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2 Corso di Immunologia e Immunopatologia - II anno Lezione 16/04/2012 marco.cippitelli@uniroma1.it cippiskype Attivazione T, APCs e molecole accessorie. Il materiale presente in questo documento viene distribuito esclusivamente ad uso interno e per scopi didattici.

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4 I meccanismi di attivazione dei linfociti T vergini sono più complessi del semplice riconoscimento dell Ag. Non bastano i legami multipli ad alta avidità tra un TCR ed un complesso MHCpeptide per attivare il linfocita (segnale 1), né i corecettori CD4 o CD8. Sono necessari altri due tipi di segnali: 2) Segnali di costimolazione 3) Segnali dati dalle citochine (es. IL-2, IL-12 etc.)

5 The Two-Signal Model of T-cell Activation DC T cell CD4 or CD8 1 MHC TCR 2 COSTIMULATION

6 Due segnali sono richiesti per la completa attivazione dei T. Naïve lymphocytes need two signals to initiate responses Signal 1: antigen recognition Ensures that the response is antigen-specific Signal 2: microbes or substances produced during innate immune responses to microbes Ensures that the immune system responds to microbes and not to harmless antigenic substances Second signals for T cells are: costimulators on APCs and cytokines produced by APCs.

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8 Pathogen sensing induces APC activation and leads to T cell response

9 Linfociti T che incontrano un antigene su una non-activated professional antigen presenting cell, diventano inattivati. Anergia. inactivated

10 Linfociti T che incontrano un antigene su una non-activated professional antigen presenting cell, diventano inattivati. Anergia. Encounter of antigen in the absence of costimulation leads to tolerance. This is a major pathway of self-tolerance to peripheral antigens.

11 Costimolazione attraverso la signaling del CD28. In diverse condizioni, le dendritic cells forniscono questo segnale durante una risposta primaria.

12 Solo le cellule Dendritiche attivate esprimono le molecole B7, che trasmettono i segnali costimolatori più potenti.

13 Le molecole co-stimolatorie: Consentono la piena attivazione dei linfociti T Limitano la possibilità che il riconoscimento dell antigene su cellule non professioniste possa indurre una risposta contro il self (tolleranza periferica) Generano una risposta immunitaria appropriata, focalizzandola verso il non self aggressivo

14 I segnali di co-stimolazione: 1. Aumentano i segnali del TCR 2. Danno segnali diversi che: aumentano la sopravvivenza stimolano la proliferazione inducono e potenziano la secrezione di citochine

15 Il 2 segnale: Le molecole accessorie dei linfociti T Le molecole accessorie : Sono non polimorfiche ed invarianti cioe, a differenza del TCR, sono identiche su tutti i linfociti T La loro espressione o quella dei loro ligandi, espressi sulle APC, puo essere regolata nel tempo e nello spazio Potenziano la forza di adesione tra linfocita e APC Alcune molecole accessorie possono trasdurre segnali biochimici all interno del linfocita T Possono essere utili marcatori per identificare facilmente i linfociti T

16 Signals 1, 2 and 3 for T cell activation and differentiation. Both antigen-specific signals (signal 1) and co-stimulatory signals (signal 2) are required for T cell activation...signal 3 directs differentiation. What causes signal 1? The TCR binding to MHC plus (foreign) peptide What causes signal 2? B7 on the APC binding to CD28 on the T cell What causes signal 3? Signal 3 is delivered by cytokines from the APC or other cells. These cytokines are important for directing T cell differentiation into sub sets (e.g., TH1 or TH2 etc )

17 Signal 2: B7 on activated dendritic cell binds to CD28 on T cells 1 2 CD28 is the receptor B7 is the ligand Synapse between the T cell and the APC (dendritic cell) There are 2 forms of B7 B7.1 = CD80 B7.2 = CD86

18 A proposito di signal 3.. Citochine. The IL-2 Receptor (Interleukin = IL) Moderate affinity IL-2 receptor High affinity IL-2 receptor Activated T cell

19 IL-2 is key to antigen-induced T cell proliferation and differentiation IL-2 Autocrine stimulation (a cell makes a hormone that is secreted and stimulate the cell that made it) Cells divide 2-3 times per day for 4 or 5 day (2 12 = 4096) Espansione clonale! IL-2 used to be called T cell growth factor

20 Signal 1 without signal 2 leads to anergy or death. Signal 1 + signal 2 leads to activation. Activated or effector T cell 1+2 activates No signal 2 T cell becomes anergic Only antigens associated with inflammation activate T cells (antigen presented on activated APC); - self antigens inactivate anti-self T cells (maintenance of tolerance - peripheral tolerance!!). Thus, autoimmune diseases are usually avoided. Figure th edition

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22 Both trafficking and initial interactions of T cells with APC requires adhesion molecules

23 Complessità dell interazione LINFOCITI T/APC. T C e l l C D 28 B 7-1 / 2 L F A - 1 I C A M - 1 o r 2 C D 4 o r C D 8 T C R M H C C D 2 C D 40 L L F A - 3 C D 40 A P C o r T a r g e t C e l l Intermolecular Interactions Antigen recognition: Adhesion: Costimulation: Differentiation: TCR - peptide/mhc LFA-1 - ICAM-1 CD2 - LFA3 CD28 - B7 CD40 - CD40L

24 CD2 Glicoproteina della superfamiglia delle Ig Espressa: > 90% linfociti T maturi, 50-70% timociti, cellule NK Ligando: LFA3 (CD58) Lymphocyte Function Antigen-3 espresso su molti tipi cellulari Funzione: Molecola di adesione intercellulare e di trasduzione del segnale - Come il CD28 potenzia e costimola i linfociti T - Può compensare (in alcuni casi) l assenza del CD28

25 DC-SIGN della famiglia delle Lectine di Tipo C Espressa: principalmente sulle dendritiche Ligando: ICAM-3 e oligosaccaridi ad alto contenuto di mannosio Funzione: molecola di adesione intercellulare, media la migrazione delle DC e l attivazione dei linfociti T. Lega l HIV

26 Altre molecole coinvolte: il sistema CD40/CD40L Ruolo del CD40 nell attivazione dei linfociti T Il CD40L è indotto precocemente sulla membrana delle cellule T in seguito al riconoscimento del complesso Ag-MHC L interazione CD40-CD40L regola l espressione di B7 (1 e 2) e di citochine sulle APC

27 CD40/CD40L : Dendritiche Occhio!! Naive! Ora appare il CD40 L Effector!

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30 The B7:CD28 families APC T cell

31 B7:CD28 families T-cell activation: CD28 recognition of B7-1, 2 (naïve T-cells) ICOS recognition of ICOS-L (effector cells) T-cell inhibition: CTLA-4 recognition of B7-1, 2 PD-1 recognition of PD-L1, 2

32 CD28 costimulatory receptor Expressed on: almost all CD4+ 50% CD8+ Binds to: CD80 and CD86 (B7.1 and B7.2), on mature DC, activated B cells and macrophages Integrates signals of TCR/CD3 to gene activation P PTK (PI3-Kinase)

33 CD28 Signals: A major downstream signaling enzyme is PI3 kinase.

34 B7:CD28 dependence of T cells Initiation of T cell responses requires B7:CD28!! Dependence on B7-CD28: Naïve > Th1 > Th2 > memory CD4 > CD8 Regulatory T cells

35 Proliferation (CPM) Proliferation of memory T cells does not require costimulation by B7 Naive Memory 48 Hrs APCs wild type B7.1/2-/- no APCs Hrs OVA Peptide ( g/ml)

36 Major effects of CD28-mediated costimulation in T cells: Proliferation IL-2 (transcription, mrna stabilization) IL-2R up-regulation G1 cell cycle kinases Cell cycle inhibitor p27kip Survival Bcl-xL Effector function CD40-L, OX-40, 41BB, ICOS cytokines expression cytotoxic molecules The major effects of CD28-mediated costimulation are to augment and sustain T cell responses initiated by antigen receptor signal, by promoting T-cell survival and enabling cytokines to initiate T cell clonal expansion and differentiation.

37 The B7:CD28 families

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41 The B7:CD28 families

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43 CTLA-4 modulates activation of T cells by attenuating signal 2 Activated T cells put CTLA-4 on their surface thus limiting signal 2 effects

44 CD28 e CTLA-4 Funzioni:

45 The opposing functions of CD28 and CTLA-4 B7 CD28 B7-CD28 interaction APC TCR CTLA-4 Naïve T cell Proliferation, differentiation B7-CTLA-4 interaction Functional inactivation (anergy) Knockout of CTLA-4 results in autoimmune disease and loss of normal homeostasis: - multi-organ lymphocytic infiltrate, lethal by 3-4 weeks - lymphadenopathy, splenomegaly

46 Produzione di citochine Primed T cells (pg/ml) IL IFN-g IL DO.11/wild-type DAY DO.11/CTLA-4 -/-

47 Le funzioni inibitorie del CTLA-4 Role in self-tolerance: Autoimmunity and lymphoproliferation in knockout mice Polymorphism associated with autoimmune diseases in humans Blockade or deletion makes T cells resistant to tolerance, exacerbates autoimmune diseases (EAE, type 1 diabetes)

48 Come agisce il CTLA-4?? No Antigen Antigen CTLA-4 negative signal APCs TCR/CD3 Downstream targets activation CTLA-4 Binds JAK-2 SHP-2 PP2A catalytic subunit AP-2(endosome sorting) Associates with TCRz Engagement results in dephosphhorylation of proximal TCR signals TCRz, ZAP-70, LAT. Clonal unresponsiveness

49 La costimolazione CD28 PI3K GENERAZIONE DI FOSFO INOSITIDI FOSFORILATI. ATTIVAZIONE DI PROTEINE ADATTATRICI. ATTIVAZIONE DEL GENE DELL IL-2 ATTIVAZIONE DEL GENE DELL IL-2R STABILIZZAZIONE DELL mrna DELL IL-2 CONTROLLO DELLA SOPRAVVIVENZA CELLULARE CONTROLLO DEL RIARRANGIAMENTO

50 CTLA-4 lega il B7 con un affinità maggiore del CD28 CTLA-4 B7 TIROSINA FOSFATASI CHE SHP DEFOSFORILA LE TIROSINE E INTERROMPE I SEGNALI SEGUENTI ALLA FOSFORILAZIONE DELLE ITAM. P-

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52 The B7:CD28 families

53 Il pathway inibitorio di PD-1 PD-1 recognizes two ligands (PD-L1, PD-L2) Upregulated on T cells after activation Knockout of PD-1 leads to autoimmune disease (different manifestations in different strains) Role of PD-1 in T cell suppression in chronic infections?

54 Ruolo inibitorio di PD-1 eg. chronic infection Virus-specific T cells Viral clearance (spleen) In chronic LCMV infection in mice, virus-specific T cells become paralyzed; express high levels of PD-1; function restored by blocking the PD-1 pathway. Barber et al (Ahmed lab) Nature 2006

55 Ruolo dei recettori inibitori Maintenance of self-tolerance Immunosuppression in chronic infections (HCV, HIV?) Termination of normal immune responses? Why so many inhibitory pathways?

56 Homeostasis: Inoltre

57 Activation and attenuation signals controlling TCR-mediated T-cell function