IL LABORATORIO DipSA-AREA COLTURE ARBOREE. Serena Venturi, Chiara Pastore, Paolo De Franceschi, Ilaria Filippetti, Luca Dondini

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1 IL LABORATORIO DipSA-AREA COLTURE ARBOREE Serena Venturi, Chiara Pastore, Paolo De Franceschi, Ilaria Filippetti, Luca Dondini Laboratorio fingerprinting Il laboratorio fingerprinting del DipSA-AREA COLTURE ARBOREE, fonda le sue origini nel Centro Miglioramento Varietale in Frutticoltura (CMVF) nato nel 1975 e annesso all Istituto di Coltivazioni Arboree dell Università di Bologna che ha condotto, insieme al Centro di Ricerche Viticole ed Enologiche (CRIVE, 1973) i programmi di breeding del Dipartimento e il rilascio di nuovo materiale genetico fruttiviticolo per circa quarant anni. Per lungo tempo, per confermare l identificazione varietale del materiale nato da questi programmi di breeding, ci si è basati sulle caratteristiche morfo-fenologiche e pomologiche delle nuove cultivar, che come noto può essere un approccio problematico e non risolutivo, specie quando i fenotipi messi a confronto risultavano molto simili tra di loro. Grazie alle tecniche di PCR sviluppate nel corso degli ultimi 20 anni per l analisi del DNA nelle piante è stato possibile sviluppare un nuovo strumento in grado di offrire le necessarie garanzie della rispondenza genetica delle cultivar e quindi della protezione dei diritti di moltiplicazione dei vivaisti e dei costitutori. Grazie alla loro capacità di identificare polimorfismi fra le diverse varietà, queste tecniche basate sull'analisi di marcatori molecolari possono essere facilmente adattate allo studio del DNA di tutte le specie arboree da frutto più importanti dal punto di vista commerciale, contribuendo a risolvere diverse problematiche. Fra le numerose applicazioni di tali tecniche una delle più importanti è sicuramente il fingerprinting (impronta genetica) nelle piante da frutto, che rappresenta l identificazione e la distinzione di una pianta rispetto ad altre sulla base dei suoi profili molecolari. Sempre più stretto, infatti, è risultato il binomio analisi del fenotipo - analisi del DNA che ha portato a tangibili e buoni risultati sul piano applicativo. Il laboratorio fingerprinting del DipSA, svolge da oltre 15 anni analisi molecolari di rispondenza varietale sulle piante da frutto e sui relativi materiali di moltiplicazione, al fine di integrare e/o implementare i controlli di campo basati sui soli descrittori fenotipici. Dal 2000 il laboratorio è stato accreditato dal Servizio Fitosanitario della regione Emilia- Romagna (ai sensi dei D.M. 14 APRILE 1997 e del D.M. 9 AGOSTO 2000) per svolgere le analisi fitosanitarie e di rispondenza varietale previste dalla normativa su piante da frutto ortive e ornamentali.

2 Attività del laboratorio fingerprinting Il laboratorio fingerprinting del DipSA propone un servizio a pagamento per l identificazione univoca delle varietà di specie arboree e di vite per mezzo di analisi del DNA con marcatori molecolari (principalmente microsatelliti o SSR). Il servizio è rivolto a Enti di certificazione Istituzioni pubbliche Professionisti Produttori-Viticoltori Vivaisti Scopi delle analisi fingerprinting - controlli random annuali di corrispondenza varietale nell ambito della convenzione con il Servizio Fitosanitario Regionale nei vivai; - controlli di corrispondenza varietale in vite sul materiale iniziale presente nel Nucleo di Premoltiplicazione dell Emilia Romagna; - studio della biodiversità regionale per la conservazione e il mantenimento delle varietà locali e, nelle specie da frutto, per ottimizzare i processi di breeding. - a sostegno dei professionisti, produttori, viticoltori ogni qualvolta si abbia la necessità di avere la certezza del genotipo della varietà che si sta coltivando (es. brevetti sulle varietà da frutto); - a sostegno dei vivaisti, per intensificare i controlli durante la propagazione delle piante in vivaio per prevenire il verificarsi di errori che possono ripercuotersi su tutta la catena di produzione delle piante fino al consumatore. La possibilità di estrarre il DNA da tutti i tessuti ed organi delle piante permette di effettuare l analisi fingerprinting in qualsiasi periodo della stagione. Il materiale vegetale oggetto dell analisi, opportunamente denominato ed adeguatamente etichettato dal committente, può essere spedito oppure consegnato fresco o liofilizzato direttamente al nostro laboratorio,. L unica informazione necessaria al laboratorio riguarda la specie di appartenenza del campione. Sul sito del DipSA è presente il form da compilare per la richiesta di analisi ( Per ogni specie è stato selezionato un numero adeguato di marcatori molecolari che assicurano un elevato potere discriminante. La corsa dei frammenti di DNA viene fatta su sequenziatore capillare e l analisi dei dati è svolta da personale qualificato con l'aiuto di apposti software. Queste metodologie standardizzate assicurano tempistiche di analisi brevi e alta riproducibilità.

3 Numero di genotipi Analisi svolte nell ambito della convenzione con il Servizio Fitosanitario dell Emilia Romagna Nel biennio sono stati analizzati per la regione Emilia Romagna più di 400 genotipi, prevalentemente di Drupacee. I vivai visitati, dislocati prevalentemente nella zona della Romagna, Numero di genotipi analizzati per specie Drupacee Drupacee Pomacee Vite 0 albicocco ciliegio pesco susino sono stati 6 nel 2014 e 8 nel 2015, incluso un campo di piante madri. Le irregolarità riscontrate attraverso le analisi molecolari hanno comportato l eliminazione da parte dei vivaisti delle piante non o diversamente dichiarate. I campioni di vite sono invece stati tutti prelevati nel Nucleo di Premoltiplicazione dell Emilia Romagna situato a Tebano (RA) allo scopo di verificare la corrispondenza varietale dei cloni ivi presenti. Anche in questo caso la presenza di alcune anomalie ha portato alla luce la necessità di riorganizzare il Nucleo stesso e di effettuare analisi molecolari ogni qualvolta un nuovo clone di vite venga introdotto per la futura propagazione. Analisi svolte per conto terzi Le analisi conto terzi svolte nel biennio presso il laboratorio fingerprinting sono state effettuate non solo su specie da frutto tradizionalmente coltivate in regione quali ciliegio, pesco, pero, kiwi e su vite, ma anche su mirtillo, nocciolo e bambù. Sono sempre di più i coltivatori e i vivaisti che richiedono infatti il supporto delle analisi molecolari per risolvere problemi di identità varietale sorti all interno delle loro aziende oppure per caratterizzare nuove varietà. Attività di ricerca. In parallelo alle attività di analisi fingerprinting classiche, il nostro laboratorio ha effettuato in questi anni la caratterizzazione molecolare di 45 accessioni di pero e 197 accessioni di vite

4 autoctone rivelando, per entrambe le specie, la presenza di sinonimie e omonimie tra genotipi locali, nazionali e internazionali, e mettendo in evidenza la presenza in Emilia Romagna di biotipi utili per ottimizzare il processo di breeding in pero e per selezionare e conservare vitigni con caratteristiche peculiari. Analisi di marcatori molecolari per la MAS (selezione assistita da marcatori) in piante da frutto Il DipSA fornisce inoltre un altro servizio a pagamento per l'analisi di marcatori molecolari associati a resistenze a patogeni o a caratteri legati alla qualità della frutta nel melo, in pesco e in albicocco. Questo servizio può agevolare gli istituti di ricerca privati e pubblici che non sono in grado di procedere in autonomia all'analisi di marcatori molecolari basati sull'uso della PCR. Più nel dettaglio si dispone di marcatori per verificare in nuove selezioni di melo la presenza del gene Vf per la resistenza a ticchiolatura, la resistenza all'afide grigio, la produzione di etilene dei frutti (marcatori sul gene ACS). In melo è possibile selezionare con marcatori anche per la buccia rossa e la bassa acidità delle mele. In pesco sono disponibili marcatori molecolari in gradi di prevedere se i nuovi genotipi avranno frutti con polpa bianca o gialla o se avranno la buccia del tipo pesca o nettarina. In albicocco sono disponibili marcatori molecolari associati alla resistenza a Sharka. I marcatori molecolari a disposizione per questo servizio derivano dall'attività di ricerca condotta negli ultimi 15 anni a sostegno dell'attività di miglioramento genetico nel settore delle piante arboree da frutto. Analisi di marcatori molecolari per la determinazione degli alleli dell'autoincompatibilità Il laboratorio offre inoltre la possibilità di determinare con metodi molecolari il genotipo S, da cui dipende la sterilità, in diverse specie fra le quali melo, pero e ciliegio. Queste specie sono infatti caratterizzate da un sistema di autosterilità che impedisce al fiore di essere fecondato da polline prodotto dalla stessa pianta o da piante della stessa varietà. È quindi fondamentale per il coltivatore assicurare la presenza nel frutteto di varietà intercompatibili, che possano garantire un efficace impollinazione reciproca e quindi una resa soddisfacente. L analisi molecolare del genotipo S permette di determinare in modo estremamente rapido e accurato la compatibilità fra cultivar diverse. Inoltre in alcune specie come il ciliegio e l'albicocco è possibile identificare con appositi saggi molecolari alcune delle mutazioni che conferiscono autofertilità. Didattica Tesi di laurea e dottorato Esercitazioni nell ambito di corsi di laurea del DipSA Tirocini curricolari

5 Supporto verso enti esterni (Fondazioni, scuola dell obbligo) all attività didattica e divulgativa