Modello matematico sulle oscillazioni della p53

Transcript

1 Genomica Funzionale e Bioinformatica Corso di Algoritmi per la Bioinformatica Modello matematico sulle oscillazioni della p53 Valentina Grandi

2 Ruolo di p53 P53 è un attivatore trascrizionale che preserva l integrità genomica nelle cellule dei mammiferi. Quando attivata induce la trascrizione di geni coinvolti nel ciclo cellulare e responsabili dell apoptosi. P53 è detta guardiano del genoma ed è mutata in più del 50% dei tumori umani. In risposta a stress ambientali (ad esempio danni al DNA o attivazione di oncogeni) p53: - stimola l arresto del ciclo cellulare, - stimola i processi di riparazione del DNA - induce apoptosi della cellula (nei casi più gravi) 2

3 Ruolo di Mdm2 A causa della serietà degli effetti prodotti, la concentrazione di p53 nella cellula è fortemente regolata. Un ruolo fondamentale nella regolazione di p53 è giocato da Mdm2: - inattivazione del gene di Mdm2 nei topi, causa aumento della concentrazione di p53, la cui eccessiva attività porta a morte embrionale; - sovraespressione di Mdm2, invece, inattivando completamente p53, stimola la formazione di tumori. 3

4 Ruolo di Mdm2 In condizioni normali, Mdm2 causa ubiquitinazione della proteina p53, stimolandone la degradazione e mantenendo, in questo modo, la concentrazione di p53 a un livello basso e costante. Inoltre il complesso p53-mdm2 inibisce l attività trascrizionale di p53. P53, al contrario, lega il gene mdm2 e ne stimola la trascrizione. 4

5 Evidenze sperimentali Recenti studi hanno dimostrato che le concentrazioni di Mdm2 e p53 in cellule irradiate subiscono una o più oscillazioni (a seconda della gravità del danno) di ampiezza e frequenza costante. TOPO IR = 5Gy UOMO Picchi di p53 dopo 1, 4 e 7 ore. Picchi di Mdm2 dopo 2 e 5 ore. Picchi di p53 dopo 2-3 e 6-7 ore. Picchi di Mdm2 dopo 4-5 e 9 ore. 5

6 Possibili modelli L andamento oscillatorio delle concentrazioni di p53 e Mdm2 pongono una sfida nella creazione di un modello: è risaputo che un feedback negativo è necessario, ma non sufficiente a produrre un andamento oscillatorio. Per ottenere le oscillazioni è necessario: 1. Un negative feedback loop oppure 2. Una combinazione di un feedback negativo e di un feedback positivo 6

7 Possibili modelli 1. Negative Feedback Loop Composto da 3 componenti: p53 che attiva un intermediario I, che a sua volta attiva Mdm2, che inibisce p53 p53 I Mdm2 2. Combinazione di un feedback negativo e di un feedback positivo - Self Activation P53 induce la trascrizione del proprio gene p53 Mdm2 7

8 Possibili modelli 1. Negative Feedback Loop Composto da 3 componenti: p53 che attiva un inibitore I, che a sua volta attiva Mdm2, che inibisce p53 p53 I Mdm2 2. Combinazione di un feedback negativo e di un feedback positivo - Mutual Inhibition p53 Mdm2 8

9 Basi del modello 1. Mdm2 e p53 sono degradate principalmente nel nucleo; 2. P53 è degradata in seguito ad ubiquitinazione. Mdm2 è responsabile dell attacco della prima ubiquitina, non si sa se ci sono altri enzimi che attaccano quelle successive. Si assume che Mdm2 attacca tutte le ubiquitine; 3. P53 viene degradato più efficacemente se ha attaccate almeno 5 ubiquitine. Si assume che Mdm2 (Mdm2 nuc ) attacca al massimo 2 ubiquitine: 9

10 Basi del modello 4. La trascrizione di Mdm2 è indotta da tutte e tre le forme di p53 (p53 tot = p53 + p53u + p53uu). Mdm2 è prodotta in una forma citoplasmatica, non fosforilata (Mdm2 cyt ). Inoltre l attività di p53 è molto aumentata quando la proteina lavora come tetramero si assume che p53 tot induce la trascrizione di Mdm2 seguendo una funzione di Hill con esponente 3; 5. Per essere traslocata nel nucleo Mdm2 cyt deve prima essere fosforilata dalla chinasi Akt (Mdm2 cyt MdmP2 cyt ); 6. Poiché il volume del nucleo è circa 1/10 o 1/20 del volume citoplasmatico, la concentrazione nucleare di Mdm2 cambia volte più velocemente di quella citoplasmatica. Si assume V ratio =15. 10

11 Basi del modello 7. L ingresso di Mdm2 nel nucleo è ostacolato in modo indiretto da p53 attraverso un lungo pathway che coinvolge PTEN, PIP3 e Akt: - Akt è attivato da PIP3, ma non da PIP2 - PIP3 è idrolizzato a PIP2 da PTEN PTEN inibisce indirettamente Akt, stabilizzando p53. La trascrizione di PTEN è indotta da p53. Si assume, per semplicità che la fosforilazione di Mdm2 cyt è inibita direttamente da p53 tot. 11

12 Basi del modello 8. I danni al DNA accorciano l emivita di Mdm2. Si introduce la variabile DNA dam, la cui sintesi dipende dalle radiazioni ionizzanti (funzione a gradino che può assumere solo valori 0 o 1) e che stimola la degradazione di Mdm2. In questa simulazione si applicano IR per 10 minuti (tra t=10 e t=20). 9. Si assume che DNA dam diminuisca proporzionalmente all attività di p53, seguendo una cinetica di Michaelis- Menten. 12

13 Basi del modello 13

14 Basi del modello k d53 k d53 k d53 +k d53 k a53 d[p53 tot ]/dt = k a53 -k d53 [p53 tot ]-k d53 [p53uu] 14

15 Basi del modello k d53 k r k r k f k f d[p53u]/dt = k f [Mdm2 nuc ][p53]+k r [p53uu] [p53u](k r +k f [Mdm2 nuc ])-k d53 [p53u] 15

16 Simulazioni In assenza di danni al DNA (IR=0, DNA dam =0), il sistema di equazioni differenziali ha una sola soluzione stazionaria: [p53 tot ] = 0,07 [p53u] = 0,02 [p53uu] = 0,01 [Mdm2 nuc ] = 0,33 [Mdm2 cyt ] = 0,12 [Mdm2P cyt ] = 0,01 assegnando ai parametri i seguenti valori: 16

17 Simulazioni Partendo dallo stato stazionario (0<t<10), si introduce una dose di radiazioni ionizzanti (IR=1) per 10<t<20. Questo porta ad un rapido aumento del DNA danneggiato e del valore di k d2 (rate constant per la degradazione di Mdm2) iniziano le oscillazioni di p53 e MDM2 nuc. Ogni volta che p53 tot aumenta, DNA dam diminuisce, così come k d2, finchè il sistema non torna alla situazione iniziale. p53 tot DNA dam Mdm2 nuc k d2 17

18 Simulazioni L aumento di p53 causa diminuzione iniziale di Mdm2P cyt e un aumento di Mdm2 cyt. Quando una quantità sufficiente di Mdm2 si è accumulata nel citoplasma, Mdm2P ricomincia a entrare nel nucleo e a stimolare la degradazione di p53. Questo toglie l inibizione sulla fosforilazione di Mdm2, causando aumento di Mdm2 nuc.la diminuzione della concentrazione di p53 riduce la produzione di Mdm2 cyt, riportando il sistema alla condizione iniziale Per i valori dei parametri scelti due oscillazioni sono sufficienti a riportare il sistema alla situazione iniziale; per danni maggiori sarebbero necessarie un maggior numero di oscillazioni. Mdm2 cyt Mdm2P cyt 18

19 Diagrammi delle biforcazioni In condizioni di riposo (k d2 <k SNL ) il sistema ha solo un punto fisso stabile, con p53 a basse concentrazioni. k d2 = k SNL punto di biforcazione Saddle-Node Loop Per k d2 > k SNL il punto fisso è diventato instabile ed è circondato da un ciclo limite stabile. Ogni oscillazione riporta il sistema verso lo stato di riposo iniziale, in quanto p53 induce la riparazione del DNA. Biforcazione Saddle- Node a k d2 = 0,0018 Biforcazione Saddle-Node Loop a k d2 = 0,

20 Diagrammi delle biforcazioni Sembra plausibile che la cellula reagisca ai danni o attivando totalmente il programma trascrizionale controllato da p53 o non reagendo affatto. Questo significa che le oscillazioni devono avere un ampiezza elevata. Ad esempio in questo modello per attivare la risposta della cellula il segnale deve essere abbastanza forte: k d2 k SNL. Esistono altri tipi di biforcazioni, oltre a quello gia visto, che tengono conto di questo fatto e che sono, quindi, possibili alternative (es. Subcritical Hopf bifurcation). 20

21 Diagrammi delle biforcazioni Subcritical Hopf bifurcation Nel punto di biforcazione le oscillazioni iniziano con grande ampiezza questo tipo di biforcazione è possibile Supercritical Hopf bifurcation Nel punto di biforcazione le oscillazioni iniziano con bassa ampiezza questo tipo di biforcazione è poco probabile 21

22 Confronto coi dati sperimentali Sia nella simulazione del modello, sia durante l esperimento in laboratorio si è riscontrato: come conseguenza delle radiazioni, la forma nucleare di Mdm2 all inizio diminuisce, mentre p53 aumenta le concentrazioni di p53 e Mdm2 continuano a oscillare fuori fase con un periodo di circa 400 minuti il segnale è localizzato nel nucleo (infatti nel modello le forme citoplasmatiche di Mdm2 hanno concentrazioni molto più basse rispetto a quella nucleare). Una differenza che si è riscontrata è che nel modello, quando la concentrazione di p53 è elevata, Mdm2 nuc è molto bassa, gli esperimenti in laboratorio, invece, mostrano che la concentrazione di Mdm2 nuc è già elevata quando p53 raggiunge il massimo. Tuttavia è possibile che parte del Mdm2 misurato durante l esperimento fosse citoplasmatico. 22

23 Conclusioni Abbiamo detto che per ottenere le oscillazioni è necessario: 1. Un negative feedback loop (NFL) oppure 2. Una combinazione di un feedback negativo e di un feedback positivo (NPF) Possibili esperimenti per distinguire tra queste due ipotesi: Eliminare il feedback positivo: p53 PTEN -- Akt Mdm2 -- p53 Ad esempio creando un mutante di Mdm2 che non richieda fosforilazione per entrare nel nucleo. Se non osservo oscillazioni allora la teoria del NPF è corretta. Altrimenti potrei comunque avere altre forme di feedback positivo (es. autoattivazione). 23

24 Conclusioni Eliminare il feedback loop negativo Ad esempio creando un mutante in cui Mdm2 ha espressione basale indipendente da p53. In entrambi i casi non osservo oscillazioni, però i due sistemi rispondono in modo diverso Overesprimendo p53 tramite un promotore inducibile: - NFL: i livelli di p53 aumentano e poi tornano alla concentrazione iniziale quando termina l induzione. - NPF: il feedback positivo è attivo e determina un sistema bistabile: l aumento di p53 spinge la cellula verso il punto fisso temporaneo (alta p53). Quando termina l induzione, il sistema non ritorna allo stato originale ma ad una stato con livelli di p53 elevati. 24

25 Bibliografia Ciliberto, Novak, Tyson (2005) Steady states and oscillations in thep53/mdm2 network, Cell Cycle, 4 (3) Bar-Or, Maya, Segel, Alon, Levine, Oren (2000) Generation of oscillations by the p53-mdm2 feedback loop: a theoretical and experimental study, Proc. Natl. Acad. Sci., 97,