Applicazioni biotecnologiche in systems biology

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Annibale Rota
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1 Applicazioni biotecnologiche in systems biology Lezione #12 Dr Marco Galardini AA 2012/2013

2 Systems biology Case studies Lezione #12 Dr. Marco Galardini AA 2012/2013

3 Cell cycle in α-proteobacteria M. genitalium whole cell model

4 Cell cycle in α-proteobacteria

Cell cycle in α-proteobacteria Il ciclo cellulare è una serie ordinata e periodica di eventi che determinano la crescita della cellula e la sua divisione in due cellule figlie.

5 Cell cycle in α-proteobacteria Il ciclo cellulare è una serie ordinata e periodica di eventi che determinano la crescita della cellula e la sua divisione in due cellule figlie. Comprende: -Replicazione del DNA -Crescita di volume -Formazione di nuove strutture cellulari (flagello, pilus etc etc) -Divisione cellulare From Emanuele CNRS, Lille

6 Cell cycle in α-proteobacteria Caulobacter crescentus, organismo modello per il ciclo cellulare: -Gram negativo - Vive in ambiente acquatico - Replica il DNA una volta sola a ciclo cellulare - Puo essere sincronizzato - La cellula madre e morfologicamente distinguibile dalla cellula figlia

7 Regolazione del ciclo cellulare nei batteri Caulobacter crescentus Stalked cell: - Presenza di un peduncolo con terminazione adesiva per aderire alle superfici - Cellula madre : produce molte cellule figlie Swarmer cell: - Presenza di un flagello chemotattico

8 Regolazione del ciclo cellulare nei batteri Caulobacter crescentus: Photo courtesy of Y. Brun

9 Regolazione del ciclo cellulare nei batteri Caulobacter crescentus: Photo courtesy of Y. Brun - Regolazione temporizzata di un grande numero di geni? - Quali sono questi regolatori e come attuano la loro funzione?

10 Trascrizione regolata durante il ciclo cellulare >3 >1.5 induzione 1:1 >1.5 >3 repressione 533 geni (19% del totale) sono regolati durante il ciclo cellulare Quali funzioni vengono attivate? Laub et al., Science, 2000, (290:2144-8)

11 Trascrizione regolata durante il ciclo cellulare >3 >1.5 induzione 1:1 >1.5 >3 repressione Laub et al., Science, 2000, (290:2144-8) L attivazione delle funzioni e contestuale al loro utilizzo Quali sono i regolatori trascrizionali (master regulators) che controllano questi processi?

12 MUTANTI DEL CICLO CELLULARE wild type DCC0138 DCC0744 DCC0909 DCC1063 DCC3315

13 wt Funzioni di CtrA ctra ts -Niente divisione cellulare -Niente strutture cellulari (flagello, piede, pilus ) -Accumula cromosomi (nessun controllo della replicazione del DNA)

14 Componenti fondamentali della regolazione del ciclo cellulare Sistemi a due componenti e fosforelay

15 Trascrizione regolata durante il ciclo cellulare >3 >1.5 induzione 1:1 >1.5 >3 repressione 144 geni su 533 sono regolati direttamente o indirettamente) da ctra come funziona il suo meccanismo di regolazione? come viene attuata la temporizzazione?

16 Sistemi di regolazione di CtrA Come è regolata la progressione del ciclo: Regolazione dell attività di CtrA: - Trascrizione di CtrA - Fosforilazione di CtrA - Degradazione proteolitica di CtrA

17 CtrA, regolazione attraverso fosforilazione CtrA controlla piu di 50 geni CtrA svolge la sua funzione solo nella forma fosforilata Attivazione/repressione trascrizionale di molti geni Regolazione trascrizionale diretta/indiretta Sequestro dell origine di replicazione Impedisce la duplicazione del cromosoma Perché parta la duplicazione cellulare la forma fosforilata di CtrA deve sparire CtrA (de-fosforilato) viene facilmente proteolizzato

18 CtrA, regolazione attraverso fosforilazione CtrA-P si trova nelle swarmer cells, dove inibisce la progressione del ciclo cellulare Quale meccanismo e implicato nell assenza di CtrA-P al momento giusto? Controllo trascrizionale del gene ctra De-fosforilazione di CtrA-P - Degradazione proteolitica Proteolisi di CtrA

19 CtrA, degradazione proteolitica

20 CpdR controlla la degradazione CtrA WT DcpdR CtrA

21 Feedback negativo di DivK su CtrA Biondi et al (2006) Nature

22 Feedback negativo di DivK su CtrA CtrA-P regola negativamente se stesso Via via che CtrA-P si accumula, DivK-P previene la fosforilazione di CtrA CtrA (defosforilato) viene quindi degradato, assicurando la replicazione del DNA Biondi et al (2006) Nature

23 Distribuzione asimmetrica di CtrA flagellum Come viene assicurato che CtrA-P sia assente nella cellula madre? A B stalk NB: ancora le cellule non sono separate, hanno quindi ancora in comune il citoplasma

24 Localizzazione asimmetrica di DivJ e PleC CtrA-P CtrA

25 Localizzazione dei sistemi a due componenti

26 Control of DivK phosphorylation DdivJ DpleC Il ciclo cellulare non viene mai fermato Molti cromosomi per cellula Inibizione della formazione del setto e separazione delle cellule Wild type Fenotipo meno severo

27 Biondi et al (2006) Nature CONCLUSION

28 Biondi et al 2006, Nature Brilli et al 2010, BMC Syst Biol Regolazione del ciclo cellulare in Caulobacter

29 Dove e conservata questa regolazione? a-proteobatteri Brucella abortus Sinorhizobium meliloti Rhodobacter sphaeroides Agrobacterium tumefaciens Hyphomonas neptunium Rhodopseudomonas palustris Gupta (2000) FEMS Micro. Rev.

30 Quali proteine di Caulobacter sono conservate? CtrA controlla gli stessi geni nelle altre specie? I regolatori di CtrA sono presenti?

31 Ricerca degli ortologhi di Caulobacter tramite BBH Conservazione modulare Conservazione in accordo con la filogenia

32 CtrA controlla gli stessi geni nelle altre specie? Ricerca della sequenza di regolazione a monte dei geni Conservazione della regolazione L autoregolazione di CtrA sembra mantenuta

34 M. genitalium whole cell model

35 M. genitalium whole cell model Batterio patogeno (parassita) del tratto genitale e respiratorio umano Parassita = genoma ridotto Solo 525 geni ~600 kb (E.coli ~6Mb) Usato come modello per capire il genoma minimo Qual e il minimo numero di geni capace di sostentare la vita?

36 Perche M.genitalium? Il basso numero di geni riduce il numero di calcoli e possibili interazioni Bottom-up approach Perche un whole cell model? Usare ODEs (equazioni differenziali) presuppone la conoscenza dei parametri di reazione Modelli costraint-based necessitano di indicare una objective function Un modello completo cellulare puo predire il comportamento cellulare a partire dalla concentrazione di ogni componente cellulare Scoprire la funzione di geni a funzione ignota In-silico mutagenesis

Model construction Divisione dei processi cellulari in 28 moduli indipendenti Ciascun modulo ha i suoi parametri e la propria implementazione matematica Parametri ricavati da

37 Model construction Divisione dei processi cellulari in 28 moduli indipendenti Ciascun modulo ha i suoi parametri e la propria implementazione matematica Parametri ricavati da 900 articoli e 1900 esperimenti I moduli sono considerati indipendenti per lasso di tempo brevissimo (~1s) Le concentrazioni degli input di ogni modulo dipendono dagli altri moduli

38 Model construction Le concentrazioni degli input di ogni modulo dipendono dagli altri moduli Calcolo indipendente lungo ~1s Ripetizione fino a divisione cellulare completa

39 Model Training and Validation Il contenuto di macromolecole (DNA, Lipidi, Proteine, RNA) predette dal modello sono comparabili a queli osservati sperimentalmente

40 Metabolic fluxes L intensita di colore delle reazioni indica il flusso La glicolisi appare >100 volte piu utilizzata rispetto alla via dei pentoso fosfati e dei lipidi

DNA binding proteins La maggior parte delle DNA-binding proteins tocca tutto il cromosoma con eguale probabilita La RNA polimerasi viene trovata piu spesso

41 DNA binding proteins La maggior parte delle DNA-binding proteins tocca tutto il cromosoma con eguale probabilita La RNA polimerasi viene trovata piu spesso nella regione dei geni rrna (sintesi proteica) Il complesso della DNA polimerasi viene trovata piu spesso verso il termine di replicazione che verso l origine Perche?

42 DNA binding proteins Le DNA-binding proteins esplorano la molecola di DNA molto velocemente L unica eccezione e il complesso della DNA polimerasi La prima parte del cromosoma e sintetizzata velocemente, poi si ha un forte rallentamento

Cell Cycle Control Il rallentamento della replicazione del cromosoma avviene nello stesso momento in cui la concentrazione dei dntp crolla I dntp sono il fattore limitante la

43 Cell Cycle Control Il rallentamento della replicazione del cromosoma avviene nello stesso momento in cui la concentrazione dei dntp crolla I dntp sono il fattore limitante la velocita del ciclo cellulare La produzione di dntp e strettamente legata al metabolismo Per Mycoplasma Genitalium il controllo del ciclo cellulare appare maggiormente metabolico che genetico

44 Main Molecules in metabolism ATP e GTP sembrano essere le monete di scambio principali per il metabolismo di M. genitalium

45 In-Silico mutagenesis: essential genes? Analisi della variazioni di vari parametri vitali dopo la rimozione di un gene dal modello 284 geni essenziali (~50%) In base al parametro toccato dalla mutazione si puo risalire alla funzione specifica del gene

46 In-Silico mutagenesis: correzione del modello Le differenze fra il mutante vero (tramite esperimento) e il modello servono per: correggere i parametri cinetici determinare la funzione del gene mutato

47 Bottom-up Perche M.genitalium? Il basso numero di geni riduce il numero di calcoli e possibili interazioni Problemi M. genitalium e difficile da manipolare sperimentalmente Microscopico (rispetto agli altri batteri) Alcuni parametri del modello sono ricavati da altre specie meglio studiate La messa a punto e rifinizione dell approccio permettera di creare modelli metabolici completi di altre specie

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