Microscopia Ottica ed Elettronica

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1 Microscopia Ottica ed Elettronica

2 Coerenza sorgente-sistema ottico-rivelatore Sorgenti Luce visibile UV Raggi X Elettroni Lenti di vetro Lenti di vetro Sistemi ottici in via di sviluppo Campi elettromagnetici Rivelatori Film Scintillatori Schermi flluorescenti CCD

3 Confronto sorgenti De Broglie: Dualismo onda corpuscolo Luce Elettroni Onda: oscillazione campo e.m. Velocità (nel vuoto): fissa Lunghezza d onda: decimi di m Onda: eq. Schrödinger Velocità: variabile fino a ~ c Lunghezza d onda: pm (=10-6 m) Corpuscolo: Fotone Massa = 0 Carica = 0 Energia: pochi ev Corpuscolo Massa: 0 Carica: 0 Energia: kev MeV

4 Conseguenze pratiche Luce Elettroni Massa e carica zero + Energia bassa Massa e carica diversa da zero + Energia elevata Scarsa interazione con la materia Scarso assorbimento in aria (n~1) e nel vetro (n~1.5) Forte interazione con la materia Forte assorbimento Generazione elettroni secondari, raggi X, Strumenti funzionanti in aria Lenti di vetro fuoco fisso In trasmissione spessori decine di m Strumenti operanti sotto vuoto Lenti e.m. fuoco variabile In trasmissione spessori decine di nm ==================================== Lunghezze d onda 380 nm 780 nm ==================================== Lunghezze d onda dipende dalla loro velocità Picometri nm a 20kV nm a 200kV Limite di risoluzione fisico attorno al m (Max 2000 x) Limite di risoluzione fisico a livello sub-atomico

5 Nonstante queste differenze possiamo schematizzare i sistemi ottici in modo simile grazie alla Ottica geometrica Costruzione geometrica dell immagine tramite raggi, fasci e lenti idealizzate Indipendente dalla natura del fenomeno (onda/corpuscolo, fotoni/elettroni) Naturalmente questa astrazione andrà abbandonata non appena entrerà in gioco la natura fisica del fenomeno

6 Lenti Una lente è un elemento ottico che ha la proprietà di concentrare o divergere i raggi di luce. Normalmente è realizzata in vetro o materiali plastici.

7 Formazione delle immagini Una lente positiva o convergente focalizza un fascio collimato parallelo all'asse in un punto focale, a distanza f dalla lente. se un oggetto è posto a distanza S1 sull'asse della lente positiva di focale f, su uno schermo posto a distanza S2 si formerà l'immagine dell'oggetto.

8 Ottica geometrica A seconda delle posizioni dell oggetto rispetto al fuoco della lente ottengo immagini reali o virtuali, diritte o capovolte, ingrandimenti maggiori o minori di 1. Possiamo calcolare l ingrandimento: M = dy(i) / dy(o)

9 Il microscopio ottico Il miscoscopio ottico è uno strumento che consente di ingrandire l immagine di oggetti di piccole dimensioni per permetterne l'osservazione diretta o indiretta per esempio tramite fotografia

10 Fotocamera o telecamera Anatomia di un microscopio Oculari Stativo Fonte di illuminazione Vite macrometrica e micrometrica Revolver con obiettivi Tavolino traslatore Condensatore Diaframma di campo

11 Schema microscopio ottico 7. oggetto da osservare 8. lente obiettivo 9. immagine reale 10. lente oculare 11. immagine virtuale Combino le due situazioni precedenti: la lente obiettivo crea un immagine reale che diventa oggetto per la lente oculare. Da questa si forma un immagine virtuale e ingrandita.

12 Definizione di INGRANDIMENTO Riportiamo un immagine del nostro microscopio su di una lastra fotografica avente dimensioni 100 x 100 mm (L = 100 mm) Immaginiamo che le dimensioni reali del campo visivo riportato sulla lastra siano x = 0.20 mm. Possiamo allora calcolare l ingrandimento: M = L / x = 100 / 0.20 = 500 x Se immagino la lastra fotografica come un array da 1000 x 1000 pixel l oggetto piu piccolo che posso rappresentare avra dimensione d = x/1000 = 0.20/1000 = 200 nm.

13 Come aumentare l ingrandimento dimensioni lastra fotografica 100 x 100 mm (L = 100 mm)

14 Potere risolutivo Il potere risolutivo di un sistema ottico è la minima distanza tra due punti che riesco ad osservare come distinti. Per la luce visibile il principale fattore limitante e dovuto al fenomeno della diffrazione che porta ad un limite del potere risolutivo (Criterio di Rayleigh). La minima distanza fra i dischi di Airy, perchè siano distinguibili, deve essere uguale al loro raggio

15 Potere risolutivo Puo essere definito dalla teoria di Abbe e dal criterio di Rayleigh d = 1.22 λ / 2 n sin α Per migliorare il potere risolutivo dovrei aumentare l apertura del diaframma (aumenta α) ma questo introduce maggiori aberrazioni (raggi meno parassiali).

16 Potere risolutivo Puo essere definito dalla teoria di Abbe e dal criterio di Rayleigh d = 1.22 λ / 2 n sin α potere risolutivo d = 187 nm

17 Massimo ingrandimento utile dimensioni lastra fotografica 100 x 100 mm (L = 100 mm) array di 1000 x 1000 punti immagine Il potere risolutivo del microscopio, dalla legge di Abbe, consentira al massimo di rappresentare un punto oggetto di circa 200 nm. Le dimensioni reali del campo visivo riportato sulla lastra saranno quindi : x = 1000 x 200 nm = 200 mm = 0.20 mm. Possiamo allora calcolare l ingrandimento: M = L / x = 100 / 0.20 = 500 x Che rappresenta quindi il massimo ingrandimento utile. NB sono numeri compatibili col potere risolutivo del nostro occhio = 0.1 mm

18 Risoluzione vista con la teoria di Abbe Lente obiettivo con grande NA (+diaframmi e illuminazione intelligenti ) perché raccolgo il massimo possibile di angoli di diffrazione Corollario: è inutile ingrandire oltre il limite consentito da NA. Se non aumento il numero di spot di diffrazione raccolti, ingrandisco solo i dischi di airy Lunghezza d onda piccola perché a parità di periodicità l angolo di diffrazione si riduce (a parità di lente me ne entra un numero maggiore) Mic. El. Eliminando zone di diffrazione in modo intelligente si possono ottenere effetti di contrasto utili (contrasto di fase, campo scuro, )

19 Nella microscopia ottica a campo chiaro, il campione è visualizzato grazie alla luce che passa direttamente dal condensatore al vetrino. Si può optare per diversi ingrandimenti: 10x (per visualizzare l'intero campione), 40x (utile per osservare microrganismi di grosse dimensioni), 100x (per osservare batteri, miceti e alcuni dettagli morfologici). Il potere di risoluzione della microscopia a campo chiaro (determinato dalla lunghezza d'onda della luce usata per illuminare il campione e dal suo angolo di entrata negli obiettivi) è il fattore limitante di questa tecnica: può arrivare al massimo a discriminare dettagli nell'ordine del decimo di micron, usando lenti a immersione in olio. Spesso sono usate delle colorazioni, dato che gli indici di rifrazione degli organismi e dello sfondo spesso sono simili e risulta difficile distinguere il campione. Nella microscopia a campo scuro, invece, viene usato un condensatore che impedisce alla luce trasmessa di illuminare direttamente il campione: questo è raggiunto dalla luce diffusa solo se obliqua e risulta stagliato su uno sfondo nero. Il potere di risoluzione è 10 volte maggiore di quello della microscopia a campo chiaro (arriva a distiunguere dettagli di 0,02 micron) e consente di identificare i batteri più sottili. L'inconveniente è che la luce non attraversa i campioni: è possibile quindi studiarne i contorni ma non la loro struttura interna.

20 Osservazione in campo scuro Un particolare tipo di condensatore nell osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico

21 Campo chiaro (Bright-field illumination) Le superfici ortogonali al fascio di luce incidente appaiono chiare se esenti da difetti. I raggi diffusi in direzioni non ortogonali appaiono scuri. Campo scuro (Dark-field illumination) In questo caso le superfici ortogonali all asse ottico appaiono scure, mentre le superfici oblique all asse ottico appaiono chiare.

22 A seconda della disposizione del piano lucidato (superficie da analizzare) del campione rispetto al sistema di lenti:

23 MICROSCOPIO OTTICO METALLOGRAFICO (OM) Ingrandimenti: fino a 2000x. Limitato potere risolutivo (~ 1 μm) dovuto all impiego della luce, con lunghezza d onda all interno del campo del visibile. Bassa profondità di campo: impossibilità di mettere a fuoco dettagli posti su piani differenti (i provini devono essere necessariamente resi piani!). Non consente di osservare superfici di frattura. Poiché la microscopia ottica funziona in luce riflessa, necessita di un opportuna preparazione metallografica (superfici lucidate e spesso attaccate con opportuni reattivi)!

24 1. SCELTA DEL CAMPIONE Il campione deve essere rappresentativo del manufatto da cui viene ricavato. E bene prelevare più campioni dallo stesso pezzo. L operazione di prelievo deve essere effettuata in maniera tale da non alterare strutturalmente il materiale. 2. TAGLIO Il taglio viene eseguito in presenza di fluidi refrigeranti al fine di evitare alterazioni termiche. Altre tecniche di prelievo: frattura; taglio ossiacetilenico; taglio ad arco elettrico; taglio laser; taglio a getto d acqua.

25 3. MONTAGGIO O INGLOBAMENTO I provini vengono inglobati in formelle in resina. Lo scopo è quello di facilitare la manipolazione del campione e bloccarlo efficacemente durante le operazioni di spianatura e lucidatura. 4. LEVIGATURA E LAPPATURA Levigatura: passaggi su carte abrasive a granulometria controllata fino a grit. 150 grit = granuli abrasivi di diametro pari a 5 8 μm 2000 grit = granuli abrasivi di diametro pari a μm Lappatura: passaggi su dischi in tessuto cosparsi con soluzioni acquose abrasive (a base di allumina/pasta diamantata). diametro da 5 6 μm fino a μm 5. ATTACCO METALLOGRAFICO Evidenzia la struttura cristallina attraverso la corrosione selettiva operata dai reattivi sulle zone superficiali dotate di maggiore energia (es. bordi dei grani). La composizione chimica dei reattivi dipende dalla natura della lega metallica o delle fasi da mettere in risalto. L attacco chimico svolge una duplice funzione: ossidante nei confronti delle zone a maggiore contenuto energetico; lisciviante verso i prodotti di ossidazione per staccarli dalla superficie

26 SEM: Scanning Electon Microscopy

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28 SEM usato per topografia campioni a alti ingrandimenti, può arrivare a più di 300 kx. Usata spesso per ispezionare superfici di frattura, package cracks, difetti ecc. Durante la misura un fascio di elettroni è focalizzato su uno spot del campione, trasferendo energia allo spot. Questi producono degli altri elettroni, chiamati elettroni secondari, questi sono attratti da una griglia caricata positivamente e poi tradotti in un segnale. Il fascio è poi fatto passare su tutti i punti della superficie del campione, formando così un immagine della superificie. L energie del fascio primario determina la quantità di secondari che possono essere raccolti dal rilevatore. Più alta l energia del primario più è alto il numero di secondari emessi, fino ad un limite. Superato questo limite l emissione di elettroni secondati diminuisce all aumentare dell energia del fascio, in quanto il fascio comincia ad attivare fenomeni che molto al disotto della superficie. Questi elettroni molto spesso ricombinano prima di arrivare in suuperficie.

29 Insieme agli elettroni secondari, il fascio di elettroni primari produce l emissione di elettroni retrodiffusi o riflessi (backscattered). Questi hanno più energia dei secondari e vengono diffusi verso la sorgente, così c è bisogno di un diverso detector in una differente posizione. Gli elettroni con energia maggiore di 50eV sono considerati backscattered. Immagini ottenute tramite elettroni backscattered sono utili per distinguire i materiali, in quanto essi dipendono fortemente dal numero atomico dell elemento. Per avere un buon contrasto la differenza in numero atomico deve essere circa 3. Un SEM può anche essere equipaggiato con un EDX. Questo strumento permette di ottenere un analisi composizionale del campione. Può essere utile per identificare il materiale l eventuale presenza di contaminanti ed estimare la concetrazione superficiale degli elementi in superficie.

30 SEM: zone di provenienza dei segnali prodotti Fascio incidente SEM~5-50keV ~ 1 mm Volume di interazione superficie e - Auger E ~ ev e - secondari (SE) E ~ 1-10 ev e - retrodiffusi (BSE) E~10 kev raggi X caratteristici raggi X spettro continuo

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32 SEM: Elettroni secondari Efficenza (intensità) = SE / in SE = n. elettroni secondari in = n.elettroni incidenti maggiore per angoli grandi tra fascio e superficie Contrasto topografico scarsa dipendenza da Z Bassa energia piccola profondità di uscita Rivelatore maggiore per E minore (a causa della minor penetrazione)

33 SEM: Elettroni retrodiffusi (backscattered BS) Dipendenza del volume di provenienza da E (fascio incidente) e da Z e ρ (campione) BS Scarsa risoluzione spaziale

34 Secondary electron image Backscattered electron image

35 Preparazione campioni SEM Generalmente semplice Problema: Campioni non conduttori Caricamento elettrostatico Metallizzazione Basso vuoto Situazioni particolari: Campioni fragili in sezione Inglobamento in resina Levigatura - lucidatura Campioni metallici Taglio Levigatura - lucidatura Campioni polimerici frattura o taglio a freddo

36 Caricamento del campione sotto il fascio

37 Contaminazione del campione sotto il fascio

38 Più risoluzione Meno danneggiamento Piccola Immagine sgranata Piccolo Corrente Dimensione fascio Più danneggiamento Grande Immagine definita Grande Meno risoluzione

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40 Dettagli superficiali chiari Meno danneggiamento Meno effetti di bordo Piccola Meno caricamento Meno risoluzione Grande Energia Dimensione fascio Più danneggiamento Grande Più caricamento Piccolo Più effetti di bordo Più risoluzione Dettagli superficiali poco chiari

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42 La profondità di campo è limitata dalla risoluzione del sistema di raccolta: all interno di una certa distanza sopra e sotto il fuoco non si hanno dettagli all interno del pixel sul campione. Tuttavia la dimensione del pixel dipende dall ingrandimento: Aumentando l ingrandimento diminuisce la profondità di campo. La profondità di campo aumenta riducendo la dimensione della apertura finale aumentando la distanza di lavoro

43 Più profondità di campo Più risoluzione Piccola Immagine sgranata Diametro fenditura Meno profondità di campo Grande Meno risoluzione Immagine definita

44 Più risoluzione Piccola Meno profondità di campo Distanza di lavoro Meno risoluzione Grande Più profondità di campo (Anche per scendere agli ingrandimenti più bassi possibili)

45 EDS (o EDX): Energy Dispersive X-ray Spectroscopy Microanalisi Ionizzazione dei gusci interni Notazione incidente E = E in Stati non occupati emesso diffuso E = E in - E Energy Loss Li K: 55 ev per eccitare un elettrone K U K: 99 kev per eccitare un elettrone K

46 Diseccitazione: emissione di fotone X caratteristico Emissione isotropa Nomenclatura: fotone X - K (L -->K) fotone X - K (M-->K) fotone X - L (M-->L) ecc. Struttura fine: fotone X - K 1 (L III -->K) fotone X - K 2 (L II -->K) (con EL III > EL II )

47 Frenamento per interazione col nucleo diseccitazione : Bremsstrahlung incidente E = E in L K fotone X (continuo) L K diffuso E = E in - E Fondo E~ 100 ev - 10 kev molto assorbiti nel campione emissione dalla superficie (pochi nm); Competitivo con RX

48 Analisi quantitativa Basata sulla misura delle energie dei picchi di intensità Tutti i picchi coerenti con l energia di eccitazione devono essere presenti Mappatura degli elementi Basata sulla distribuzione spaziale dell emissione X Permessa dalla scansione Immagini rumorose a causa della scarsa emissione Analisi quantitativa Basata sul confronto delle intensità con campioni standard di riferimento Richiede correzioni per differente peso atomico, assorbimento e fluorescenza indotta

49 TEM: Trasmission Electon Microscopy

50 Microscopio elettronico in trasmissione (TEM) Aumentare il contrasto Selezionare riflessi diffrazione Apertura del condensatore Selezionare zone campione Apertura dell obiettivo Il microscopio elettronico in riflessione, detto a scansione (SEM), ha la sola apertura del condensatore Apertura dell oculare (area selector)

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53 Nel TEM un campione sottile viene irradiato con un fascio elettronico con una densità di corrente uniforme. Elettroni emessi dal gun e condensati e collimati tramite lenti magnetiche. Le lenti provvedono alla formazione di un immagine o un pattern di diffrazione del campione. La distribuzione di intensità degli elettroni è aumentata tramite altre lenti e mostrata su uno schermo fluorescente. Strumenti per analisi di routine hanno voltaggi trai 120 ai 200 kv. Mediumvoltage instruments lavorano a kv per avere una migliore trasmissione o risoluzione, negli High Voltage Electron Microscopy (HVEM) il range va da 500 kv to 3 MV. Il voltaggio determina la velocità, la lunghezza d onda e quindi la risoluzione del microscopio. I TEM possono essere suddivisi in: Conventional Transmission Electron Microscopy High Resolution Electron Microscopy Analytical Electron Microscopy Energy-Filtering Electron Microscopy High Voltage Electron Microscopy Dedicated Scanning Transmission Electron Microscopy

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57 TEM Aberration Correction L aberrazione cromatica è una distorione che si ha quando le lenti non riescono a focalizzare tutte le lunghezze d onda nello stesso punto: È necessario correggere l aberrazione, altrimenti l immagine risultante potrebbe essere offuscata; Alcune migliorie hanno migliorato la qualità dell immagine e le informazioni ottenibili sui campioni; Le aberrazioni sferiche invece si vedono quando i raggi paralleli che passano nella regione centrale della lente vengono focalizzati più lontano dei raggi che passano attraverso i bordi: Questo comporta la comparsa di punti focali multipli e di un immagine sfocata.

58 Imaging mode Punti differenti corrispono a punti differenti. Diffrazione dovuta dagli stessi punti convergono nella stessa imagine. Diffraction mode Direzioni differenti corrispondono a punti differenti del piano focale.

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62 Rappresentativo Sottile Campione per analisi TEM Omogeneo Pulito Opportunamento posizionato su griglia retino Necessaria preparativa dei campioni: Campione potrebbe dover essere inglobato: Paraffina; Resina; Mix paraffina e resine; Campioni vanno assottigliati preventivamente: Criomicrotomo; FIB.

63 Taglio dei campioni inclusi con un ultramicrotomo dotato di lama al diamante (a volte vetro). La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm. Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito nm).

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65 Con metalli pesanti come uranio e piombo si aumenta lo scattering elastico di membrane e inclusi nelle cellule I retini su cui sono state deposte le sezioni vengono immerse prima in acetato di uranile, lavati e successivamente in citrato di piombo

66 Montaggio delle sezioni su di una griglia. Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo. Visualizzazione al TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

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