Fingerprinting del pane : tecniche di analisi d immagine per la caratterizzazione, tracciabilità e rintracciabilità.

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1 Fingerprinting del pane : tecniche di analisi d immagine per la caratterizzazione, tracciabilità e rintracciabilità. Grillo Oscar, Orlando Annamaria, Raimondo Ignazio, Venora Gianfranco Stazione Sperimentale di Granicoltura per la Sicilia Via Bouganvillea, Caltagirone lab.biologia@granicoltura.it Introduzione Il pane è costituito da pochi e semplici ingredienti. Farina, acqua, lievito e sale, mescolati tra loro, formano l impasto, che dopo essere stato bene amalgamato, trasformato dalla lievitazione e plasmato nella forma voluta, conoscerà i calori del forno per tramutarsi in pane quotidiano. Durante il processo di lievitazione, la CO 2 prodotta, dopo aver raggiunto condizioni di saturazione, si raccoglie in bolle e rimane intrappolata nei reticoli glutinici (gliadine e glutenine) formatisi durante l impasto della farina con l acqua, determinandone la sofficità propria del prodotto cotto (Riva et al., 2004). Si assiste quindi alle modifiche delle proprietà reologiche dell impasto: esso prende forza, risulta meno estensibile, diventando così in grado di mantenere la forma (Chargelegue et al., 1994). Sulla base di quanto detto, risulta evidente che il comportamento dell impasto durante la fase di lievitazione è in stretta relazione sia all attività di fermentazione dei lieviti impiegati, sia alle caratteristiche intrinseche della farina utilizzata, nonché alle tecniche di lavorazione impiegate (Boggini & Pogna, 1989; Kihlberg et al., 2004; 2006). Pertanto la struttura della mollica dei pani è un fattore importante per valutare la qualità dei prodotti da forno (Rouillé et al., 2005) Il controllo della qualità è fondamentale per tutte le industrie agro-alimentari; nelle industrie cerealicole, in particolare, le materie prime sono infatti eterogenee e variabili, mentre i processi di trasformazione sono complessi e richiedono un costante controllo. Molto spesso questi controlli si basano su analisi soggettive e poco ripetibili. Il controllo della qualità delle materie prime, tramite analisi d'immagine, è un settore in pieno sviluppo. Queste, infatti, possono essere caratterizzate anche dal loro aspetto esteriore come ad esempio il colore, la forma e la dimensione. Inoltre, l'aspetto dei prodotti finali influenza notevolmente la scelta e soddisfazione del consumatore. Gli apparecchi di acquisizione e archiviazione delle immagini ed i computer necessari per realizzare questi controlli, basati su tecniche di analisi d immagine, hanno attualmente un prezzo abbordabile per numerose industrie. (Anonimo, 1994; Sapirstein et al., 1994) Il pane in Italia, come in altre nazioni, è quasi esclusivamente prodotto con farina di grano tenero. In alcune regioni del meridione (Puglia e Sicilia) viene maggiormente utilizzata la farina rimacinata di frumento duro. Inoltre, per alcuni pani tipici, vengono utilizzate specifiche varietà locali, quali ad esempio il Ruscello per la produzione di Pane a Pasta Dura in provincia di Ragusa e la Timilia per il Pane Nero di Castelvetrano (TP) che è un presidio Slow Food (Bordo & Surrusca, 2002; Spina et al., 2006). Recentemente sono state attribuite, per la categoria commerciale prodotti da forno, la prima IGP al Pane Casereccio di Genzano (RM), prodotto con farina di frumento tenero (Reg. CE n. 2325/97 del ) e la prima DOP al Pane d Altamura (BA), che è esclusivamente prodotto con farina di alcune specifiche varietà di frumento duro (Reg. CE n del ) (Simeone et al., 2001). Quindi è importante anche per prodotti quali il pane, avere dei metodi analitici, che possano assicurare la tracciabilità e rintracciabilità delle materie prime, per evitare adulterazioni e frodi, in particolare per quei prodotti di elevato pregio quali quelli con marchio di protezione CE. Un metodo analitico deve essere preciso, veloce, ripetibile e a basso costo come ad

2 esempio l analisi d immagine, che si è dimostrata uno tra i metodi che meglio soddisfano le esigenze dell industria agro-alimentare (Brosnan & Sun 2004; Du & Sun 2004; 2006; Sun 2006) Poiché, come precedentemente ricordato, il pane mantiene le sue caratteristica strutturali acquisite con la lievitazione anche dopo la cottura, è possibile utilizzare le immagini delle fette di pane per studiarne la struttura intrinseca. Per verificare se le tecniche di analisi d immagine, allorché forniscono parametri oggettivi, sono capaci di caratterizzare e tipizzare anche i pani realizzati con protocolli standard e specifiche farine monovarietali o miscele, è stato condotto questo studio. Materiali e metodi Sono stati esaminati dieci campioni di farine (Tab. 1): una miscela di frumento tenero già confezionata per la grande distribuzione (1), quattro miscele di frumento duro rimacinato (3, 4, 5 e 6), una miscela di frumento tenero (9), e quattro farine ottenute da campioni monovarietali (2, 7, 8 e 10). Le miscele 3 e 9, nonché le quattro farine monovarietali, sono state molite con molino sperimentale Bülher ML 202, le altre invece, provenivano da diversi molini della Sicilia. È stata utilizzata anche la farina della varietà locale Timilia (10), una antica cultivar di frumento primaverile siciliano, utilizzata per la produzione del tipico Pane Nero di Castelvetrano. Sono stati registrati i parametri chimici e reologici dei campioni. L umidità è stata determinata con una termobilancia Bühler-Miag MLI1000 (Milan, Italy), secondo il metodo indicato nella G.U. n. 145/85. Il contenuto proteico è stato determinato chimicamente secondo la metodologia Kjeldhal AACC 47-12, utilizzando un sistema Gerhardt Vapodest (Bonn, Germany) con titolatore automatico, associato ad un sistema di digestione Gerhardt Turbosog (Bonn, Germany) per la mineralizzazione dell azoto presente nel campione sotto forma di solfato d ammonio (NH 4 ) 2 SO 4. Per rapportare il valore ottenuto alla percentuale di azoto proteico in sostanza secca, il tenore di azoto riscontrato è stato moltiplicato per il fattore di correzione 6,25. Il contenuto in ceneri è stato determinato in muffola seguendo la metodica indicata dal Regolamento CE 1501/95. L indice di glutine è stato determinato con il sistema Falling Number Glutomatic 2200 (Hudding, Sweden), corredato di centrifuga Falling Number Centrifuge 2015 (Hudding, Sweden) e piastra riscaldante Falling Number Glutork 2020 (Stockholm, Sweden), seguendo il metodo ICC No. 138, che prevede l estrazione meccanica del glutine umido e la successiva determinazione della sua forza. Gli indici alveografici sono stati determinati con Alveografo di Chopin MA 95 (Villeneuve La Garenne, France), secondo le indicazioni dei metodi AACC n e ICC Standard No Successivamente è stato utilizzato il Farinografo-E Brabender GmbH & Co. (Duisburg, Germany) con vasca da 300 g, per la determinazione della quantità di acqua da impiegare nell impasto (1 mix secco + 12 impasto). Gli impasti sono stati ottenuti utilizzando la vasca dell Alveografo di Chopin, e le cinque formelle, ottenute secondo la procedura Chopin, sono state chiuse in capsule Petri in modo da confinare lo sviluppo in altezza (1 cm spazio interno) ma non in larghezza. Contemporaneamente, un altro impasto di 300 g, ottenuto utilizzando la vasca del Farinografo, è stato ripartito in tre contenitori per pane in cassetta da 100 g ciascuno. Tutti gli impasti sono stati posti a lievitare a 30 C per 40 e u.r. 70%, nella cella di lievitazione termostatata, ventilata ed umidificata, annessa al forno Polin mod. Wind Pierre (Verona, Italy) a sei platee utilizzato per la cottura dei pani. Gli impasti sono stati realizzati sulla base delle seguenti dosi: 250 g di farina monovarietale o miscela, acqua di idratazione in funzione dell assorbimento della farina valutata al test farinografico, 6,3 g di lievito di birra compresso (Zeus I.B.A. SpA - Firenze), 11,2 g di strutto (Fiorucci), 5 g di sale.

3 La valutazione della cinetica di lievitazione degli impasti e l analisi morfo-colorimetrica delle fette di pane, sono state condotte mediante un sistema di analisi d immagine computerizzata con la seguente configurazione: uno scanner piano (ScanMaker 9800XL, Microtek Denver, CO), un PC con processore Pentium 4 e Sistema Operativo Windows XP Professional. Il sistema utilizza un TWAIN di acquisizione per la cattura delle immagini (ScanWizard, Microtek Denver, CO), gestito dal software KS-400 V.3.0 (Carl Zeiss, Vision, Oberkochen, Germany). Il software di analisi d immagine KS-400 è un programma versatile di analisi d immagine concepito per ogni richiesta di applicazione professionale, in grado di essere utilizzato velocemente e correttamente per la maggior parte delle metodiche di Image Processing. KS- 400 può essere personalizzato per specifiche applicazioni, scegliendo i più appropriati algoritmi di analisi d immagine disponibili per la realizzazione di Macro, che consentono successivamente di effettuare le analisi desiderate in maniera automatica. Per ottenere le misure dei parametri desiderati sono state sviluppate due distinte macro, una per i dati della lievitazione (Rising) e l altra (Bread) per misurare i parametri delle fette di pane. La segmentazione è il processo più comunemente usato per convertire le immagini in informazioni, esso divide le immagini in regioni che corrispondono alle unità strutturali all intera immagine o distingue gli oggetti di interesse, in altre parole separa gli oggetti dallo sfondo (Scanlon & Zghal, 2001). La macro Rising segmenta l immagine con la semplice selezione dei livelli di grigio (threshold) relativi all impasto, elimina il bordo della capsula Petri in cui è contenuto l impasto in lievitazione, e salva le immagini del perimetro dell impasto misurato, aggiungendolo al perimetro del tempo precedente sulla stessa immagine, i contorni di tutti i perimetri misurati durante la cinetica consentono anche visivamente di valutare la cinetica di lievitazione. La macro Bread, considerando la complessità dell immagine da segmentare, infatti gli alveoli (oggetti) sono di solito poco differenziati dalla mollica (background), necessita di utilizzare algoritmi di segmentazione diversi rispetto alla macro Rising. Nel nostro caso abbiamo applicato una particolare funzione della libreria di KS chiamata Adaptative. Questa funzione realizza una segmentazione che si adatta ai livelli di grigio dell immagine, ed è particolarmente utile per segmentare strutture piccole o con livelli di grigio non uniformi, quali gli alveoli del pane. Bread consente di segmentare in maniera distinta l intera fetta, la crosta, la mollica e gli alveoli, effettuandone tutte le misure desiderate. Questo sistema ha consentito di rilevare i parametri relativi alle dimensioni e forma degli impasti, durante il loro sviluppo, consentendo di monitorare la cinetica di lievitazione delle diverse farine. A intervalli di 10, iniziando dal tempo 0 (T 0 ), sono state eseguite cinque scansioni (T 0, T 1, T 2, T 3, T 4 ) delle capsule Petri contenenti le formelle di pasta in fase di lievitazione, poggiandole sul piano dello scanner e coprendole con una scatola rivestita di cartoncino nero opaco per escludere la luce spuria ed ottenere uno sfondo dell immagine assolutamente nero. La digitalizzazione dell immagine è stata effettuata ad una risoluzione di 200 dpi (pixels per pollice). Dopo 40 minuti di lievitazione, le tre forme di pane in cassetta sono state infornate per 30. Quindi, trascorso il tempo necessario per il raffreddamento dei pani, questi sono stati tagliati perpendicolarmente alla base, a circa metà della lunghezza. Una delle due facce della sezione risultante, scelta a caso, è stata appoggiata sul piano dello scanner, coperta, anche in questo caso, da una scatola rivestita di cartoncino nero opaco, e scansita ad una risoluzione di 200 dpi.

4 L analisi d immagine ha consentito di misurare i parametri relativi al colore, alla morfologia dell intera fetta di pane, oltre a definire i parametri relativi alla tessitura della fetta, intendendo per tessitura il numero e la morfologia degli alveoli che si sono sviluppati durante la lievitazione (Horvat et al. 2002). In particolare, sono stati rilevati 25 parametri, di cui 8 relativi alle dimensioni e colore della crosta, 7 riguardanti la morfologia dell intera fetta di pane, e 10 parametri che definiscono il colore e la tessitura della mollica,. Per l elaborazione di tutti i dati ci si è avvalsi del software SPSS rel. 14 (Chicago, Illinois, USA). I dati (Tabelle 3a e 3b) sono stati sottoposti all ANOVA (Baardseth et al, 2000) e sono stati confrontati con il test di Duncan e la Cluster analysis di Scott e Knott (1974). Per individuare i migliori parametri di classificazione finalizzati all identificazione dei pani realizzati con specifiche farine, è stato utilizzato il metodo di analisi statistica Linear Discriminat Analysis - LDA. Questa procedura è comunemente utilizzata per la classificazione di gruppi definiti da variabili quantitative e qualitative (Fisher, 1936; 1940). In questa analisi i parametri sono stati selezionati ciclicamente (stepwise) per il loro contributo nel determinare la capacità di classificazione, il processo viene automaticamente interrotto quando nessuna ulteriore caratteristica inserita aumenta la capacità di classificazione (Venora et al., 2006; Venora et al., 2007). Il training set, utilizzato per costruire il modello, è costituito dai dati (immagini delle sezioni di pane) di ciascun campione. È stata applicata la procedura della Cross Validation per verificare la performance del classificatore realizzato. Tale procedura, che si applica per piccole popolazioni di dati, in mancanza di un gruppo significativamente ampio di nuovi casi ignoti, testa i singoli casi e li classifica sulla base di tutti gli altri (SPSS Application Guide, 1999). Risultati e discussione In Tabella 2 sono riportati i parametri chimici e reologici determinati sui campioni. L umidità delle farine è risultata compresa tra 13.6% (6) e 15.3% (8 - Simeto), la percentuale di proteine tra 7.2 (6) e 15.3 (9), le ceneri tra 0.36% (9) e 0.92% (7 - Platani), l indice di glutine è risultato compreso tra (6) e (9). Per quanto riguarda gli indici alveografici, l indice di tenacità P, in accordo con il fatto che i frumenti duri sono di solito più tenaci, è risultato compreso tra 65 (9) e 189 (7 - Platani); anche l estensibilità L è risultata con valori più elevati nel frumento duro 55 (6) e inferiori nel tenero 16 (9); l indice P/L esprime una situazione di equilibrio tra tenacità ed estensibilità di un impasto. Valori bassi assicurano, almeno per il frumento tenero, un pane voluminoso e soffice. I nostri campioni risultano compresi tra 1.72 (6) e 6.97 (8 - Simeto) entrambi farine di frumento duro. Per quanto riguarda il parametro che rappresenta sinteticamente la forza di una farina W, ancora il frumento duro è risultato più forte con il valore di 167 (5), di contro un W pari a 51 è stato registrato per una farina di tenero (9). In Tabella 3 sono riportati i parametri relativi alla cinetica di lievitazione. Otto campioni di farina hanno raggiunto il massimo sviluppo dell impasto al tempo 40 minuti, i campioni 4 e 6 invece al tempo 30 minuti, risultando più veloci nello sviluppo dell impasto. I parametri relativi alla forma dell impasto, sono risultati per tutti i campioni esaminati, abbastanza costanti durante la cinetica di lievitazione, assicurando che l impasto confinato nelle capsule Petri non ha subito influenza negativa per il suo normale sviluppo. Il campione 1 (Barilla) ha fatto registrare i valori significativamente più elevati di volume, diametri e perimetro dell impasto, i valori più bassi sono stati riscontrati nei campioni 4, 5 e 6 che costituiscono un gruppo relativo a miscele di frumento duro fornite da molini industriali dell isola. Intermedi, per questi parametri di lievitazione, sono risultate tutte le farine ottenente da singole varietà (2, 7, 8 e 10).

5 In Tabella 4 sono riportati i parametri rilevati con l analisi d immagine delle fette di pane. I dati sono relativi alla crosta, all intera fetta e agli alveoli delle sezioni di ogni pane. Il campione di frumento tenero 9, ha fatto registrare la maggiore superficie di crosta, la miscela di frumento duro rimacinato (4) invece il valore più basso. La percentuale media di crosta nei campioni studiati è risultata pari al 14.45%, un campione (3) ha fatto registrare il valore di 32.61%, più che doppio rispetto alla media, la percentuale di 11.41% è risultata la più bassa (4). La superficie dell intera fetta, insieme all altezza ed al perimetro, ha seguito lo stesso andamento del volume dell impasto, il campione 1 (Barilla) ha raggiunto i valori più elevati e il 6 i più bassi. Il numero di alveoli e la loro dimensione media, come prevedibile, sono risultati inversamente proporzionali. È noto che la qualità di un pane dipende dal suo volume, da un elevato numero di alveoli piccoli e omogenei, ciò rende il pane compatto ma sufficientemente soffice. I due campioni di frumento tenero (1 e 9) hanno fatto registrare i volumi più elevati, per quanto riguarda gli alveoli invece il campione 1 ha il maggior numero di alveoli in assoluto, questi sono abbastanza piccoli e omogenei, il tenero 9 ha un numero di alveoli abbastanza elevato, grandi e disomogenei. Le quattro miscele di frumento duro (3, 4, 5 e 6) hanno fatto registrare i volumi e il numero di alveoli più bassi. Il campione 3 invece ha gli alveoli più piccoli in assoluto tra tutti i campioni esaminati, all interno del gruppo delle miscele di duri esso ha fatto registrare il più elevato numero di alveoli. Il pane di più bassa qualità è risultato quello del campione 6, infatti insieme al più basso volume, ha il minor numero di alveoli di più grande dimensione e allo stesso tempo disomogenei. Per il gruppo delle farine monovarietali, il Platani (7) e il Simeto (8) hanno prodotto un buon pane, con un numero di alveoli medio e molto omogenei in Simeto, mentre Platani è risultato il più disomogeneo tra tutti i campioni esaminati. Capeiti (2), nonostante un pane di volume elevato, ha fatto registrare un basso numero di alveoli ma di elevata dimensione e molto omogenei tra loro. Timilia (10) ha prodotto un buon pane molto voluminoso, con elevato numero di alveoli di grandi dimensioni e omogenei. Tutti i dati ottenuti con l analisi d immagine delle fette di pane sono stati utilizzati per realizzare un modello di classificazione basato sulla tecnica della LDA. L analisi discriminante (Classificatore) ha dato i seguenti risultati : nel training set, le prime tre funzioni canoniche spiegano il 96.1 % di tutta la variabilità (la prima funzione 72.6%, la seconda 15.7% e la terza 7.8%, dati non mostrati). Usando il metodo stepwise, l analisi discriminante si è fermata dopo 5 cicli, uno per ciascun parametro, selezionando le migliori variabili tra le 25 misurate, per distinguere i dieci tipi di pane (Tabella 1 e 4). Usando questo modello, il 96.3% dei campioni del training set è stato correttamente classificato (Tabella 5). La capacità di classificazione è stata verificata con un gruppo di dati (fette di pane) non utilizzati per istruire il Classificatore. Il risultato è stato di 88.3 % di corretta classificazione dei campioni inseriti come ignoti (test set Tabella 5). I pani prodotti con farine di frumenti teneri non sono mai classificati come duri. Capeiti è raggruppato con Simeto (8) e con la miscela di duro 3, con una frequenza di 3 casi su 24. Questi errori di classificazione posso essere spiegati, il primo, poiché Capeiti è progenitore di Simeto, sono quindi molto simili; il secondo, cioè lo scambio con la miscela 3, per la ragione che le singole varietà Capeiti e soprattutto Simeto, posso essere i costituenti della miscela stessa. Simeto infatti è la varietà più diffusa, quindi di conseguenza la varietà che con maggiore probabilità può essere un costituente delle miscele di farina rimacinata. Una piccola percentuale (11.10%) della miscela di frumento duro rimacinato 3, è stata classificata come miscela di tenero (9), in questo caso la possibile spiegazione è che una parte dei costituenti di frumento rimacinato sia un tenero, infatti il campione originario, proveniva da un centro di stoccaggio senza denominazione alcuna sulle varietà che lo costituivano.

6 Tutti gli altri campioni sono correttamente classificati. Nonostante l esiguo numero di campioni che costituisce il data base di istruzione del modello di classificazione, la percentuale di corretta classificazione in generale è risultata soddisfacente (96.3%). Tutto il test set ha confermato in generale lo stesso andamento del training set. La farina monovarietale di Capeiti è stata ancora scambiata, come nel training set, con la 3 e la 8. Un caso della miscela di duro 3 è stato classificato come monovarietale Timilia (10), è probabile che il training set non sia abbastanza rappresentativo di tutta la variabilità. Il pane di Simeto (8) nel 33.33% dei casi è stato classificato come Platani, Platani e Simeto sono varietà sisters (stessi progenitori) molto simili da un punto di vista morfo-fisiologico e tecnologico. La stessa spiegazione si può dare alla erronea classificazione del 33.33% dei casi di Platani come miscela 3, probabile presenza nella miscela di Simeto o dello stesso Platani. Pur considerando questi risultati come assolutamente preliminari, a causa del basso numero di campioni, sembra che sia possibile applicare l analisi d immagine per la valutazione della qualità di un pane e potere anche individuare le farine utilizzate nel suo impasto. Un sistema del genere potrebbe essere implementato per il riconoscimento di pani tipici, come ad esempio il pane Nero di Castelvetrano, o per la tutela di prodotti IGP e DOP quali il Pane Casereccio di Genzano o il Pane d Altamura, ed effettuare un auspicabile tracciabilità e rintracciabilità dei costituenti di un prodotto. Inoltre, l analisi d immagine sulle fette di pane potrebbe consentire di valutare la shelf-life di pani prodotti industrialmente (Zghal et al., 1999). Non per ultimo, potrebbe essere possibile valutare l attitudine panificatoria di miscele di frumento o di farine monovarietali, nonché l efficienza di lieviti commerciali o ceppi naturali, durante la fase di lievitazione degli impasti. Bibliografia - Riva M., Pagani M.A., La Prova M., Un approccio innovativo per lo studio della lievitazione di impasti da pane: l analisi d immagine. La Tecnica Molitoria Luglio 2004: Chargelegue A., Guinet R., Neyreneuf O., Onno B., Pointrenaud B., La fermentation. In : La panification française. R. Guinet e B. Godon, ed. Lavoisier, Paris: Anonimo- Chimica dei cereali " Controllo dei prodotti cerealicoli con analisi dell' immagine ". Tecnica Molitoria (1994). - Bordo V. and Surrusca A L Italia del pane Guida alla scoperta e alla conoscenza Slow Food Editore Bra pp ISBN Du C.J. & Sun D.W. Learning techniques used in computer vision for food quality evaluation : review. Journal of Food Engineering 72, (2006). - Du C.J. & Sun D.W. Recent developments in the applications of image processing techniques for food quality evaluation. Trends in Food Science & Technology 15, (2004). - Sun D.W. Computer vision an objective, rapid and non-contact quality evaluation tool for the food industry. Journal of Food Engineering 61, 1-2 (2004). - Brosnan T. & Sun D.W. Improving quality inspection of food products by computer vision-a review. Journal of Food Engineering 61, 3-16 (2004). - Fisher, R.A., The use of Multiple measurements in taxonomic problems. Annals of Eugenics 7(2), Fisher, R.A., The precision of discriminant functions. Annals of Eugenics 10(4).

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