Metodi Molecolari per la Ricerca, Identificazione e tipizzazione di Francisella tularensis

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1 Roma, ottobre 204 Metodi Molecolari per la Ricerca, Identificazione e tipizzazione di Francisella tularensis IZSLER Sezione di Pavia Nadia Vicari Metodi molecolari Rilevare Identificare Tipizzare Sub-tipizzare

2 Tecniche utilizzate Rilevare Identificare Tipizzare Sub-tipizzare end-point real-time MLVA Whole genome seq Classificazione di Francisella tularensis Taxon Famiglia Genere Specie Francisellaceae Francisella. F. tularensis 2. F. novicida 3. F. philomiragia 4. F. noatunenisis 5. F. hispaninensis (200)

3 Classificazione di Francisella tularensis Taxon Famiglia Genere Specie Francisellaceae Francisella. F. tularensis 2. F. novicida 3. F. philomiragia 4. F. noatunenisis 5. F. hispaninensis Classificazione di Francisella tularensis l identità tassonomica Identificazione a livello di genere e specie, secondo un approccio basato su valutazioni fenotipiche, biochimiche e genomiche 6

4 Caratteristiche biochimiche e fenotipiche WHO Guidelines on Tularemia Albero filogenetico basato sulla sequenza del gene 6S rdna Albero filogenetico basato sulle sequenze depositate in GenBank del gene 6S rdna del genere Francisella e di altri batteri rappresentativi della classe gamma proteobatteri Titball R.W. et al TRENDS in Microbiology : 8-23

5 Sottospecie di Francisella tularensis F. tularensis F. tularensis tularensis (tipo A) F. tularensis holarctica (tipo B) F. tularensis mediasiatica L identità nucleotidica media osservata confrontando i genomi è 97,7% F. tularensis novicida Kingry. et al. 204 Cell Inf Microbiol 4: -2 Materiale di partenza MILZA, FEGATO, RENE, ZECCHE, ACQUA ISOLATI BATTERICI BIOPSIE

6 Iter analitico Matrice-DNA screening identificazione NO Francisella spp. Francisella philomiragia tipizzazione F. tul. tularensis, F. tul. holarctica, F. tul. mediasiatica, F. novicida Geni target rilevare la presenza di Francisella spp. identificare Francisella tularensis tipizzare Francisella tularensis gene target tul4 ISFtu2 23kDa fopa 6S rdna RD 7 kda Lipoprotein Insertion Sequence Element protein expressed upon macrophage infection Outer membrane protein 6S rrna genomic Region of Difference

7 Rilevare la presenza di Francisella spp. di screening gene target:6s rdna M C- 75pb Matrice identificazione screening Francisella philomiragia NO Francisella spp.. F. tul. tularensis (A) 2. F. tul. mediasiatica 3. F. tul. holarctica (B) 4. F. novicida 5. F. philomiragia 6. Francisella-like tipizzazione F. tul. tularensis, F. tul. holarctica, F. tul. mediasiatica, F. novicida Forsmann. et al. 994 Int. J. Syst. Bact. 44: Identificare Francisella tularensis di identificazione gene target: tul 4 M C- Matrice 400pb screening identificazione Francisella philomiragia NO Francisella spp.. F. tul. tularensis (A) 2. F. tul. mediasiatica 3. F. tul. holarctica (B) 4. F. novicida tipizzazione F. tul. tularensis, F. tul. holarctica, F. tul. mediasiatica, F. novicida Sjostedt. et al. 997 J. Clin. Microbiol. 35:

8 Tipizzare Francisella tularensis 30 pb gene target: elicasi Tipizzare Francisella tularensis di tipizzazione gene target: elicasi Matrice tul B tul A nov C- M 500pb 400pb 300 pb 200 pb screening 00 pb identificazione tipizzazione Francisella philomiragia NO Francisella spp. F. tul. tularensis, F. tul. holarctica, F. tul. mediasiatica, F. novicida. F. tul. tularensis (A) 2. F. tul. mediasiatica 3. F. tul. holarctica (B) 4. F. novicida Johansson et al J. Clin. Microbiol 38:

9 Tipizzare Francisella tularensis Sono state identificate nel genoma di Francisella tularensis regioni (genomiche) che differiscono tra le diverse sottospecie o che sono presenti solo in una sottospecie. genomic regions of difference (RDs) Al fine diagnostico la più informativa è la regione chiamata RD Tipizzare Francisella tularensis di tipizzazione target: RD M VI tul B tul A nov C- M XVIII 3322 pb M tipizzazione 924 pb 522 pb 522 bp 3322 bp 453 bp 924 bp F. tul tularensis F. novicida F. tul mediasiatica F. tul holarctica Broekhuijsen M. et al J.Clin. Microbiol. 4 (7)

10 Real-time Sonda TaqMan Identificare Francisella tularensis di screening/identificazione gene target: 23 KDa Matrice screening identificazione NO Francisella spp. Francisella philomiragia tipizzazione F. tul. tularensis, F. tul. holarctica, F. tul. mediasiatica, F. novicida Versage. et al. 997 JCM 4:

11 Identificare Francisella tularensis di identificazione gene target: Ftt0523 Matrice screening identificazione NO Francisella spp. Francisella philomiragia tipizzazione F. tul. tularensis, F. tul. holarctica, F. tul. mediasiatica, F. novicida Mitchellel et.al. 200 Mol. Cell Probes 24: Tipizzare Francisella tularensis multiplex di tipizzazione target: RD e RD6 M M F. ph hi nov med tul A tul B Huber. et al Int. Syst. Evol. Microbiol. 4 (7)

12 Sub-tipizzare Francisella tularensis M Keim et al. 2007Ann. N.Y. Acad. Sci. 05: Sub-tipizzare Francisella tularensis MLVA Analysis? Vogeler et al. 2004J. Bacteriol. 9:

13 MLVA: Loci indagati Nome Locus Ft-M3 AATAAGGAT AACAAAGAC Motivo ripetuto Dimensione Ripetizione (n.basi) Nr. di ripetizioni Ft-M4 TTGTT Ft-M6 TTGGTGAACTTTCTTGCTCTT Ft-M0 TTTCTACAAATATCTT Ft-M3 CTCCAGGACCAA Ft-M20 ATTATTTTGATC Ft-M24 ATAAATTATTTATTTTGATTA 2-2 Johansson et al J. Bacteriol. 86: Francisella tularensis: tecnica MLVA Rivitalizzazione dei ceppi Estrazione DNA con primers specifici per ciascun «locus» considerato (7) Tul B /2/2000 Tul B 20/8/ /2005 F tul 993/09 Ref 2003 Tul B 998 Gp - Lepri autoctone 285/ / /200 Strain 964 Ref 0/08 Strain /2008 Gp 2 - Acqua Epidemia Toscana 42055/ /200 Gp 3 - Lepri Europa dell'est 29968/2009 Gp 3 - Lepri Europa dell'est 38595/ /08 CIMKA Bheyieneh 29587/ /20 Gp 3 - Lepri Europa dell'est 8660/ / / / /2009 ATCC 6223 Gp 4 - F. tularensis subsp. tularensis Analisi dei dati (cluster analysis e filogenesi) Elettroforesi e purificazione dei prodotti di Sequenziamento del frammento ed analisi degli elettroferogrammi

14 MLVA: ceppi indagati Isolati italiani: 5 da lepre da uomo 2 da acqua 3 isolati + 3 DNA da lepri importate dall Est Europa 2 Gamaleya Institute Mosca MLVA: risultati 33 ceppi ed i 3 DNA sono stati suddivisi in 4 MLVA cluster Cluster : tutti gli isolati italiani (2 ceppi) Cluster 2: 2 ceppi isolati da fonte d acqua in Toscana Cluster 3: 5 isolati/dna dell Europa dell Est Cluster 4: 2 ceppi da USSR Simpson index 0,82 (0,72-0,9 IC 95%)

15 MLVA: risultati ATTC / / / / / / / /20 Ref palearctica 8689/ / / / / / / /2005 F tul 93/ /200 Strain 994 Tul B /2/00 285/2006 Ref 2003 Ref 0/08 Tul B 20/8/00 Ceppi Epidemia Toscana (acqua) Ceppi Lepri Europa Est Ceppi Lepri Europa Est Cimka Ceppi Russi 99 Bheyieneh Ceppo ATCC 6223 F.t tipo A Strain Tul B 998 Ceppi da Lepri italiane Albero filogenetico basato sui loci Ft-M3, Ft-M6 e Ft-M24 MLVA: risultati

16 MLVA: risultati accertare la diversa provenienza geografica verificare se ceppi isolati da fonti diverse (acqua, lepri) sono tra loro genotipicamente diversi attuare un sistema di tipizzazione molecolare, utile in caso di focolai epidemici per indagare la sorgente di infezione allestire un database per confrontare i ceppi italiani con quelli di altri paesi (europei, USA) CanSNPs analysis: risultati

17 Whole genome sequences: risultati Whole genome sequences: risultati