TGS TA CMV IgM REF YB TGS TA CMV IgM

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1 REF YB TGS TA CMV IgM ISTRUZIONI PER L USO IT Italiano FINALITA D USO Il test TGS TA CMV IgM è un test immunologico chemiluminescente (CLIA) per la determinazione quantitativa, con strumentazione TGS TA Analyser o IDS-iSYS Multi-Discipline Automated System, degli anticorpi specifici di classe IgM diretti contro il Citomegalovirus (CMV) in campioni di siero, plasma (EDTA e Sodio Citrato). Questo dosaggio viene impiegato come ausilio diagnostico nella valutazione dello stato immunitario del paziente riferito all infezione da CMV. Questo prodotto deve essere utilizzato in stretta osservanza alle istruzioni riportate nel presente documento da utilizzatori professionali. ATTENZIONE: Qualunque decisione medica non può essere basata sul risultato di questo solo test, ma va fondata sulla valutazione dell insieme di tutti i dati clinici e di laboratorio disponibili. SIGNIFICATO CLINICO Il Citomegalovirus umano (CMV) è un virus appartenente alla famiglia Herpesviridae ed è anche conosciuto come herpesvirus-5 umano (CMV-5). Sebbene il CMV, dopo l infezione primaria, possa permanere in forma latente in diversi tessuti dell organismo, è più frequentemente presente nell epitelio delle ghiandole salivari 1. L infezione da CMV è tipicamente asintomatica nella popolazione immunocompetente, ma può costituire un grave rischio di vita nei pazienti con AIDS ( sindrome da immunodeficienza acquisita ), pazienti soggetti a trapianto e neonati infetti 2. Dopo l infezione primaria, il virus non viene eliminato e rimane persistente in forma latente nell organismo e può riattivarsi quando i sistemi di difesa si indeboliscono. 3 L infezione da CMV è presente in tutte le aree geografiche del mondo. La percentuale di sieropositività è più elevata nelle donne, nelle persone anziane e prevalentemente nei paesi ad alta densità di popolazione e basso livello socioeconomico. La sieroprevalenza mondiale nella popolazione adulta varia dal 40 al 90% 4. Come per altri virus erpetici l infezione primaria da CMV può essere seguita da un infezione cronica o da uno stato latente, da cui il virus può essere riattivato 5. CMV è l agente più comune delle infezioni virali intrauterine ed infetta lo 0,5-2,0% di tutti i neonati nei diversi paesi del mondo 6,7,8. Nelle donne in gravidanza il poter distinguere un infezione primaria da una reinfezione è molto importante, poiché l infezione primaria è estremamente pericolosa per il feto 9. Questo vale anche per IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 1 di 15

2 i pazienti immuno-compromessi, in cui l infezione primaria è spesso accompagnata da sintomi, mentre è abitualmente asintomatica nella reinfezione 10. La diagnosi sierologica dell infezione primaria da CMV si basa sul rilevamento degli anticorpi specifici di classe IgM, sulla dimostrazione della sieroconversione degli anticorpi specifici di classe IgG, o sull incremento della concentrazione degli anticorpi specifici di classe IgG. Poiché sia la sieroconversione della classe IgG che il relativo incremento di concentrazione sono raramente dimostrabili, il rilevamento delle IgM specifiche è il dosaggio sierologico ritenuto più affidabile per diagnosticare un infezione primaria. Comunque in alcune pazienti le IgM possono essere rilevate anche molti mesi dopo l avvenuta infezione ed inoltre possono essere prodotte in seguito a reinfezioni o reattivazioni 11,12. Inoltre risultati falsi positivi possono essere causati da infezioni da altri virus erpetici ed in alcuni casi in pazienti con patologie autoimmuni 13,14. Vale la pena sottolineare che oltre al dosaggio delle IgG ed IgM, la determinazione dell avidità della classe IgG ha un ruolo importante nel differenziare la fase primaria dell infezione dalla fase pregressa 15 e quindi essere estremamente utile nell indagine di sospette infezione da CMV nella donna in gravidanza 16. PRINCIPIO DEL METODO Il kit TGS TA CMV IgM per la determinazione quantitativa delle IgM specifiche anti-cmv utilizza un metodo immunologico indiretto a due step basato sul principio della chemiluminescenza. L antigene specifico è utilizzato per rivestire le particelle magnetiche (fase solida) ed un anticorpo anti-igm umane è marcato con un derivato dell estere di acridinio (coniugato). I campioni sono pre-trattati con un anticorpo anti-igg per rimuovere le possibili interferenze dovute alle immunoglobuline G umane (IgG) e al Fattore Reumatoide (RF). Durante la prima incubazione gli anticorpi specifici presenti nel campione, nei calibratori o nei controlli si legano alla fase solida. Durante la seconda incubazione il coniugato reagisce con gli anticorpi anti-cmv IgM sequestrati dalla fase solida. Dopo ciascuna incubazione il materiale non legato alla fase solida è rimosso mediante aspirazione e susseguente lavaggio. La quantità di coniugato marcato rimasto legato alla fase solida viene valutata mediante attivazione della reazione di chemiluminescenza e misura del segnale luminoso. Il segnale generato, espresso in unità relative di luce (RLU, Relative Light Unit), è indicativo della concentrazione degli anticorpi specifici presenti nel campione, nei calibratori e nei controlli. AUTOMAZIONE Lo strumento TGS TA Analyser esegue in automatico tutte le operazioni previste dal protocollo di dosaggio: aggiunta nel contenitore di reazione dei campioni, calibratori, controlli, particelle magnetiche, coniugato e soluzioni di attivazione della chemiluminescenza; separazione magnetica e lavaggio delle particelle; misura della luce emessa. Il sistema calcola i risultati del dosaggio per i campioni ed i controlli mediante curva di calibrazione memorizzata e stampa un rapporto che include tutte le informazioni relative al dosaggio ed al paziente. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 2 di 15

3 MATERIALI E REAGENTI Materiali e reagenti forniti REAG 1 MP 2,5 ml Particelle magnetiche rivestite con antigene CMV inattivato (ceppo AD 169) in Tampone Fosfato contenente proteine stabilizzanti, Pro-Clin 300 e sodio azide (< 0.1 %) come conservanti. REAG 2 CONJ 25 ml Anticorpo monoclonale di topo anti-igm umane marcato con un derivato dell estere di acridinio (coniugato), in Tampone Fosfato contenente proteine stabilizzanti e sodio azide (< 0.1 %) come conservante. REAG 3 DIL 25 ml Soluzione Diluente Campioni: Tampone Fosfato contenente sieroalbumina bovina, un tensioattivo, un colorante arancione, Pro-Clin 300 e Gentamicina SO 4 come conservanti. REAG 4 SORB 18 ml Siero (di pecora) specifico per eliminare le immunoglobuline G (IgG) e il Fattore Reumatoide (RF) dai campioni, in Tampone Glicina e sodio azide (< 0.1 %) come conservante. REAG 5 CAL A 0,75 ml Siero umano con bassa concentrazione di anticorpi IgM anti-cmv contenente Sodio Azide (<0,1%) come conservante. REAG 6 CAL B 0,75 ml Siero umano con elevata concentrazione di anticorpi IgM anti-cmv contenente Sodio Azide (<0,1%) come conservante. Tutti i reagenti sono pronti per l uso. I reagenti 1, 2, 3 e 4 sono assemblati in un unico insieme che costituisce la cartuccia reagenti. Le concentrazioni dei Calibratori sono espresse in AU/mL (Unità Arbitrarie), tarate contro uno standard di riferimento interno. I valori delle concentrazioni, specifici per lotto di prodotto, sono registrati nel DATA DISK inserito nel kit. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 3 di 15

4 DATA DISK Mini-DVD contenente le informazioni riguardanti tutti i prodotti della Linea TGS TA (Reagenti, Calibratori, Sieri di controllo) aggiornati all ultimo lotto produttivo con l esclusione dei prodotti scaduti alla data di compilazione del nuovo DATA DISK. E sufficiente conservare il DATA DISK con il numero di lotto più elevato per mantenere aggiornate le informazioni richieste per il corretto funzionamento del sistema. Materiali e reagenti richiesti ma non forniti nel kit - TGS TA Analyzer 120 (1) Cod. No. TGS IDS-iSYS Cuvette Cube (1) Cod. No. IS-CC1000 Confezione da 960 cuvette. - IDS-iSYS System Liquid (2) Cod. No. IS-CS bottiglia da 5 litri di soluzione, pronta all uso. - IDS-iSYS Wash Solution (2) Cod. No. IS-CW bottiglia da 10 litri di soluzione, pronta all uso. - IDS-iSYS Trigger Set (2) Cod. No. IS-CT flacone da 250 ml di Trigger A (soluzione di preattivazione) 1 flacone da 250 ml di Trigger B (soluzione di attivazione) - TGS TA D-SORB Solution Cod. No. YC Confezione da 2 bottiglie da 1 litro di soluzione pronta per l uso. - IDS-iSYS Cartridge Checking System (2) Cod. No. IS TGS TA ImmunoCleaner Cod. No. YC flaconi da 27 ml ciascuno - TGS TA Top Cap Set Cod. No. YC tappi superiori rossi per la chiusura dei contenitori dei calibratori dopo il primo utilizzo. (1) Fabbricato da IDS France SAS, 42 rue Stéphane Mazeau, Pouilly en Auxois, France e distribuito da Technogenetics Srl. (2) Fabbricato da IDS SA, rue Ernest Solvay, 4000 Liège, Belgique e distribuito da Technogenetics Srl. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 4 di 15

5 Altri Reagenti Raccomandati TGS TA CMV Control Set Cod. No. YB fiale da 1,5 ml di siero umano negativo e 3 fiale da 1,5 ml di siero umano positivo per anticorpi anti-cmv. AVVERTENZE E PRECAUZIONI I reagenti forniti nel kit TGS TA CMV IgM sono solo per uso diagnostico in vitro e non per uso in vivo in uomini o animali. Questo prodotto deve essere utilizzato in stretta osservanza alle istruzioni riportate nel presente documento da utilizzatori professionali. Technogenetics non può essere ritenuta responsabile di perdite o danni generati da un uso non conforme alle istruzioni fornite. Precauzioni di sicurezza Questo prodotto contiene materiale di origine animale e pertanto deve essere manipolato come se contenesse agenti infettanti. Questo prodotto contiene componenti di origine umana. Tutte le unità di siero o plasma utilizzate per la fabbricazione dei reagenti di questo kit sono state analizzate con metodi FDA approvati e trovate non reattive per la presenza di HBsAg, anti-hcv, anti-hiv1 ed anti-hiv2. Tuttavia, poiché nessun metodo di analisi è in grado di garantire l assenza di agenti patogeni, tutto il materiale di origine umana deve essere considerato potenzialmente infetto e manipolato come tale. In caso di imballaggio danneggiato con fuoriuscita dei reagenti provvedere alla decontaminazione dell area interessata con una soluzione diluita di Ipoclorito di Sodio dopo essersi protetti con idonei dispositivi di protezione individuale (camice, guanti, occhiali). Provvedere allo smaltimento del materiale utilizzato per la pulizia e dei rifiuti di imballaggio coinvolti nella fuoriuscita, in base alle norme nazionali per lo smaltimento dei rifiuti potenzialmente infetti. In caso di imballaggio danneggiato con fuoriuscita di liquido, i reagenti non devono essere utilizzati per l esecuzione dei dosaggi. Alcuni reagenti contengono sodio azide come conservante. Poiché la sodio azide può reagire con piombo, rame e ottone piombato formando azidi esplosive nelle tubature, si raccomanda di non eliminare reagenti o rifiuti negli scarichi ma di seguire le norme nazionali in materia di smaltimento rifiuti potenzialmente pericolosi. Precauzioni operative Per ottenere risultati affidabili è necessario attenersi strettamente alle presenti Istruzioni per l uso e seguire scrupolosamente quanto indicato nel manuale operativo dello strumento. I reagenti forniti nel kit devono essere utilizzati esclusivamente con il sistema TGS TA Analyzer. I componenti della cartuccia reagenti non possono essere rimossi dalla cartuccia e riassemblati. Non usare il kit oltre la data di scadenza. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 5 di 15

6 PREPARAZIONE DEI REAGENTI I reagenti forniti nel kit sono tutti pronti per l uso. CONSERVAZIONE E STABILITA DEI REAGENTI Conservare i reagenti forniti nel kit a 2-8 C in posizione verticale ed al buio. In queste condizioni la cartuccia reagenti ed i calibratori non aperti sono stabili sino alla data di scadenza. La cartuccia reagenti dopo apertura può essere utilizzata per 60 giorni se conservata in frigorifero a 2-8 C oppure a bordo macchina. I calibratori dopo apertura possono essere utilizzati per 60 giorni se conservati in frigorifero a 2-8 C e se la permanenza a bordo non supera le 6 ore per seduta. Non congelare i reagenti ed i calibratori. PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio deve essere eseguito su campioni umani di siero e plasma ( EDTA o Sodio Citrato). Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, emolizzati e torbidi. Se il dosaggio viene eseguito dopo più di 8 ore, separare il siero dal coagulo, dai globuli rossi e dalle provette di separazione con gel. Prima di essere analizzati i campioni possono essere conservati in frigorifero a 2-8 C per 7 giorni al massimo. Se il dosaggio viene eseguito dopo più di 7 giorni, conservare i campioni congelati (< - 20 C). Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. PROCEDIMENTO OPERATIVO Per ottenere prestazioni analitiche affidabili attenersi scrupolosamente alle istruzioni riportate nel manuale operativo dello strumento. Caricamento dei reagenti Tutti i reagenti forniti nel kit sono pronti per l uso. Prima di inserire la cartuccia reagenti nel sistema, il contenitore delle particelle magnetiche deve essere agitato per rotazione orizzontalmente in modo da favorire la risospensione delle particelle. Eseguire l operazione evitando la formazione di schiuma. Posizionare la cartuccia reagenti nell area reagenti dello strumento utilizzando l apposita guida e lasciare in agitazione per almeno 1 ora prima dell uso. Il posizionamento della cartuccia reagenti determina contemporaneamente la lettura del codice a barre identificativo. In caso di danneggiamento dell etichetta della cartuccia o in caso di mancata lettura, i dati identificativi della cartuccia reagenti possono essere inseriti manualmente. Lo strumento mantiene automaticamente in agitazione continua le particelle magnetiche. Se la cartuccia reagenti viene rimossa dallo strumento, conservarla verticalmente al buio a 2-8 C. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 6 di 15

7 Caricamento dei calibratori I calibratori TGS TA sono pronti per l uso. Lasciare i calibratori a temperatura ambiente per 10 minuti ed agitare delicatamente il contenuto, manualmente o mediante vortex, evitando la formazione di schiuma. Nel caso i calibratori fossero utilizzati per la prima volta, eliminare il sigillo di garanzia ed il tappo bianco di chiusura prima del loro inserimento sullo strumento. Nel caso i calibratori fossero già stati utilizzati, il contenitore sarà provvisto del tappo superiore (tappo rosso) senza il sigillo di garanzia. Eliminare il tappo di chiusura rosso prima del loro inserimento sullo strumento. Inserire nello strumento i calibratori nell area campioni; per la loro identificazione sullo strumento consultare il manuale d uso dello strumento. I dati del bar code devono essere inseriti manualmente in caso di danneggiamento dell etichetta o in caso di mancata lettura. I valori della concentrazione degli anticorpi IgM anti-cmv presente nei calibratori sono registrati nel DATA DISK ed automaticamente trasferiti nell analizzatore. Al termine della seduta i contenitori dei calibratori devono essere chiusi con gli appositi tappi superiori (tappi rossi) e trasferiti a 2-8 C sino al loro successivo impiego. I calibratori possono essere utilizzati per un massimo di quattro volte. Caricamento dei controlli Inserire i controlli nell area campioni dello strumento. Per la loro identificazione sullo strumento consultare il manuale d uso dello strumento. In caso di mancanza del bar code sul controllo o in caso di mancata lettura, i dati identificativi del controllo possono essere inseriti manualmente. Qualora siano utilizzati i Controlli TGS TA, consultare le relative istruzioni d uso. I valori della concentrazione degli anticorpi IgM anti-cmv presente nei controlli TGS TA sono registrati nel DATA DISK ed automaticamente trasferiti nell analizzatore. Selezionare per ogni controllo i parametri richiesti. Caricamento dei campioni Inserire i campioni nello strumento, nell area campioni; per la loro identificazione sullo strumento consultare il manuale d uso dello strumento. In caso di mancanza del bar code sul campione o in caso di mancata lettura, i dati identificativi del campione possono essere inseriti manualmente. Selezionare per ogni campione i parametri richiesti. Calibrazione Lo strumento TGS TA Analyzer utilizza una curva di calibrazione memorizzata (master curve), generata dal produttore per ogni lotto di cartuccia reagenti. I parametri delle master curve, unitamente ai valori delle concentrazioni dei calibratori, sono memorizzati nel DATA DISK e trasferiti nel database dello strumento. I calibratori A e B sono utilizzati per ricalibrare la master curve in funzione sia dello strumento utilizzato che dei reagenti a bordo. Per eseguire la ricalibrazione analizzare in triplicato i due calibratori A e B ed in singolo i controlli. I valori di concentrazione ottenuti con i controlli permettono di validare la nuova calibrazione. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 7 di 15

8 Una volta che la ricalibrazione della master curve sia stata accettata e memorizzata, tutti i campioni successivi possono essere analizzati senza ulteriore calibrazione, tranne nei seguenti casi: - quando è caricata a bordo dello strumento una cartuccia reagenti con un nuovo lotto; - quando i valori dei controlli non rientrano nell intervallo di accettabilità; - quando è eseguita la procedura di manutenzione dello strumento; - quando è scaduta la validità della master curve ricalibrata. La validità della master curve ricalibrata per il kit TGS TA CMV IgM è di 21 giorni. La gestione della ricalibrazione è attuata in automatico dallo strumento. Dosaggio Premere il tasto di avvio. 1. Il sistema aspira, 100 µl di Diluente Campioni, 20 µl di Particelle Magnetiche, 86 µl di Diluente Campioni e 18 µl di Calibratori, Campione o Controllo. I Campioni e i Controlli sono pretrattati a bordo in diluizione 1:14 con il reagente Sorbent. Le soluzioni e la sospensione aspirate sono dispensate nella cuvetta di reazione. 2. La cuvetta di reazione è incubata nel rotore a 37 C per 20 minuti. 3. Dopo questa fase di incubazione, le particelle magnetiche sono separate e lavate. 4. Nella cuvetta vengono dispensati 200 µl di coniugato. 5. La cuvetta di reazione è incubata nel rotore a 37 C per 10 minuti. 6. Dopo questa ultima fase di incubazione, le particelle magnetiche sono separate e lavate e la cuvetta viene trasferita nella camera di lettura. 7. La quantità di coniugato legato alla fase solida, espressa in RLU, è direttamente proporzionale alla concentrazione di IgM anti-cmv presente nel campione. 8. Le risposte ottenute sono interpolate sulla curva di taratura e trasformate in concentrazioni. CONTROLLO QUALITA Per assicurare la validità del dosaggio, sieri di controllo a differenti livelli di concentrazione (almeno un siero negativo ed un siero positivo) devono essere misurati ogni giorno in cui si esegue il dosaggio. Se il proprio laboratorio richiede, per la verifica dei risultati del dosaggio, un uso più frequente o un numero più elevato di controlli, seguire le procedure del controllo qualità ivi stabilite. Se vengono utilizzati i sieri di controllo TGS TA, i valori medi attesi ed i limiti di accettabilità sono quelli riportati nel DATA DISK presente anche nella confezione dei controlli. Qualora venissero utilizzati sieri di controllo diversi, è necessario, prima del loro impiego, definire i valori attesi con reagenti e sistema TGS TA. Qualora il valore dei controlli non rientri nel range di accettabilità specificato, i relativi risultati del dosaggio non sono validi ed i rispettivi campioni devono essere rianalizzati. In questo caso è necessario eseguire prima della ripetizione del dosaggio una procedura di ricalibrazione. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 8 di 15

9 CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Calcolo dei risultati La concentrazione degli anticorpi IgM anti-cmv presente nei campioni in esame è calcolata automaticamente dal sistema. I valori possono essere visualizzati mediante lettura sul video o attraverso stampa. I valori sono espressi in AU/mL. Il calcolo della concentrazione di analita nel campione avviene attraverso lettura della risposta ottenuta per ogni campione su una curva di calibrazione elaborata mediante un sistema di fitting logistico a quattro parametri (4PL, Y ponderato), corretta periodicamente in funzione delle risposte ottenute nel dosaggio dei calibratori. Per informazioni dettagliate su come il sistema calcola i risultati, consultare il manuale operativo del sistema. Interpretazione dei risultati Il range di misurabilità del dosaggio TGS TA CMV IgM è: AU/mL. I valori inferiori a 0.0 AU/mL sono valori estrapolati,compare il messaggio OMR- e/o ORA e sono riportati con valore uguale a 0.0 AU/mL. I valori superiori a 200 AU/mL hanno il messaggio OMR+ e/o ORA e possono essere ritestati dopo opportuna diluizione. I risultati dei campioni possono essere interpretati nel seguente modo: (AU/mL) Interpretazione < 6 Il campione è da considerare Negativo per la presenza di IgM anti-cmv 6 Il campione è da considerare Positivo per la presenza di IgM anti-cmv I valori sopra riportati sono da considerare solo valori suggeriti. Ciascun laboratorio deve stabilire i propri intervalli di riferimento. LIMITI DEL DOSAGGIO Per scopi diagnostici, i risultati ottenuti con il kit TGS TA CMV IgM ed il sistema TGS TA Analyzer devono essere utilizzati unitamente agli altri dati clinici e di laboratorio a disposizione del medico. La contaminazione batterica dei campioni e l inattivazione al calore possono influenzare il risultato del dosaggio. Gli anticorpi eterofili presenti nei campioni di siero umano possono reagire con i reagenti a base di immunoglobuline, causando interferenze nei dosaggi immunologici in vitro. Questi campioni possono dar luogo a valori anomali se analizzati con il kit TGS TA CMV IgM. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 9 di 15

10 VALORI ATTESI Sono stati analizzati 62 campioni selezionati non immuni per verificare l assenza di anticorpi IgM anti-cmv. Tutti i campioni analizzati sono risultati negativi, con un valore medio di 0,4 AU/mL ed una deviazione standard di 0,7 AU/mL. Con i risultati ottenuti è stato calcolato il Limit of Blank (LoB = il più alto valore che possiamo attenderci in una serie di campioni che non contengono l analita). Il Limit of Blank, determinato come 95 percentile della popolazione negativa, è risultato pari a 1,3 AU/mL con il Lotto di reagenti n. 2. SPECIFICITÀ E SENSIBILITÀ DIAGNOSTICA Utilizzando i test TGS TA CMV IgG, TGS TA CMV IgM e TGS TA CMV IgG Avidity è possibile valutare lo stato immunitario del paziente riguardo l infezione da Citomegalovirus. Nella seguente tabella sono riportati i profili sierologici dei tre test CMV IgG, CMV IgM e CMV IgG Avidity che possono essere rilevati durante la fase infettiva e la relativa interpretazione rispetto all esposizione al parassita. IgG anti-cmv IgM anti-cmv IgG Avidity anti- CMV (test di 2 livello) Interpretazione Negativo Negativo -- Non immune (suscettibile all infezione) Negativo Positivo -- Sospetta infezione primaria in atto Positivo Positivo Bassa Avidità Recente Infezione primaria (presumibile infezione primaria acquisita nei 3 mesi precedenti il prelievo del campione) Positivo Positivo Alta Avidità Infezione recente o pregressa con persistenza delle IgM (presumibile infezione passata acquisita più di 3 mesi prima del prelievo del campione) Positivo Negativo Alta Avidità Infezione pregressa Utilizzando i test TGS TA CMV IgG, TGS TA CMV IgM e TGS TA CMV IgG Avidity sono state valutate la specificità e sensibilità diagnostica nella seguente popolazione di campioni selezionati, esaminati con diversi metodi e classificati in base alla regola del consenso generale: campioni di altrettanti pazienti non immuni - 86 campioni da 25 pazienti infetti da CMV in monitoraggio e follow up. Di questi 86 campioni, 60 sono stati prelevati entro 3 mesi dalla comparsa dei sintomi e sono stati utilizzati per valutare il grado di Avidità delle IgG, mentre 45 campioni prelevati entro due mesi dalla comparsa dei sintomi sono stati impiegati per valutare la sensibilità clinica delle IgM campioni da altrettanti pazienti infettati da più di 3 mesi dalla comparsa dei sintomi. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 10 di 15

11 Seguendo l interpretazione sopra riportata è stato possibile calcolare la specificità e sensibilità diagnostica relativamente ai gruppi valutati. Dei 117 pazienti non immuni, 114 avevano valori di IgG inferiori al cut off del metodo TGS TA CMV IgG e 116 avevano IgM inferiori al cut-off del metodo TGS TA CMV IgM. La specificità diagnostica dei metodi per IgG e IgM in pazienti non immuni è stata del 97.4% per IgG (Intervallo di Confidenza al 95%: %) e 99.1% per IgM (Intervallo di Confidenza al 95%: %). Dei 116 campioni (86 e 30) di pazienti infettati da CMV in monitoraggio e follow-up, il metodo TGS TA CMV IgG ha mostrato 116 risultati positivi, con sensibilità del 100.0% (Intervallo di Confidenza al 95%: 96.0% %). Dei 45 campioni di pazienti con infezione in atto prelevati entro 60 giorni dai sintomi, il metodo TGS TA CMV IgM ha mostrato 44 risultati positivi e 1 negativo con sensibilità diagnostica del 97.8% (Intervallo di Confidenza al 95%: %). Con il metodo TGS TA CMV IgG Avidity, sono stati analizzati 60 campioni di pazienti con la comparsa dei sintomi nei tre mesi precedenti il prelievo, mostrando 57 campioni a bassa avidità, 2 a moderata e 1 ad alta avidità. Dei 30 campioni di pazienti con la comparsa dei sintomi da più di tre mesi dal prelievo, tutti erano positivi per IgG mostrando una sensibilità clinica del 100%, 1 paziente era positivo anche per IgM e tutti i campioni presentavano alta avidità con il metodo TGS TA CMV IgG Avidity. PRESTAZIONI Avvertenza: i dati presentati non rappresentano le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal produttore. Precisione e Riproducibilità La precisione e riproducibilità del kit TGS TA CMV IgM sono state valutate impiegando un protocollo basato sulle linee guida del documento EP5-A2 del Clinical and Laboratory Standards (CLSI). La precisione è stata calcolata analizzando i risultati di 20 replicati di quattro sieri (uno negativo e tre positivi con diverse concentrazioni di anti-cmv IgM) eseguiti con due diversi lotti di reagenti nella stessa seduta sperimentale. La concentrazione del siero anti-cmv IgM negativo (CMM-N1) è risultata compresa nell intervallo fra 1,1 e 2,0 e fra 0.8 e 1,7 AU/mL con il lotto di reagenti n. 1 e 3 risepttivamente. In Tabella si riportano i risultati ottenuti con i 3 sieri positivi. IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 11 di 15

12 Campione Reagenti Lot. no. Concentrazione media (AU/mL) SD (AU/mL) CV % 1 54,4 3,35 6,2 3 50,7 3,64 7,2 1 77,5 5,59 7,2 3 67,3 6,86 10,2 1 93,9 7,33 7,8 3 96,7 9,59 9,9 La riproducibilità è stata calcolata analizzando i risultati della determinazione di cinque sieri (uno negativo e quattro positivi con diverse concentrazioni di anti-cmv IgM) eseguita in 14 sedute diverse, con tre lotti di reagenti. La concentrazione del siero anti-cmv IgM negativo (CMM-N1) è risultata compresa nell intervallo fra 0,0 e 1,4 AU/mL. In Tabella si riportano i risultati ottenuti con i 4 sieri positivi. Campione Concentrazione media (AU/mL) SD (AU/mL) CV % 1 26,2 2,27 8,7 2 36,7 2,93 8,0 3 51,5 5,33 10,3 4 79,7 8,34 10,5 Linearità delle Diluizioni La linearità delle diluizioni del kit TGS TA CMV IgM è stata valutata impiegando un protocollo basato sulle linee guida del documento EP6-A del Clinical and Laboratory Standards (CLSI). Sono state dosate diluizioni scalari di 3 sieri a concentrazione elevata di IgM anti-cmv, eseguite con un siero negativo per IgM anti-cmv. I risultati di questo studio sono riassunti nella seguente tabella. Campione Fattore di diluizione Concentrazione misurata (AU/mL) Concentrazione attesa (AU/mL) Recovery % ,4 (100,0) ,2 92, ,6 72, , ,4 77,4 (100,0) 2 38,0 38,7 98,2 4 17,2 19,4 88,7 8 8,5 9,7 87,6 16 3,7 4, ,6 180,6 (100,0) 2 70,6 90,3 78,2 4 38,6 45,2 85,4 8 20,7 22,6 91, ,2 11,3 90,3 IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 12 di 15

13 In ogni caso si rende necessario sottolineare che non tutti i sieri, quando misurati a diluizioni diverse, possono fornire risultati lineari all interno dell intervallo di misurabilità essendo il risultato dipendente non solo dalla concentrazione ma anche dall affinità degli anticorpi presenti nel campione. Sensibilità Analitica La sensibilità analitica del kit TGS TA CMV IgM, è stata valutata utilizzando due protocolli basati sulle linee guida del documento EP17-A del Clinical and Laboratory Standards (CLSI). In un caso espressa come limite di rilevazione (Limit of Detection LoD: ossia la più piccola quantità di analita che il metodo è in grado di misurare) si è applicata la formula per il calcolo LoD = LoB + C β SD s (dove LoB rappresenta il valore del Limit of Blank, SD s la deviazione standard stimata della distribuzione del campione a bassa concentrazione e C β è derivato dal 95 percentile della distribuzione standard gaussiana). Sono stati utilizzati 3 campioni a bassa concentrazione di analita, determinati in singolo con un Lotto di reagenti in 14 esperimenti diversi. Il Limite di rilevazione del kit TGS TA CMV IgM è risultato pari a 4,4 AU/mL. Nell altro protocollo è previsto il calcolo della Minima Concentrazione misurabile o MDC (Minimum Detectable Concentration): sono stati utilizzati 20 replicati della soluzione dello Standard 0 AU/mL della curva Master. Si sono elaborate la media e la deviazione standard (DS) su un lotto di kit. Il valore di RLU relativo alla media DS è stato interpolato sulla curva e se ne è ricavata la relativa concentrazione. La sensibilità analitica espressa come Minima Concentrazione misurabile è 0,9 AU/mL. I valori del limite di rilevazione, unitamente a considerazioni di carattere clinico ed ai risultati di comparazione con metodi di riferimento hanno contribuito alla definizione del valore cut-off. Specificità Analitica: Interferenze Uno studio basato sulle linee guida del documento EP7-A2 del CLSI ha dimostrato che le prestazioni del dosaggio non sono influenzate dalla presenza nel campione delle sostanze potenzialmente interferenti elencate nella seguente tabella, sino alla concentrazione sperimentata. Sostanze Potenzialmente Interferenti Bilirubina libera Bilirubina coniugata Emoglobina Trigliceridi Massima concentrazione sperimentata 20 mg/dl 20 mg/dl 1000 mg/dl 3000 mg/dl L uso di campioni lipemici, emolizzati o torbidi viene comunque sconsigliato. Specificità Analitica: Reazioni crociate Per valutare le potenziali reazioni crociate dell antigene utilizzato per sensibilizzare le microparticelle, è stato condotto uno studio con 73 campioni, di cui 48 tutti con anticorpi IgM positivi per antigeni erpetici ed antigeni IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 13 di 15

14 del complesso TORCH, 8 positivi al Fattore Reumatoide (RF) e 25 campioni positivi per alcuni anticorpi presenti in patologie autoimmuni (ANA) ma tutti IgM negativi per CMV. I campioni utilizzati erano così suddivisi: 4 Rubella, 18 Toxoplasma, 6 EBV VCA-M, 5 HSV, 2 Mumps (Parotite), 2 VZV, 3 Sifilide, 8 con Fattore Reumatoide (RF), 2 anti-dsdna, 2 anti Centromero B, 2 anti Jo-1, 2 anti Scl-70, 2 anti SS-B/La, 2 anti SS-A/Ro, 2 anti U1-snRNP, 2 anti Sm, 9 anti β2-glicoproteina e Cardiolipina. Lo studio non ha mostrato alcuna significativa reazione crociata dell antigene in fase solida con gli altri anticorpi. Si suggerisce di valutare con attenzione campioni con fattore reumatoide (RF) superiore a 500 IU/mL. Effetto saturazione ad alte dosi Alcuni metodi immunologici impiegati per la determinazione di campioni contenenti l analita a concentrazioni estremamente elevate possono fornire livelli apparenti di analita sottostimati (Effetto hook). Il metodo utilizzato nel kit TGS TA CMV IgM, essendo un metodo a due incubazioni, non risente di tale effetto. Un campione con concentrazione estremamente elevata (al di sopra dell intervallo di misura) di IgM anti- CMV ha confermato l assenza di effetto hook sino alla concentrazione di 355 AU/mL. Sensibilità e Specificità Relative La presenza di anticorpi anti-cmv IgM è stata determinata utilizzando il kit TGS TA CMV IgM ed un metodo di dosaggio immunochemiluminescente disponibile in commercio in 417 campioni. 13 campioni hanno dato luogo a risultati discordanti tra il dosaggio TGS TA ed il dosaggio disponibile in commercio. La concordanza relativa è risultata pertanto essere pari al 96,9% (Intervallo di Confidenza al 95%: 94,6 98,3%) (404/417). La sensibilità relativa è risultata pari a 84.6% (Intervallo di Confidenza al 95%: 73,1 92,0%) (55/65). La specificità relativa è risultata pari a 99,1% (Intervallo di Confidenza al 95%: 97,3 99,8%) (349/352). BIBLIOGRAFIA 1. Koichi Y,Arvin AM, G. Campadelli-Fiume, Mocarski E, Moore P, Roizman B, Whitley R ( 2007 ). Human herpesviruses : biology,therapy and immunoprophylaxis. Cambridge,UK : Cambridge University Press. ISBN Ryan KJ, Ray CG ( editors ) ( 2004 ). Sherris Medical Microbiology ( 4 th ed. ). McGraw Hill. Pp. 556; ISBN Hummel M, Abecassis MM. A model for reactivation of CMV from latency. J. Clin. Virol. 2002; 25 Suppl 2 : S Dowd JB, Aiello AE, Alley DE ( 2009 ). Socioeconomic disparities in the seroprevalence of cytomegalovirus infection in the US population: NHANES III. Epidemiol. Infect., 137: Sweet C. The pathogenicity of Cytomegalovirus. FEMS Microbiol. Rev.,23 : IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 14 di 15

15 6. Azam AZ, Vial Y, Fawer CL,Zufferey J, Hohlfeld P. Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. Obstet. And Gynec., 97: , Stagno S, Pass RF, Cloud G et al. Primary Cytomegalovirus infection in pregnancy. Incidence, transmission to fetus and clinical outcome. J. Amer. Med. Ass., 256: , Lazzarotto T,Gabrielli L, Lanari M, Guerra B, Bellucci T, Sassi M, Landini MP. Congenital cytomegalovirus infection: recent advances in the diagnosis of maternal infection. Hum. Immunol May; 65(5) : Van De Meer JTM, Drew WL, Bowden RA et al. Summary of the international consensus symposium on advances in the diagnosis, treatment and prophylaxis of cytomegalovirus infection. Antivir. Res., 32: , Lazzarotto T, Spezzacatena P, Pradelli P. et al. Avidity of immunoglobulin G directed again human cytomegalovirus during primary and secondary infections in immunocompetent and immnucompromised patients. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 4: , Söderberg-Nauclé C, Fish KN, Nelson JA. Reactivation of latent human cytomegalovirus by allogenic stimulation of blood cells from healthy donors. Cell 1997; 91: Ross SA, Arora N, Novak Z, et al. Cytomegalovirus reinfections in healthy seroimmune women. J Infect Dis 2010; 201: Deyi YM, Goubau P, Bodéus M. False positive IgM antibody tests for cytomegalovirus in patients with acute Epstein-Barr virus infection. Europ. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 19: , Rawlinson WD. Broadsheet number 50 : Diagnosis of human cytomegalovirus infection and disease. Pathology,31 : , Chakravarti A, Kashyap B, Wadhwa A. Relationship of IgG avidity and IgM levels for the differential diagnosis of primary from recurrent cytomegalovirus infections. Iran J Allergy Asthma Immunol 2007; 684) : Grangeot-Keros L, Mayaux MJ, Lebon P. et al.. Value of cytomegalovirus IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175 : ,1997. TECHNOGENETICS S.r.l. Via Vanvitelli, Milano Italia IFU047TGS TA Versione: 01_IT 16 Settembre 2014 Pagina 15 di 15