, una interna e una esterna, presso il Servei de Microbiologia dell Ospedale Santa Creu i Sant Pau di Barcellona (Spagna). Nello studio interno, 154 campioni di diversa provenienza, tra cui sieri positivi e negativi ad anticorpi IgM anti-toxoplasma, vennero testati con BIO-FLASH Toxo IgM. I risultati furono comparati con quelli ottenuti mediante un metodo EIA Toxo IgM disponibile in commercio. Nello studio esterno, 426 campioni provenienti da fonti diverse, tra cui sieri positivi e negativi ad anticorpi IgM anti-toxoplasma, vennero testati con BIO-FLASH Toxo IgM e confrontati con un metodo MEIA Toxo IgM disponibile in commercio. Sono riportati i risultati complessivi. Nei calcoli non si tenne conto dei risultati indeterminati. Metodo di riferimento BIO-FLASH Toxo IgM IND NEG POS Totale IND NEG POS Totale Si ottennero i seguenti risultati iniziali di sensibilità e specificità relative e concordanza globale: Sensibilità relativa Specificità relativa Concordanza globale N Valore IC del 95% Valore IC del 95% Valore IC del 95% ,7% 81,1% a 94,0% 92,6% 89,8% a 94,9% 91,9% 89,3% a 94,0% I campioni discrepanti vennero analizzati con un metodo ELFA Toxo IgM disponibile in commercio. Tre di loro sono stati risolti a favore del BIO-FLASH Toxo IgM. Dopo il test supplementare si ottennero i seguenti risultati finali di sensibilità, specificità e concordanza globale: Sensibilità finale Specificità finale Concordanza globale finale N Valore IC del 95% Valore IC del 95% Valore IC del 95% ,6% 82,2% a 94,7% 92,9% 90,1% a 95,1% 92,3% 89,7% a 94,3% Un totale di 92 campioni della valutazione esterna provenivano da donne in gravidanza. I dati di sensibilità e specificità sono rimasti simili a quelli della popolazione generale. Pannello CDC Il pannello di sieri umani Toxoplasma 1998 della CDC, composto da 32 campioni di siero positivi e da 65 campioni di siero negativi all IgM anti-toxoplasma, fu analizzato con il test BIO-FLASH Toxo IgM con un risultato di sensibilità del 96,9% e specificità del 93,8%. Precisione Si valutò, in conformità alle direttive CLSI EP05-A, la precisione intra-test e totale (test per test e giorno per giorno) in svariati test. I risultati sono riepilogati nella seguente tabella: Media (S/CO) Intra-test Totale Controllo negativo 0,23 0,031 SD 0,032 SD Controllo positivo 2,53 4,9% CV 7,8% CV Intorno al valore di cut-off 0,82 4,4% CV 6,6% CV
6 Interferenze Studi conformi alle direttive CLSI EP7-A hanno dimostrato che le seguenti sostanze potenzialmente interferenti non alterano i risultati del BIO-FLASH Toxo IgM: Sostanza potenzialmente interferente Concentrazione % Interferenza Emoglobina 500 mg/dl 10 Bilirubina indiretta 18 mg/dl 10 Bilirubina diretta 18 mg/dl 10 Trigliceridi 1300 mg/dl 10 Fattore reumatoide 800 UI/mL 10 Reattività crociata Quando si analizzarono 202 campioni potenzialmente capaci di produrre reattività crociata con il test BIO-FLASH Toxo IgM e si confrontarono i risultati con quelli di test commerciali per Toxo IgM, si evidenziò la seguente concordanza: Reattività incrociata potenziale Concordanza IgM contro la rosolia 5/5 Anti-CMV IgM (anticorpi contro il citomegalovirus) 5/5 Anti-HIV (anticorpi contro il virus dell immunodeficienza umana) 9/9 HAMA (anticorpo umano antimurino) 3/3 SLE (lupus eritematoso sistemico) 8/10 ANA (anticorpi antinucleari) 11/11 Anti-EBV (anticorpi contro il virus di Epstein-Barr) 4/4 Anti-PV B19 (anticorpi contro il Parvovirus B19) 10/10 Anti-HSV 1 (anticorpi contro il virus Herpes simplex di tipo 1) 4/5 Anti-VZV (anticorpi di contro il virus della Varicella-Zoster) 4/4 Paraproteine IgG e IgM 6/6 IgG e IgM elevate 6/6 Anticorpi eterofili 2/4 RF (fattore reumatoide) 10/10 Donne in gravidanza (incluse multipare) 96/110
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