Esercitazione 3: analisi della riboflavina contenuta nel latte mediante spettroscopia di fluorescenza molecolare

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1 Esercitazione 3: analisi della riboflavina contenuta nel latte mediante spettroscopia di fluorescenza molecolare Principio del metodo La riboflavina (nota anche come vitamina B 2 ) è una vitamina idrosolubile presente in numerosi alimenti, fra i quali il latte. Essendo caratterizzata da un elevata resa quantica di fluorescenza nella regione del visibile la riboflavina verrà rivelata e quantificata, a livelli di concentrazione dell ordine delle decine di parti per miliardo (ppb o g/l), sfruttando appunto la spettroscopia di fluorescenza molecolare. Strumentazione Spettrofluorimetro Varian Cary Eclipse. Soluzioni Soluzione di CH 3 COOH M: tale soluzione, già disponibile sul banco di laboratorio, sarà impiegata come solvente per la preparazione di tutte le soluzioni di riboflavina. Soluzione di NaCl 3 M / CH 3 COOH 1 M: tale soluzione, già disponibile sul banco di laboratorio, sarà necessaria per innescare la precipitazione delle caseine del latte mediante abbassamento del ph a valori inferiori al loro punto isoelettrico. Soluzione madre di riboflavina, 100 ppm ( g/ml): questa soluzione andrà preparata all inizio dell esercitazione, pesando g di riboflavina e sciogliendoli in CH 3 COOH M in un matraccio da 100 ml. Dopo la preparazione il matraccio contenente la soluzione madre di riboflavina andrà conservato, quando non utilizzato, al buio, nell armadietto posto sotto il banco da laboratorio, per prevenire la decomposizione della vitamina a seguito dell esposizione alla luce. 1

2 Procedura Preparazione della soluzione 100 ppb di riboflavina A partire dalla soluzione madre 100 ppm si procederà alla preparazione di una soluzione di riboflavina 100 ppb, mediante diluizione 1:1000 (v/v). A tal fine trasferire in un matraccio da 100 ml un volume di CH 3 COOH M tale da riempirne la parte inferiore, approssimativamente fino all inizio del collo. Prelevare, con estrema cura, 100 L della soluzione di riboflavina 100 ppm facendo uso di una micropipetta da 100 L (P100) ed introdurli accuratamente nella soluzione contenuta nel matraccio, effettuando successivamente almeno tre cicli di aspirazione nel/espulsione dal puntale della micropipetta della nuova soluzione in formazione. Tale procedura ha lo scopo di rimuovere dal puntale ogni possibile residuo della soluzione 100 ppm. Tappare il matraccio ed agitare vigorosamente per qualche minuto. Al termine dell operazione portare a volume con CH 3 COOH M ed agitare nuovamente per qualche minuto. Anche il matraccio contenente la soluzione 100 ppb di riboflavina andrà protetto dalla luce, ponendolo nell armadietto sottostante, quando non in uso. Acquisizione degli spettri di eccitazione ed emissione della riboflavina La soluzione 100 ppb verrà impiegata per l acquisizione degli spettri di eccitazione e di emissione della riboflavina, necessari per stabilire la migliore coppia di lunghezze d onda per le successive misure fluorimetriche. Inizialmente si procederà con gli spettri di emissione, ottenuti eccitando l analita alle lunghezze d onda dei due massimi del suo spettro di assorbimento nel visibile, mostrato a lezione. In particolare si impiegheranno le lunghezze d onda 370 e 440 nm, nell ordine. Per dare inizio all acquisizione portarsi sul desktop del computer che gestisce lo spettrofluorimetro e cliccare sull icona Scan: si aprirà la finestra di acquisizione degli spettri di eccitazione/emissione. Spostarsi nel menù Setup e cliccare sul tasto Emission. Impostare i parametri come indicato di seguito: X mode: wavelength Excitation: 370 (nm) Start: 400 (nm) Stop: 700 (nm) Scan control: slow (120 nm/min) Excitation slit: 10 (nm) Emission slit: 10 (nm) 2

3 Spostarsi nel menù Reports > Peaks ed impostare la Threshold al valore 5. Cliccare su OK: il software si porterà sulla finestra di visualizzazione della scansione e si potrà ascoltare il suono prodotto dai reticoli dei monocromatori di eccitazione ed emissione nel portarsi nelle posizioni iniziali (in questo caso relative alle lunghezze d onda 370 e 400 nm, rispettivamente). Lo spettrofluorimetro sarà dunque pronto per l acquisizione. NOTA IMPORTANTE: lo spettro di emissione viene acquisito a partire da una lunghezza d onda 30 nm superiore a quella di eccitazione. Questa impostazione serve ad evitare il campionamento della radiazione di eccitazione sottoposta allo scattering di tipo Rayleigh. Nel caso della riboflavina la radiazione dovuta alla fluorescenza di risonanza (ossia quella alla lunghezza d onda di eccitazione) ha un intensità trascurabile e quindi la scelta non porta ad una perdita significativa della radiazione di fluorescenza. Afferrare la cuvetta per spettrofluorimetria dal bordo superiore (che non verrà esposto poi alla radiazione incidente), in modo da non lasciare sulle sue facce tracce di materiale organico che potrebbero interferire con le misure. Posarla delicatamente sulla superficie del bancone e riempirla con la soluzione 100 ppb di riboflavina usando una pipetta Pasteur e facendo arrivare il livello del liquido fino alle indicazioni stampate su una delle facce della cuvetta. Asciugare accuratamente le facce della cuvetta ed accertarsi che all interno della soluzione non vi siano corpuscoli sospesi. Posizionare la cuvetta nell alloggiamento dello spettrofluorimetro, spingendola delicatamente all interno, senza MAI forzare, per evitare incrinature delle facce in quarzo. E consigliabile posizionare la cuvetta con la faccia riportante le indicazioni rivolta verso l operatore, in modo che nei successivi esperimenti si possa sempre sistemarla allo stesso modo (cambiamenti di posizione potrebbero portare a lievi fluttuazioni nelle misure). Terminata l operazione, chiudere con cura la copertura scorrevole dell alloggiamento della cuvetta. Portarsi nella finestra di acquisizione sul computer, già aperta in precedenza, e cliccare sul tasto Start. Lo spettro di emissione relativo alla exc = 370 nm verrà tracciato via via sullo schermo e, al termine, il computer segnalerà le lunghezze d onda e le intensità dei suoi massimi. Portarsi nella finestra File e salvare in un apposita cartella, specifica per ciascun gruppo, collocata a sua volta nella cartella dedicata alle esercitazioni, posizionata sul Desktop, lo spettro, denominandolo con un nome che richiami la concentrazione di riboflavina e la tipologia dello spettro effettuato, ad esempio 100ppb_em370 per l emissione stimolata a 370 nm. Scegliere l estensione Batch per il file (.FBSW). Al termine dell operazione salvare il documento come file PDF, sempre nella stessa cartella, dalla quale i file PDF verranno poi copiati su pen drive alla fine dell esercitazione. 3

4 Ripetere l operazione finora descritta per la seconda lunghezza d onda di eccitazione, 440 nm, senza spostare la cuvetta dal suo alloggiamento, né tanto meno aprire il coperchio scorrevole di quest ultimo. Per variare la lunghezza d onda di eccitazione cliccare sull icona Scan (salvo che la relativa finestra non sia rimasta aperta dopo la precedente acquisizione) e cambiare i parametri di eccitazione e scansione nel modo seguente: X mode: wavelength Excitation: 440 (nm) Start: 470 (nm) Stop: 700 (nm) Scan control: slow (120 nm/min) Excitation slit: 10 (nm) Emission slit: 10 (nm) Procedere con l acquisizione, salvare il file relativo e, successivamente, effettuare il confronto dei due spettri di emissione ottenuti, valutando in quale caso e a quale lunghezza d onda si sia registrata la massima intensità di fluorescenza. La lunghezza d onda alla quale si sarà registrata la massima intensità sarà utilizzata per l acquisizione del relativo spettro di eccitazione della riboflavina. A tal fine cliccare nuovamente sull icona Scan e portarsi nel menù Setup, cliccando poi sul tasto Excitation. I parametri da impostare saranno, questa volta: X mode: wavelength Emission: valore scelto (nm) Start: 280 (nm) Stop: valore scelto - 30 (nm) Scan control: slow (120 nm/min) Excitation slit: 10 (nm) Emission slit: 10 (nm) Lo spettro di eccitazione consentirà di valutare in modo più accurato la lunghezza d onda migliore a cui eccitare la riboflavina per stimolare la fluorescenza alla lunghezza d onda di emissione ottimale, valutata in precedenza. NOTA IMPORTANTE: vi sarà una lieve differenza (pochi nm) fra la lunghezza d onda ottimale di eccitazione e quelle impiegate in precedenza per gli spettri di emissione, a loro volta derivanti dallo spettro di assorbimento dell analita. Decisa la coppia di valori di exc e em, prenderne nota sul proprio quaderno di laboratorio. Essa sarà fondamentale per l esecuzione delle misure successive. 4

5 Preparazione delle altre soluzioni standard di riboflavina e costruzione del grafico di calibrazione A partire dalla soluzione 100 ppb di riboflavina preparare le seguenti quattro soluzioni, prelevando i volumi delle soluzioni indicate e portando a volume con CH 3 COOH M in matracci da 20 ml: 1) soluzione 50 ppb: 10 ml di soluzione 100 ppb; 2) soluzione 20 ppb: 8 ml di soluzione 50 ppb; 3) soluzione 10 ppb: 10 ml di soluzione 20 ppb; 4) soluzione 5 ppb: 10 ml di soluzione 10 ppb Porre estrema cura sia nel prelevare i volumi indicati che nel portare a volume nei matracci. Da tale cura dipenderà fortemente la qualità dei dati di calibrazione e della successiva quantificazione. Portarsi nuovamente sul desktop del computer e cliccare questa volta sull icona Simple Reads. Essa consentirà di accedere al menù delle letture di intensità di fluorescenza, fissata la coppia di exc e em. Impostare i seguenti parametri: Excitation : valore prescelto Emission : valore prescelto Excitation slit: 10 nm Emission slit: 10 nm Average time: 5 s L ultimo parametro impostato implica che l intensità di fluorescenza emessa sarà mediata su un tempo di 5 secondi, per attenuare eventuali fluttuazioni. La lettura dell intensità emessa partirà dopo aver cliccato sul tasto Read. Le letture di intensità di fluorescenza saranno effettuate in triplicato, prima sulla soluzione di CH 3 COOH M e poi su ciascuna delle cinque soluzioni di riboflavina, da 5 a 100 ppb, nell ordine. Questa successione ridurrà il rischio di alterazione di una misura a seguito di contaminazione della cuvetta da parte della soluzione analizzata in precedenza. Per dare inizio alle letture riprendere la cuvetta dall alloggiamento nello spettrofluorimetro, svuotarla, sciacquarla almeno due volte con acqua, usando una spruzzetta, e riempirla con la soluzione di CH 3 COOH M. Asciugare la cuvetta accuratamente, verificare l assenza di corpuscoli sospesi al suo interno e procedere con la misura delle intensità di fluorescenza, che in questo caso sarà riferita al bianco. 5

6 Al termine delle tre misure, i cui valori verranno via via annotati dal computer nel file già aperto (oltre che visualizzate volta per volta in una finestrella posta a sinistra in alto), passare alla soluzione di riboflavina 5 ppb, sempre dopo aver sciacquato la cuvetta. Procedere allo stesso modo per le restanti soluzioni (si otterranno 18 misure in tutto) e salvare il file di calibrazione con un nome che contenga il nome del gruppo (ad es. GrA_calib_riboflavina). Anche in questo caso optare per l estensione Batch (.FBSR). I dati di intensità di fluorescenza contenuti in tale file per le cinque soluzioni e per il bianco saranno utilizzati, nel corso della stesura della relazione, per la costruzione della retta di calibrazione ed il calcolo dei relativi parametri (pendenza, intercetta, coefficiente di correlazione, LOD 1 e LOD 2 ). Si noti che in questo caso la retta di calibrazione potrebbe non passare per l origine degli assi perché l intensità di fluorescenza del bianco potrebbe non essere nulla. Preparazione dei campioni di latte Ciascun componente del gruppo di lavoro porterà da casa un campione di latte usando un flaconcino che gli sarà stato consegnato dal docente in precedenza, e procederà alla preparazione della soluzione per l analisi fluorimetrica a partire dal suo campione. A tal fine occorrerà prelevare con una pipetta di vetro 5 ml di latte e trasferirli in un becker appositamente contrassegnato (ve ne sarà uno per ciascun campione di latte da analizzare). Con la buretta data in dotazione saranno poi prelevati e trasferiti nello stesso becker 15 ml di soluzione NaCl 3M/CH 3 COOH 1 M. Dopo il trasferimento avrà inizio la flocculazione delle caseine del latte. Occorrerà agitare con una bacchettina di vetro per almeno 5 minuti; successivamente, senza lasciar decantare, si dovrà trasferire la sospensione ottenuta in una provetta da centrifuga in plastica da 10 ml, usando la tacca più alta delle provette come riferimento per il riempimento. NOTA: Nel caso dei gruppi con tre componenti uno dei tre riempirà due provette con la sua sospensione, in modo tale da avere comunque un numero totale pari di provette da caricare nella centrifuga. Un numero pari di provette è necessario al bilanciamento del rotore della centrifuga durante la rotazione ad alta velocità. La procedura di centrifugazione, che avverrà in parallelo per le 4 provette riempite, avverrà in un altro laboratorio, sotto la supervisione del docente, ed implicherà un tempo massimo di 5 minuti. Al termine dell operazione si dovrà notare chiaramente un precipitato bianco, posto o sul fondo della provetta o in sospensione sul liquido, che rappresenta il siero di latte (il comportamento dipenderà dal contenuto lipidico del latte). 6

7 Tornati nel laboratorio didattico si procederà a prelevare il siero relativo a ciascun campione di latte con una siringa e a filtrarlo, come sarà mostrato al momento dal docente, con un filtro tipo-hplc, avente una porosità di 0.45 m o inferiore. Il filtro sarà montato direttamente sulla punta della siringa dopo averne staccato l ago. L operazione assicurerà la totale assenza di corpuscoli, anche di dimensioni micrometriche, nel campione che verrà poi analizzato con lo spettrofluorimetro. Il siero di latte filtrato sarà raccolto in una nuova provetta in plastica da 10 ml. Al termine dell operazione se ne preleverà 1 ml con una micropipetta P1000 e lo si trasferirà in un matraccio da 20 ml, portando a volume con acqua deionizzata. Questa diluizione è necessaria per abbattere ulteriormente la concentrazione di riboflavina contenuta nel siero di latte, di per sé troppo elevata per non indurre fenomeni di autoassorbimento durante la misura dell intensità di fluorescenza. Per ciascun campione così ottenuto si procederà ad effettuare la lettura in triplicato dell intensità di fluorescenza della riboflavina nel siero di latte diluito, usando l opzione Simple Read, come per le soluzioni standard di riboflavina. Il file contenente le letture andrà salvato sul computer con l estensione FBSR e, successivamente, anche in formato PDF, sempre nella cartella destinata al gruppo di lavoro. In fase di stesura delle relazioni di laboratorio si potrà calcolare, per estrapolazione dal grafico di calibrazione, la concentrazione di riboflavina in ciascuno dei campioni di siero di latte diluito. Per ottenere la concentrazione di riboflavina nel latte iniziale occorrerà tener conto del fattore di diluzione complessivo, che è pari a 80 (ossia il prodotto del fattore 4, relativo alla diluizione del latte, e del fattore 20 relativo alla successiva diluizione nel siero), se si assume che non vi sia perdita di analita nella massa di proteine precipitate dal latte. NOTA IMPORTANTE: prima di lasciare la postazione ricordarsi di riprendere i matracci contenenti le soluzioni 100 ppm e 100 ppb di riboflavina dall armadietto posto sotto il bancone, scaricare le soluzioni (nel lavandino, essendo innocue) e lavare i matracci. 7