Enterobacteriaceae. Sono microrganismi ubiquitari che normalmente colonizzano l intestino dell uomo e della maggior parte degli animali.

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1 Enterobacteriaceae

2 Enterobacteriaceae Le Enterobacteriaceae rappresentano il più ampio gruppo di batteri gram-negativi di rilevante interesse nella microbiologia clinica, Sono microrganismi ubiquitari che normalmente colonizzano l intestino dell uomo e della maggior parte degli animali. Tuttavia, sono agenti eziologici di diverse patologie nell uomo, in particolare sono responsabili di: Oltre il 50% di tutte le Setticemie; Più del 70% delle Infezioni delle Vie Urinarie; Molte Infezioni Gastro-intestinali.

3 Nella famiglia delle Enterobacteriaceae ci sono specie prettamente Patogene come: Enterobacteriaceae Salmonella typhi, Shigella spp. e Yersinia pestis. Specie Opportuniste della flora intestinale come: E. coli, Klebsiella e Proteus mirabilis. Specie Commensali Le specie commensali, tuttavia, possono acquisire mediante trasferimento genico orizzontale geni che codificano fattori di virulenza come i ceppi di E. coli enteropatogeni (EPEC).

4 Enterobacteriaceae: Caratteristiche Comuni Gram-negativi di Forma bastocellare; Estremità arrotondate e tipicamente di 4-5µm di lunghezza; Asporigeni; Mobili e con flagelli peritrichi; Aerobi-anaerobi facoltativi; Crescono su differenti terreni di coltura: terreno di elezione agar Mac-Conkey. Fermentano il glucosio; Catalasi-positivi; Ossidasi-negativi: per la mancanza del Citocromo C; Riducono il nitrato.

5 Principali antigeni delle Enterobacteriaceae Le specie batteriche appartenenti a questo genere sono antigenicamente molto complesse ma possono essere identificati in base a tre antigeni fondamentali:

6 Antigene K (Vi): è rappresentato dal polisaccaride capsulare, definito solo nella specie Salmonella typhi Antigene Vi. E associato alla virulenza dei batteri, e la sua presenza si associa a diverse patologie, un tipico esempio sono i ceppi E. coli caratterizzati dall antigene K1 responsabile di meningite neonatale. L antigene K può interferire con la ricerca dell antigene Somatico O, ma può essere rimosso dalla cellula batterica mediante bollitura poiché è labile al calore. Esistono oltre 100 differenti tipi di Antigeni K. Antigene H: è rappresentato dalle proteine flagellari, può essere denaturato o rimosso con alcool o al calore. Le specie immobili (Shigella) ne sono sprovvisti. Può essere identificato mediante reazione di Agglutinazione con anticorpi IgG anti-h e ne esistono oltre 50 differenti tipi. Antigene Somatico O: è rappresentato dalla catena polisaccaridica del lipopolisaccaride (LPS) è resistente al calore e all alcool. Può essere identificato mediante agglutinazione con IgM anti-o. Svolge in alcune specie funzione di adesina (ceppi dei E. coli responsabili di diarrea ed infezione delle vie urinarie, UPEC). Ne esistono oltre 150 differenti tipi.

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8 Classificazione I membri della famiglia delle Enterobacteriaceae sono strettamente correlati tra di loro geneticamente: i loro genomi hanno un elevato grado di omologia di sequenza. Sono noti più di 31 generi e 100 specie appartenenti a tale famiglia, ed almeno 20 di queste specie sono molto importanti dal punto di vista medico ed epidemiologico. La Tassonomia degli enterobatteri è molto complessa ed in continuo dinamismo. La Classificazione dei generi e delle specie è effettuata solitamente sulle: Proprietà biochimiche, che definiscono le specie; Struttura antigenica, che definisce i sierotipi all interno di una specie; Tecniche molecolari e di sequenziamento degli acidi nucleici, che definiscono le specie.

9 Classificazione I generi più patogeni per l uomo e quindi di maggior rilievo nella patologia umana sono: Escherichia; Shigella; Proteus; Salmonella; Klebsiella e Yersinia. I batteri appartenenti agli altri generi sono solitamente commensali del nostro microbiota intestinale e talvolta opportunisti che possono causare infezioni comunitarie e/o ospedaliere.

10 Identificazione: Fermentazione del lattosio La capacità di fermentare il lattosio è considerata una delle caratteristiche chiave per l identificazione degli Enterobatteri. Molti generi posseggono l operone lac, che permette la fermentazione di questo zucchero, il quale è uno dei primi con cui l essere umano viene a contatto alla nascita, facilitando in tal modo la colonizzazione del tratto gastrointestinale e modellando così la composizione del microbiota. Viceversa molte specie patogene per l uomo non sono in grado di fermentare il lattosio. Lactose negative: Salmonella spp., Shigella spp.. e Yersinia spp. Eosina-Blu di Metilene agar MacConkey agar Lactose positive: E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter

11 L'agar MacConkey è un terreno non molto selettivo in quanto la concentrazione di sali biliari, che inibiscono i microrganismi Gram-positivi, è bassa rispetto ad altre tecniche di piastratura per enterobatteri. Il terreno è ideale per campioni clinici contenenti microflora mista provenienti da urina, distretto respiratorio, ferite, ecc., in quanto consente di effettuare una prima classificazione degli enterobatteri e degli altri Gram-negativi in fermentanti e non-fermentanti il lattosio. L'agar MacConkey viene utilizzato anche per le analisi microbiologiche degli alimenti e per inibire più efficacemente la sciamatura della genere Proteus. Nel MacConkey Agar i principali costituenti sono: peptoni, il cristal-violetto che inibisce i batteri Gram-positivi, in particolare enterococchi e stafilococchi, e la differenziazione degli enterobatteri si ottiene combinando lattosio e rosso fenolo come indicatore di ph. Si ottengono colonie incolori o rosa-rosse a seconda della capacità dell'isolato di fermentare il lattosio.

12 EMB Agar, contiene i coloranti eosina Y e blu di metilene, che inibiscono parzialmente i batteri Gram-positivi. I coloranti sono utilizzati anche come indicatori differenziali in risposta alla fermentazione di lattosio da parte dei microrganismi. I coliformi producono colonie blu scuro mentre le colonie di Salmonella e Shigella sono incolori o assumono una colorazione ambra trasparente. Le colonie di E. coli possono presentare caratteristici riflessi metallici verdi dovuti alla fermentazione rapida del lattosio. L'EMB agar è inserito nel gruppo di terreni di isolamento a bassa selettività per le Salmonelle nei campioni fecali e di altra provenienza. I batteri Gram-positivi, come streptococchi fecali, stafilococchi e lieviti, sono inibiti o possono crescere su questo terreno formando colonie puntiformi.

13 Identificazione: Fermentazione del glucosio Poiché l identificazione degli Enterobatteri è molto complessa vengono sfruttate anche altre proprietà: viene infatti anche valutata la capacità di fermentazione del glucosio, L identificazione deve seguire delle linee guida ben stabilite che prevedono la semina del campione biologico (Copros) su terreni selettivi e differenziali come l EMB e il MacConkey agar, Stabilito se la specie identificata è in grado di fermentare o meno il lattosio si verifica la via di fermentazione del glucosio utilizzata dalla specie in esame, I test più utilizzati sono due: il Test Voges-Proskauer (VP) e il test del Rosso Metile, Il primo verifica la capacità di fermentare il glucosio con produzione di acido acetico, Acetoina e da qui Butanediolo, la presenza dell indicatore rosso fenolo nel terreno, determinerà un viraggio del colore dal giallo al rosso scuro è il test sarà positivo consentendo una presuntiva identificazione delle specie, Se il test del Rosso Metile è positivo indica, viceversa, che dalla fermentazione del glucosio vengono prodotti acidi diversi, come l acido lattico e l acido succinico, consentendo sempre la presuntiva identificazione di specie.

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15 Fattori di virulenza: Patogenesi Essendo gli Enterobatteri dei microrganismi gram-negativi hanno dei fattori di virulenza comuni come l endotossina o lipide A del lipopolisaccaride, Tuttavia, essendo microrganismi responsabili di diversi quadri morbosi nell essere umano (che vanno da infezioni opportunistiche e infezioni intestinali a setticemia) hanno una molteplicità di determinanti di virulenza, Tali fattori svolgono funzioni diverse nelle varie fasi del ciclo infettivo: Adesine Capsula Resistenza al killing sierico Sequestro dei fattori di crescita Sistemi di secrezione di tipo III Variazione genica

16 Fattori di virulenza

17 Fattori di virulenza La maggior parte degli enterobatteri è dotato di Pili e Fimbrie come principali Adesine coinvolte nell adesione ai recettori della cellula ospite. Queste strutture mostrano un marcato tropismo per tipi cellulari differenti. I Pili sono classificati da 1 a 4 e sono responsabili della specificità d ospite e di organo. I Pili di tipo 1 sono espressi in fase stazionaria e sono coinvolti nella fase di colonizzazione consentendo al batterio di resistere alla peristalsi ed al flusso intestinale. Legano il D-mannosio comunemente presente sulla superficie delle cellule epiteliali. I Pili di tipo 2 viceversa sono considerati fattori di virulenza poiché sono utilizzati dal batterio per colonizzare e causare malattia al di fuori della propria nicchia abituale. Un particolare tipo di adesine sono i Pili P espressi dai ceppi di E. coli uropatogeni (UPEC), tali adesine legano i P- glicolipidi delle cellule epiteliali uretrali e renali, consentendo al batterio di invadere il tratto urinario poiché resistono alla peristalsi uretrale e al flusso dell urina.

18 Fattori di virulenza La capsula: è un importante fattore di virulenza di molti enterobatteri, avvolge la cellula batterica ed è composta da polisaccaridi acidi composti da 2-3 zuccheri caratteristici di ogni microrganismo. Protegge gli enterobatteri dalla fagocitosi grazie ad antigeni capsulari idrofilici che respingono la superficie idrofobica del fagocita. Tale antigene interferisce con il legame degli anticorpi alla cellula batterica, tuttavia è un debole immunogeno ed anche un debole attivatore del complemento. Alcune specie non hanno una capsula bene definita, i polisaccaridi tendono ad aggregarsi disordinatamente in una struttura amorfa detta slime-layer. Variazione di fase: L antigene capsulare K e le adesine (fimbrie) sono sotto il controllo genico del microrganismo e possono essere espressi in modo alternativo durante le diverse fasi del ciclo infettivo in risposta alle condizioni ambientali proteggendo il batterio dalla morte cellulare anticorpo-mediata. L espressione è regolata da un meccanismo di interruttore molecolare ON/OFF.

19 Sistemi di secrezione di tipo III: sono apparati proteici macromolecolari utilizzati dal batterio per secernere nella cellula ospite specifiche proteine la cui sintesi è di solito indotta da segnali ricevuti dall interazione cellula ospite-batterio. In assenza di segnali il sistema è assemblato ma non attivo. Fattori di virulenza E solo il contatto con la cellula ospite che induce una variazione conformazionale permettendo la localizzazione della struttura nella membrana citoplasmatica della cellula eucariotica dove forma un poro multimerico di traslocazione. Solitamente le componenti del sistema interagiscono con i microdomini della membrana della cellula ospite ricchi in colesterolo. Dal momento in cui l ago è in una conformazione aperta può iniettare le molecole effettrici come tossine ed esoenzimi nel citosol della cellula ospite. I sistemi di secrezione possono essere indotti anche da stimoli ambientali come la tensione di O 2, la concentrazione di ioni Ca 2+ e la disponibilità di sostanze nutritive.

20 Fattori di virulenza Molti microrganismi appartenenti a questa famiglia hanno evoluto dei sistemi per far fronte hai continui cambiamenti di habitat cui vanno incontro durante il loro ciclo infettivo e soprattutto ad utilizzare le sostanze nutritive a loro disposizione, a tale scopo hanno messo a punto dei Sistemi di sequestro dei fattori di crescita. Il ferro è un importante fattore di crescita per i microrganismi, che nel corpo umano è però legato al gruppo eme dell emoglobina o alle proteine chelanti il ferro come transferrina e lattoferrina. Gli enterobatteri sono in grado di sottrarlo producendo i propri composti chelanti come i siderofori: Enterobactina e Aerobactina. L Aerobactina era originariamente sintetizzata dalla Specie Enterobacter aerogenes, successivamente Salmonella spp., Shigella spp. e E.coli hanno acquisito il gene codificante la molecola mediante trasferimento genico orizzontale.

21 I siderofori batterici hanno maggiore affinità di chelare il ferro rispetto alle transferrine eucariotiche Sono molecole a Basso Peso Molecolare con elevata affinità per Fe3+, lo legano lo solubilizzano e lo trasportano ad un trasportaore transmembrana I complessi siderofori-ferro lo riducono a Fe2+ e sono poi trasportati mediante proteine trans-membrana all interno del citoplasma.

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23 Fattori di virulenza Resistenza al killing sierico: I microrganismi in grado di causare infezioni sistemiche (Salmonella e E. coli K1) hanno una resistenza costitutiva verso il complemento e gli anticorpi. La capsula previene il legame della componente C3 del complemento, attivata in seguito al riconoscimento del microrganismo; In tal modo previene la formazione di immunocoplessi dovuta al riconoscimento degli zuccheri terminali dell antigene O del Lipopolisaccaride.

24 Azione Patogena Infezioni sistemiche, come ad esempio le febbri enteriche in cui l interessamento intestinale è accompagnato o conseguente ad una diffusione del microrganismo per via ematica o linfatica. Infezioni primitive ed esclusivamente intestinali, prevalentemente enteriti o gastro-enteriti causate da ceppi di Salmonella, Shigella e da alcuni stipiti di E. coli. Invasive: colonizzazione distale dell intestino, i batteri penetrano nella mucosa causando delle evidenti alterazioni istopatologiche con forti sintomi dissenterici. Non Invasive: sono causate soprattutto da stipiti di E. coli che producono enterotossine (ETEC), si localizzano al livello dell ileo e causano soprattutto diarrea per un alterato assorbimento dei liquidi. Le Infezioni a localizzazione extraintestinali, sono soprattutto infezioni genito-urinarie che riguardano vescica (cistiti) e reni (pieliti) causati in grande maggioranza da E. coli (UPEC).

25 Azione Patogena Le infezioni a localizzazione intestinale o sistemica sono di norma infezioni esogene dovuti all ingestione di cibi contaminati da materiale fecale di soggetti infetti. TRASMISSIONE ORO-FECALE Le Infezioni a localizzazione extraintestinale sono normalmente infezioni endogene e fanno seguito alla diffusione in altre sedi dell organismo di enterobatteri che esplicano il loro potenziale patogeno grazie all attività antifagocitaria delle strutture di superficie, all adesività e all effetto tossico del lipide A dell LPS. INFEZIONI OPPORTUNISTE

26 Le fonti esogene di infezione sono solitamente fonti animali; Anche se alcuni patogeni sono esclusivamente umani. La flora endogena è responsabile di infezioni opportuniste, In particolare infezioni delle vie urinarie.

27 Sensibilità e resistenza agli antibiotici La sensibilità degli Enterobatteri ai farmaci antibatterici è molto variabile Ceppi MDR: La pressione selettiva esercitata dall ampio e indiscriminato uso di antibiotici ha favorito la diffusione di ceppi con un fenotipo di Multi-resistenza (Multidrug-Resistant), responsabili di infezioni in ambito nosocomiale. Enterobatteri produttori di ESBL ESBL: produttori di β-lattamasi a spettro esteso, ceppi di Klebsiella, E. coli, Proteus mirabilis. Negli enterobatteri è comune la presenza di β-lattamsi plasmidiche e cromosomiche, che sono prevalentemente Cefalosporinasi presenti in diversi stipiti.

28 Sensibilità e resistenza agli antibiotici Cefalosporinasi

29 Sensibilità e resistenza agli antibiotici Negli anni 60 è stata identificata in ceppi di E. coli la prima beta-lattamasi a codificazione plasmidica, chiamata TEM-1, in grado di idrolizzare sia Cefalosporine che Penicilline. Essendo mediata da elementi genetici mobili questa resistenza si è rapidamente diffusa tra gli enterobatteri e anche a batteri appartenenti a generi e specie diverse come H. influenzae e N. gonorroheae. Negli anni 80 si è verificato un drammatico aumento di ceppi ESBL in grado di resistere non solo ai beta-lattamici di 1 e 2 generazione ma anche a quelli di 3 generazione, in particolare tali ceppi sono anche produttori di Carbapenemasi in grado di idrolizzare i Carbapenemici che sono gli antibiotici beta-lattamici di ultima generazione.

30 A partire dalla fine degli anni 90, negli USA sono emersi Enterobatteri produttori di β- lattamasi definite carbapenemasi, in grado di inattivare anche i carbapenemi. Tra queste, quella più diffusa è la KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase). I ceppi produttori di KPC sono molto spesso pan-resistenti (o quasi) in quanto alla resistenza ai carbapenemi si associano resistenze multiple ad altre classi di antibiotici. Gli Enterobatteri produttori di carbapenemasi rappresentavano fino a pochi anni fa un fenomeno raro nella realtà europea, ma a partire dal 2009 si sono diffusi velocemente e, secondo i dati diffusi dal European Center for Disease Control, nel 2010 l Italia è, dopo la Grecia, il paese Europeo più colpito. Ma arrivano i superbatteri indiani. Nel 2009, un paziente svedese tornò dall India con una infezione da Klebsiella pneumoniae multiresistente per la produzione di una nuova carbapenemasi. A distanza di poco tempo ceppi di K. pneumoniae ed E. coli con lo stesso profilo di resistenza vennero isolati da pazienti che avevano soggiornato in Ospedali Indiani e Pakistani per trattamenti medici ed estetici e in seguito si evidenziò come questi batteri fossero già largamente diffusi in tutto il subcontinente indiano. Per questo motivo il nuovo determinante di resistenza, appartenente alla famiglia delle metallo-beta-lattamasi (MBL), fu chiamato NDM-1 (New Delhi Metallo-βlactamase type1). Ormai batteri NDM-1 hanno raggiunto USA, Canada, Australia ed Europa.

31 Sensibilità e resistenza agli antibiotici La maggior parte delle β-lattamasi ad ampio spettro è codificata da geni localizzati in grandi plasmidi di ~80-100Kb, che favoriscono la diffusione di resistenza tra specie diverse. Molto spesso tali plasmidi codificano per la resistenza verso amminoglicosidi e tetracicline generando fenotipi multiresistenti.

32 Escherichia coli Il genere Escherichia è uno dei più caratterizzati appartenenti a questa ampia famiglia, comprende 5 specie, ma solo la specie E. coli è clinicamente importante per l essere umano. L habitat naturale del genere Escherichia è l intestino crasso dell uomo e di molti animali, nel quale si comporta come un innocuo commensale. In altri distretti corporei può comportarsi da opportunista causando diverse manifestazioni cliniche. Possiede l antigene O, l antigene K e H, utili per la classificazione sierologica. Presenta spiccate proprietà adesive grazie alla presenza di Fimbrie.

33 Escherichia coli: Patogenesi L innesco del processo infettivo è mediato dalla presenza di Adesine e Enterotossine responsabili nel determinare la sede dell infezione ed il quadro clinico. Adesine: consentono l adesione alle cellule epiteliali dell ospite, ne esistono differenti tipi nei diversi stipiti isolati: Fattore di colonizzazione (CFA/I, II e III), Adesine aggreganti (AAF/I e II), Pili a fasci (BfP), Pili P, Intimina, Antigene plasmidico di invasione (Ipa), Fimbrie D. Enterotossine: Tossina Shiga-like (Stx1 e 2), Enterotossine termostabili (STa e STb), Enterotossine termolabili (LTI e II),

34 La Tossina shiga-like, è una tossina A-B. La subunità A inibisce la sintesi proteica legando l RNA 28S nella subunità 60S del ribosoma, blocca il legame con l ammminoacil-t-rna. La subunità B riconosce un recettore glicolipidico Gb3 sulla superficie delle cellule eucariotiche. La Tossina termolabile LT è una tossina A-B. La subunità B lega la membrana cellulare mentre la subunità A ha attività ADP-ribosilante per una proteina G nelle cellule epiteliali intestinali (enterociti) con conseguente stimolazione dell adenilato ciclasi ed aumento camp. La Tossina termostabile ST, è un peptide di piccole dimensioni che lega un recettore cellulare glicoproteico con conseguente attivazione della guanilato ciclasi, il conseguente aumento di concentrazione del cgmp.

35 Patologie Principali Setticemia: Per setticemia si intende l invasione di tessuti, fluidi o cavità corporee normalmente sterili. Origina generalmente da un infezione delle vie urinarie o del distretto gastroenterico. Di solito la setticemia da E. coli è favorita da una pregressa patologia (cirrosi epatica, diabete e neoplasie) o da immuno-compromissione. Nei soggetti immunocompetenti i neonati sono maggiormente predisposti a questo tipo di setticemia per la mancanza di un sistema immunitario sviluppato e soprattutto per la mancanza di IgM circolanti. Infezioni urinarie: sono infezioni di tipo ascendente, ovvero i batteri che derivano dal colon possono contaminare l uretra (cistite) e risalgono sino alla vescia, al rene o alla prostata (pleionefrite). Le infezioni delle vie urinarie sono associati a ceppi uropatogeni (UPEC) in grado di produrre Adesine, pili P, adesine aggreganti AAF/II e III e Fimbrie, che mediano il legame alle cellule epiteliali di rivestimento della vescica e delle vie urinarie impedendo l eliminazione del batterio con la minzione. I ceppi produttori di Emolisina (HlyA) favoriscono le infezioni urinarie: la lisi cellulare porta al rilascio di citochine e ad una forte risposta infiammatoria.

36 Patologie Principali Meningiti neonatali: E. coli è uno dei principali responsabili di infezioni del sistema nervoso centrale nei neonati. La maggior parte dei ceppi che causano meningite (>75%) possiede l antigene capsulare K1. Spesso i ceppi di E. coli K1 si isolano nell intestino di donne gravide e di neonati. Gastroenteriti: La gastroenterite è una malattia caratterizzata da un'infiammazione del tratto gastrointestinale che coinvolge sia lo stomaco che l'intestino tenue è l infezione più comune causata da E. coli. In base alla modalità di patogenesi i ceppi batterici possono essere suddivisi in: Enterotossigeni (ETEC); Enteropatogeni (EPEC); Enteroinvasivi (EIEC); Enteroemorragici (EHEC); Enteroaggreganti (EAEC).

37 E. coli Enteropatogeno (EPEC) Sono causa di malattia diarroica nei pazienti in età pediatrica, La malattia è causata dalla capacità dei batteri di aderire all'epitelio dell'intestino tenue e di interferire con l'assorbimento delle sostanze grazie all azione di adesine a codificazione plasmidica, Ciò provoca la formazione di un ambiente iperosmolare nel lume dell'intestino, distruzione dei microvilli e conseguente diarrea, I ceppi EPEC formano microcolonie simili a calici sulla superficie delle cellule epiteliali con strutture simili a piedistalli, L adesione all'epitelio e la distruzione dei microvilli avviene grazie ai pili Bfp che stabiliscono dei blandi legami con la mucosa, L interazione della cellula ospite attiva un T3SS che consente di traslocare e inserire sulla membrana della cellula ospite il recettore TIR per l Intimina, oltre che secernere fino a 30 proteine di secrezione definite Esp, Il recettore per l intimina permette il legame tenace di E. coli, grazie all'intimina espressa sulla membrana del batterio.

38 E. coli Enteropatogeno (EPEC)

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40 E. coli Enterotossigeni (ETEC) I ceppi ETEC sono in grado di provocare gastroenteriti molto gravi, soprattutto nei viaggiatori e nelle persone che hanno ingerito cibi o liquidi contaminati da feci. Producono sia tossine termolabili (LT-1 e LT-2) che tossine termostabili (STa e STb). La tossina LT-1 ha struttura e meccanismo di azione similare alla tossina colerica, E formata da una subunità A e da cinque subunità B; queste ultime sono in grado di legare un ganglioside con un residuo di acido sialico (GM1) particolarmente espresso dagli enterociti. Il legame promuove l'internalizzazione della subunità A, una proteina con attività ADP - ribosilante nei confronti di una proteina G stimolatoria, in grado di attivare l'adenilato-ciclasi. Gli elevati livelli di AMPc, portano a un rapido rilascio dei soluti nel lume intestinale; questi richiamano acqua e il quadro clinico connesso è la diarrea.

41 Tossina LT-1

42 E. coli Enterotossigeni (ETEC) STa è una tossina monomerica che lega la guanilato ciclasi e non l'adenilato ciclasi. Determinando un aumento di Guanosina-monofosfato ciclico (GMPc); Ciò causa iper-secrezione di fluidi dal lume intestinale. I geni che codificano per le tossine LT e ST si trovano in un plasmide, associati a geni che codificano per le adesine aggreganti AAF/1, AAF/2 e AAF/3, in grado di garantire una colonizzazione più duratura dei ceppi ETEC. La diarrea causata da tali ceppi si manifesta dopo 1-2 giorni di incubazione e dura fino a 3-4 giorni e con una sintomatologia simile a quella del colera ma più lieve. Tali tossine non causano alterazioni istopatologiche del tessuto intestinale che mantiene inalterata la sua morfologia. I geni codificanti tali tossine possono essere rilevati mediante tecniche di amplificazione ed ibridizzazione ed utilizzati per la tipizzazione.

43 E. coli Enteroinvasivi (EIEC) I ceppi EIEC sono strettamente affini al genere Shigella per caratteristiche fenotipiche e patogenicità, possono invadere e distruggere l epitelio del colon, causando diarrea sanguinolenta. Tali ceppi posseggono un plasmide in cui mappano i geni pinv i cui prodotti mediano l invasione dell epitelio del colon. I batteri sono internalizzati per endocitosi per attivazione di un T3SS e possono indurre lisi del vacuolo fagocitario e replicare nel citoplasma della cellula ospite. Successivamente passano agli enterociti adiacenti mediante la modulazione e riarrangiamento di filamenti di actina. Il meccanismo patogeno dei ceppi EIEC può causare alterazione morfologica del tessuto con ulcerazione del colon.

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45 E. coli Enteroemorragici (EHEC) I ceppi di E. coli Enteroemorragici sono i principali responsabili di malattia gastrointestinale nei paesi industrializzati. Si calcola che questi batteri causino > casi d'infezione e quasi 600 morti ogni anno negli USA. Circa 50 sierotipi causano malattia; tuttavia il sierotipo principalmente responsabile di patologia è il sierotipo O157:H7. Sono ceppi dall elevato potere infettante: l'ingestione di <100 bacilli può causare la malattia; A differenza degli altri ceppi patogeni di E. coli che riconoscono nell uomo l unico serbatoio naturale tali ceppi infettano i bovini in giovane età; La malattia nell uomo è infatti associata al consumo di: carne di manzo poco cotta, latte non pastorizzato, succhi di frutta non pastorizzati e verdura cruda contaminati. La malattia si manifesta a carico dell'intestino crasso dopo un periodo di incubazione di 3-4 giorni durante i quali inizia a comparire una diarrea non sanguinolenta. Dopo il terzo giorno compaiono forti dolori addominali accompagnati da diarrea sanguinolenta.

46 E. coli Enteroemorragici (EHEC) I ceppi EHEC sono in grado di causare danni istopatologici per distruzione dei microvilli, e sono produttori di 2 tossine: Stx-1 (identica alla tossina di Shigella); Stx-2 (60% di analogia alla tossina Shiga). Entrambe le tossine sono codificate da fagi lisogeni e hanno una subunità A e 5 subunità B, in grado di legarsi al recettore Gb3. Il legame con questo recettore promuove l'internalizzazione della subunità A nell'enterocita; Questa è in grado di legarsi all RNA ribosomiale 28S, bloccando la sintesi proteica. La distruzione degli enterociti, accompagnata da una diminuzione della capacità di assorbimento comporta la presenza di una diarrea molto liquida e sanguinolenta. Le tossine Stx sono in grado di stimolare la produzione di TNF-α e IL-6 che, oltre a sostenere il quadro infiammatorio, promuovono l'esposizione di Gb3. La ricerca delle tossine mediante saggi immunoenzimatici o sonde molecolari permette la diagnosi di infezione.

47 Ceppi EHEC e sindrome uremico-emolitica I ceppi EHEC possono determinare una sindrome uremico-emolitica, Si tratta di una anemia emolitica associata ad insufficienza renale e trombocitopenia, Per piastrinopenia (o trombocitopenia) si intende una quantità di piastrine (o trombociti) circolanti inferiore a /mm 3 ; spesso accompagnato da un rapido decremento anche dell emoglobina. La tossina Stx causa la formazione di trombi a livello dei capillari e infiammazione, La Stx circolante determina la sindrome, si lega al tessuto renale, dove il suo recettore glicoproteico è particolarmente rappresentato causando rigonfiamento glomerulare e deposizione di fibrina e piastrine a livello del microcircolo. Gli eritrociti vengono probabilmente lisati nel passaggio attraverso i capillari occlusi dai trombi e dagli immuno-complessi.

48 E. coli Enteroaggreganti (EAEC) Gli stipiti di E. coli enteroaggreganti sono coinvolti in una diarrea acquosa persistente nei viaggiatori e nei bambini soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Questi ceppi esprimono sia i pili a fascio Bfp che le adesine aggreganti AAF di tipo 1, 2 e 3 tutti codificati da un plasmide. II fattori di adesione sono in grado di promuovere la colonizzazione dell'intestino tenue, con stimolazione della produzione di muco. Si forma in tal modo un Biofilm in grado di aggregare e isolare i batteri dal microambiente dell ospite. In seguito all'aggregazione si ha riduzione della lunghezza dei microvilli seguita da infiltrazione ed emorragia. Probabilmente la loro azione è mediata dalla produzione di una citotossina, anche se la sua esistenza non è ancora stata dimostrata.

49 Salmonella Le Salmonelle sono parassiti patogeni intestinali; Asporigeni e aerobi facoltativi: Fermentano il glucosio e NON fermentano il lattosio; Producono gas: acido solfidrico; Riducono i nitrati; Posseggono flagelli peritrichi e sono tutte mobili; Infettano l uomo e numerosi animali selvatici e domestici; In corso di infezione si possono isolare dal sangue e da organi interni; Possono trovarsi nell ambiente esterno: nel suolo e nelle acque stagnanti di laghi e fiumi.

50 Salmonella La Classificazione Tassonomica delle Salmonelle è molto complessa ed è in continuo dinamismo: Analisi di omologia di sequenza hanno identificato due specie Salmonella enterica e Salmonella bongori Suddivise poi in Sierotipi o Serovar Oggi sono noti più di 2000 sierotipi Le sottospecie patogene per l uomo fanno parte della specie enterica. La classificazione di Salmonella spp. è effettuata mediante l identificazione degli antigeni di superficie O; H e Vi (variazione di fase). I diversi sierotipi di Salmonella differiscono in base allo spettro d ospite.

51 Patogenesi A causa della complessità nella classificazione di questo microrganismo ci sono oggi domande ancora irrisolte: Per quale motivo solo alcuni sierotipi, e di questi solo alcuni fagotipi, hanno importanza rilevante per la salute umana? Come mai la S. enteritidis si è adattata ai volatili come il pollame? Come si spiega la patogenicità d ospite? Dove si nasconde la Salmonella in latenza?

52 Patogenesi Questi e altri quesiti sul processo patogenetico della Salmonellosi rimangono senza una risposta definitiva, benché negli ultimi decenni sono state acquisite ipotesi scientificamente valide. Tuttavia, benché le ricerche sono state svolte prevalentemente sul topo e pochissimo sull uomo e gli animali domestici, parte della patogenesi di questo microrganismo oggi è stata compresa.