Il Programma Proteine Vegetali in Friuli Venezia Giulia

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1 Il Programma Proteine Vegetali in Friuli Venezia Giulia CONTAMINAZIONE ACCIDENTALE DA OGM ED APPLICAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI PER L IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN SOIA. Piera De Pauli,, Francesca Canciani ERSA Servizio Fitosanitario chimico-agrario analisi e certificazione Pozzuolo del Friuli (UD) Villa Carinzia,Pordenone - 9 settembre 28 Il lavoro è stato svolto con il contributo del progetto interregionale "Azioni di innovazione e ricerca a supporto del piano Proteine Vegetali V " (L.( 499/1999 e D.M. n. S/25279/23).

2 MICROSATELLITI SOIA DISCRIMINAZIONE VARIETALE ATTRAVERSO MARCATORI MOLECOLARI evidenziano le differenze (polimorfismo) nella sequenza nucleotidica di regioni del DNA genomico permettono la caratterizzazione di individui o di varietà o di popolazioni (fingerprinting( genetico o impronta genetica) non sono influenzati dall ambiente ambiente

3 MICROSATELLITI sono brevi sequenze nucleotidiche elementari ripetute in tandem, [es[ es.....attattatt.attattatt = (ATT)n] di lunghezza e composizione in basi nucleotidiche variabile Frammento di MICROSATELLITE sequenziato.. Unità ripetuta (ATT)n Elettroferogramma del microsatellite satt4 da sequenziatore ABI-Prism 31

4 ogni microsatellite può avere forme diverse chiamate ALLELI ogni allele si misura in termini di lunghezza della sequenza nucleotidica (bp = paia di basi) il polimorfismo è dato dall insieme degli alleli ottenuti da un microsatellite CARATTERISTICHE: MICROSATELLITI Ipervariabili,, quindi estremamente informativi Molto abbondanti nel genoma degli eucarioti relativa semplicità di analisi

5 MATERIALI E METODI Saggiata la semente di: HILARIO, AIRES, PEDRO, ASCASUBI e COLORADO, varietà a bassi fattori antinutrizionali. 3 var. di soia dalle prove varietali (fornita dal Servizio Ricerca e sperimentazione dell ERSA). Screenati 7 microsatelliti con motivo ripetuto (ATT)n, inizialmente su un campione di 7 varietà di soia attraverso PCR qualitativa e gel- elettroforesi. Gel elettroforesi su 7 var. per satt46

6 MATERIALI E METODI Fragment Analysis per i 13 microsatelliti risultati più polimorfici attraverso sequenziatore ABI-Prism 31.. Precisa determinazione delle dimensioni degli alleli.. Analisi effettuata su tutte le 35 varietà. 125 bp 128 bp Es. microsatellite satt 31 polimorfismo prodotto 3 alleli diversi: 125 bp,, 128 bp,, 169 bp 169 bp

7 MATERIALI E METODI stima del grado di polimorfismo di ciascun microsatellite attraverso calcolo dell indice di PIC (Polymorphic( Information Content): tiene conto del numero alleli prodotti e loro frequenza. PIC >,5 buono MICROSATELLITE satt 185 satt 46 satt 588 satt 181 satt 31 satt 37 satt 7 satt 173 satt 9 satt 179 SYHSP 176 satt 182 satt 187 N. ALLELI DIMENSIONI ALLELI IN BP 26, 224, 227, 245, 248, 251, , 218, 225, , 144, 169, 17, , 24, , 128, , 169, 175, 178, , 16, , 26, 29, 241, 247 9, 162, 18, 212, 2, , 128, 169, 178, , 111, 113, , , 278, 291 PIC,82,629,626,616,58,579,555,538,442,427,378,367,34

8 PROFILO GENETICO DELLE VARIETÀ DI SOIA A BASSI FATTORI ANTINUTRIZIONALI 8 microsatelliti utilizzati, esito espresso come dimensione del frammento in paia di basi (bp( bp) ogni varietà è identificata da una serie di alleli ottenuti dai relativi microsatelliti (impronta genetica) VARIETA' Satt185 Satt588 Satt181 Satt46 Satt31 Satt7 Satt37 Satt173 HILARIO AIRES PEDRO ASCASUBI COLORADO le 5 varietà di soia a bassi fattori antinutrizionali risultano discriminate in modo univoco tra loro e da tutte le altre.

9 ANALISI OGM OBIETTIVI valutazione della qualità della semente di soia rispetto alla contaminazione da OGM; definizione dei disciplinari di produzione e delle caratteristiche dei sistemi di tracciabilità per l ottenimento di prodotti OGM- free.

10 QUANTIFICAZIONE DELLA % DI CONTAMINAZIONE MEDIANTE L ANALISI L A GRUPPI Si basa sulla distribuzione di Poisson; Si applica nei casi in cui la % di contaminazione è molto bassa; Il campione da analizzare viene suddiviso in (N) gruppi ciascuno costituito da (n) semi; Dall analisi analisi qualitativa (positivo/negativo) di ogni gruppo di semi è possibile stimare la percentuale di contaminazione ed i limiti entro cui può variare; Deve essere nota l efficienza l del metodo di analisi;

11 IL PRINCIPIO DI CAMPIONAMENTO ED I LIMITI DI AFFIDABILITÀ I N k P+%,1% ,2%,5% 3 5 1,%,1% 3 5 1,%,5% ,94%,3% ,89%,2% ,2%,1% ,69%,7% ,1%,1% ,93% I = INFEZIONE REALE DEL LOTTO N = NUMERO DI SEMI PER GRUPPO k = NUMERO DI GRUPPI ANALIZZATI P+ = PROBABILITA' DI AVERE UNA POSITIVITA

12 I METODI DI CAMPIONAMENTO E DI ANALISI PROPOSTI NELLO STUDIO DELLE FILIERE OGM-FREE Prova effettuata nei campi di confronto varietale presso l Az. Marianis dell ERSA 1. Verifica preliminare della % di contaminazione su 5 gruppi di 3 semi per ogni lotto e scelta delle varietà con i maggiori livelli di OGM 2. Verifica in campo dell effettiva effettiva presenza di piante transgeniche nelle parcelle prescelte per lo studio e stima della % di OGM in campo 3. Valutazione della contaminazione della granella nelle parcelle contaminate e in tutte le altre adiacenti mediante analisi a gruppi

13 La contaminazione in campo Varietà Y N n N-1 P% Li Ls ,33,6, ,37,7, ,34,6,191 La contaminazione della granella Varietà Y N n P% Li Ls P% foglia P% seme ,39,13,114,33%,54% ,13,2,72,37%,17% 3 2 5,58,22,132,34%,54%

14 LE VARIET LE VARIETÀ SEMPRE NEGATIVE NEL 26 SEMPRE NEGATIVE NEL Sponsor Sponsor 3 3 Shama Shama 3 3 Sekoia Sekoia 3 3 Sapporo Sapporo 3 3 Pedro Pedro 3 3 Nikko Nikko 3 3 Hilario Hilario 3 3 Goriziana Goriziana 3 3 Fukui Fukui 3 3 Dekabig Dekabig 3 3 Colorado Colorado 3 3 Blanca Blanca 3 3 Atlantic Atlantic 3 3 Ascasubi Ascasubi 3 3 Aires Aires Ls Ls(%) (%) Li(%) Li(%) P% P% n N Y Variet Varietà

15 CONCLUSIONI La qualità dei lotti di semente è migliorata dal 23 ad oggi e la percentuale di lotti a norma è prossima al 95%. Esistono sul mercato diversi lotti che si sono rivelati sempre esenti da OGM nei limiti fissati dal tipo di campionamento. Prime esperienze di campo confermano la possibilità di ottenere produzioni OGM-free se la semente ne è esente Filiere di soya OGM-free sono quindi possibili nelle attuali condizioni con un limitato impegno dal punto di vista analitico