CA 15-3 METODO IMMUNOENZIMATICO
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- Alice Benedetti
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1 CA -3 METODO IMMUNOENZIMATICO REF IE4 IVD CONT 96 det. USO PREVISTO Il kit CA -3 determina quantitativamente il CA -3 nel siero umano. Questo tipo di analisi è destinato all impiego diagnostico in vitro. INTRODUZIONE Il cancro del seno oggi è la più comune lesione maligna,minacciosa per la vita,nelle donne di molti paesi sviluppati,con approssimativamente 8. nuovi casi diagnosticati ogni anno.normalmente la metà di queste pazienti diagnosticate non presentano positività per noduli,comunque il 3% di questi casi progredisce verso malattia metastatica. Ci sono una serie di markers tumorali che possono aiutare i clinici ad identificare e diagnosticare quali pazienti con cancro al seno andranno incontro ad una malattia aggressiva e quali avranno un corso benigno.questi markers includono i recettori degli estrogeni e del progesterone,la ploidia DNA e il profilo di fase percento-s,i recettori del fattore di crescita epidermica,l oncogene HER-/neu,il gene soppressore dei tumori p3,la catepsina D,i markers proliferativi e il CA -3.Il CA -3 è il più utilizzato per monitorare pazienti in fase post-operatoria per possibili recidive,particolarmente per le metastasi.il 96% delle pazienti con recidiva locale e sistemica hanno valori elevati di CA -3,che possono essere usati per predire una recidiva prima dei controlli radiologici e clinici.un aumento del % nei valori di CA -3 nel siero è associato con la progressione del carcinoma. Una diminuzione del nei valori di CA -3 nel siero è associato ad una risposta positiva al trattamento.il CA -3 è più sensibile del CEA nella diagnosi precoce delle recidive del cancro del seno.in associazione col CA,è stato osservato che il CA -3 è utile nellaa diagnosi precoce della recidiva del cancro all ovaio. I livelli di CA -3 aumentano anche nei tumori del polmone,del colon e nei tumori epatici. PRINCIPIO DEL TEST Il kit CA -3 si basa sul principio del dosaggio in fase solida con l uso di un immunosorbent enzimaconiugato. Il dosaggio utilizza un anticorpo monoclonale diretto contro un distinto determinante antigenico della molecola intatta di CA -3 per immobilizzare la fase solida (sui pozzetti della micropiastra).un anticorpo di coniglio anti-ca -3 costituisce la soluzione di anticorpo-coniugato enzimatico (perossidasi di rafano). Il campione viene fatto reagire simultaneamente con i due anticorpi,per dare origine,nelle molecole di CA -3,ad una formazione a sandwich tra la fase solida e gli anticorpi enzima-coniugati.dopo due incubazioni distinte di un ora a 37 C, i pozzetti vengono lavati con acqua per rimuovere gli anticorpi marcati non legati. Una soluzione di reagente TMB viene aggiunta e incubata per minuti, dando come risultato lo sviluppo di un colore blu. Lo sviluppo del colore viene bloccato con l aggiunta di una Soluzione di Stopping,a dare un viraggio del colore dal blu al giallo.la concentrazione di CA -3 è direttamente proporzionale all intensità del colore nel campione. L assorbanza viene poi misurata spettrofometricamente a 4 nm. REAGENTI Materiali forniti con il kit: Micropiastra ( x 96 pozzetti) 8 x strips frazionabili,ricoperte con anticorpi monoclonali anti-ca -3. Set standards (. ml/vial) Ciascun flaconcino contiene CA -3 in siero bovino,alle concentrazioni di,,3,6, e 4 U/ml;pronti per l uso. IE4
2 Questi standards sono già prediluiti :.Non diluirli ulteriormente. Coniugato enzimatico concentrato x ( ml) Contiene anticorpo monoclonale anti-ca -3 conc.,coniugato con perossidasi di rafano,con conservanti. Diluente Coniugato enzimatico ( ml) Contiene siero bovino,tampone tris e conservanti. Diluente Campioni ( ml) Tampone tris e conservanti. TMB ( ml) Contiene 3, 3,, tetramethylbenzidine (TMB) stabilizzato in soluzione tampone,pronto per l uso. Stop Solution -N HCl ( ml) Soluzione diluita di acido cloridrico. Materiali richiesti ma non forniti: Pipette di precisione:,,, μl. Puntali monouso. Acqua distillata. Vortex mixer o agitatore equivalente. Carta assorbente. Carta per grafici. Lettore per microstrips o micropiastre. AVVERTENZE E PRECAUZIONI. ATTENZIONE: Questo kit contiene materiale di provenienza umana. Il materiale di partenza per produrre i componenti di questo kit è stato testato e risultato negativo per HbsAg, HIV / e HCV con metodi approvati FDA. Comunque, nessun metodo può completamente assicurare l assenza di questi agenti infettivi. Pertanto,come tutti i prodotti provenienti da sangue umano, inclusi i sieri dei campioni, devono esser considerati come potenzialmente infettivi. Manipolare, perciò, i reagenti secondo i normali comportamenti previsti dalle normative vigenti che disciplinano tale materia, se esistenti.. Evitare contatti con l HCl. Esso può causare irritazioni della pelle e bruciature. In caso di contaminazione, lavare con abbondante quantità d acqua e consultare un medico se l irritazione persiste. 3. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza e non mescolare o usare componenti provenienti da kits con lotti differenti. 4. Richiudere immediatamente i flaconi dopo l uso.. Non pipettare i reagenti con la bocca. 6. Per uso diagnostico. 7. Gli standards e il diluente campione contengono sodio azide che può reagire con piombo o rame dando origine ad azidi metalliche potenzialmente esplosive. CONSERVAZIONE. Conservare il kit non aperto a -8 C dopo l arrivo e quando non è in uso, fino alla data di scadenza riportata sull etichetta della confezione.. Conservare la micropiastra nella busta sigillata con l essiccante per minimizzare l esposizione all aria umida. STRUMENTAZIONE Per la lettura delle assorbanze è sufficiente un lettore di microstrips con larghezza di banda di uguale o inferiore a nm e con un range di densità ottica compreso tra e 3. (o superiore) alla lunghezza d onda di 4 nm. RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE Per eseguire questo test è richiesto l uso del siero.. Separare il siero dai coaguli entro 6 minuti dalla raccolta 3. Campioni che non possono essere testati entro 4 ore dalla raccolta devono essere congelati a C, e sono stabili fino a 6 mesi. 4 Evitare l uso di campioni che risultino fortemente emolizzati,lipemici o torbidi (dopo centrifugazione).. Non congelare e scongelare più volte i campioni. NON congelare in congelatori frost free, che possono causare occasionali scongelamenti. I campioni che sono stati congelati e quelli che sono torbidi o contengono particelle, devono essere centrifugati prima dell uso NOTE SULLA PROCEDURA. Raccomandazioni sul pipettamento (singolo e multi-canale): il pipettamento di tutti gli standards, campioni e controlli deve essere completato entro 3 minuti.. Tutti gli standards,i campioni e I controlli dovrebbero essere testate in duplicato simultaneamente, affinchè tutte le condizioni del dosaggio siano le stesse. 3. Si raccomanda di leggere le assorbanze dei pozzetti entro minuti dall aggiunta della stop solution. PREPARAZIONE REAGENTI. Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente (8- C) prima dell uso. IE4
3 . Tutti i reagenti devono essere miscelati delicatamente per inversione o agitazione prima dell uso, evitando la formazione di schiuma. 3. Per preparare la soluzione del Reagente Coniugato,aggiungere l intero contenuto del flaconcino del Coniugato Enzimatico conc. Al flacone contenente il Diluente del Coniugato e mescolare. Il Reagente Coniugato così preparato è stabile per 4 mesi se tenuto a 4 C: PROCEDIMENTO OPERATIVO I sieri dei pazienti e i controlli devono essere diluiti : con il Diluente Campioni,prima del loro utilizzo (mescolare μl di campione o controllo con. ml di Diluente Campione e mescolare.non DILUIRE GLI STANDARDS.. Fissare il numero necessario di pozzetti sul supporto per microstrips.. Pipettare μl di standards, campioni e controlli diluiti nei rispettivi pozzetti. 3. Mescolare per 3 secondi. E molto importante mescolare bene.. Incubare a 37 C per 6 minuti. 6. Aspirare la miscela d incubazione. 7. Lavare e aspirare i pozzetti volte con acqua distillata. (Non usare acqua di rubinetto.) 8. Asciugare bene su carta da filtro,capovolgendo la piastra,e assicurarsi che i pozzetti siano completamente asciutti. 9. Pipettare μl di Reagente Coniugato in tutti i pozzetti.. Incubare a 37 C per 6 minuti.. Lavare e aspirare i pozzetti come al punto 6.. Pipettare μl di TMB in tutti i pozzetti. Mescolare delicatamente per secondi. 3. Incubare a temperatura ambiente,al riparo dalla luce, per minuti. 4. Stoppare la reazione aggiungendo μl di Stop Solution in tutti i pozzetti.. Mescolare delicatamente per secondi. E importante assicurarsi che, dopo questa aggiunta,il colore della miscela viri dal blu al giallo. 6. Leggere le densità ottiche a 4 nm con un lettore di microstrips entro minuti.. Costruire una curva standard ponendo in grafico sull asse delle Y i valori medi delle assorbanze di ciascuno standard e sull asse delle X le rispettive concentrazioni in U/ml. 3. Interpolare sul grafico i valori medi delle assorbanze di ciascun campione per determinare la corrispondente concentrazione di CA -3 in U/ml. ESEMPIO DI CURVA STANDARD Risultati di una tipica curva standard sono riportati nella tabella sottostante. Questa curva standard è solo un esempio e non deve essere utilizzata per eseguire i calcoli. Ciascun laboratorio deve utilizzare la curva standard ottenuta nel corso del dosaggio effettuato. Absorbance (4 nm) CA Assorbanza (4 nm) Conc. of CA-3 CONTROLLO DI QUALITA E buona norma inserire in ogni seduta dei calibratori e dei controlli per verificare le performances del dosaggio. CALCOLO DEI RISULTATI. Calcolare il valore medio delle assorbanze (A 4 ) per ciascuno standard, controlli e campioni. 3 VALORI ATTESI In soggetti sani i livelli di CA -3 sono inferiori a 3 U/ml. CARATTERISTICHE TECNICHE. Sensibilità La minima dose determinabile di CA -3 con questo kit è U/ml. IE4
4 ORMONE CONCENTRAZIONE INTENSITA DI COLORE PRODOTTO EQUIV. A CA -3 NEL SIERO AFP, ng/ml, ng/ml, ng/ml, ng/ml, ng/ml Campione ng/ml 3 4 Numero PSA di ng/ml replicati, ng/ml, ng/ml Media CA -3,. ng/ml ( U/ml), ng/ml 9 S.D. CEA,. ng/ml 4., ng/ml , ng/ml Coefficiente PAP, di ng/ml variazione (%) CA CA 9-9, U/ml, U/ml, U/ml, U/ml, U/ml U/ml, U/ml Campione, U/ml 3 4 Numero, di U/ml Replicati, U/ml 47 Media di CA S.D Coefficiente di. 6.8 Variazione (%) Precisione a. Precisione Intra-Assay b. Precisione Inter-Assay Specificità Sono stati testati i seguenti ormoni per uno studio sulle cross-reattività: Conc. attesa Conc. ottenuta % Recovery Percentuale Recovery =96.% b. Linearità Su quattro campioni sono state eseguite diluizioni seriali con lo zero standard. La media di recovery è stata del 96.4%. # Diluizione Conc.attes a (U/mL). Non dil. :6. Non dil. 3. Non dil. 4. Non dil Conc.ott enuta (U/mL) % Recovery Media =.6 % Media = 93.8 % Media = 97. % Media = 9.8 % 4. Studi del recovery e della linearità a. Recovery Vari campioni di pazienti a conc. nota di CA -3 sono stati mescolati e dosati in duplicato.la percentuale di recovery è del 96.% Accuratezza Uno studio statistico che ha utilizzato 4 campioni di pazienti ha dimostrato una buona correlazione con altri kits commerciali disponibili come mostrato: La correlazione tra il kit CA -3 e il kit Truquant BR TM CA 7.9 RIA per fornisce i seguenti dati: N = 4 Coeff. di correlazione =.998 IE4
5 Slope =. Intercetta = 4.48 Media = 97 U/ml Media kit Truquant BR TM CA 7.9 RIA = U/ml LIMITI DELLA PROCEDURA. Valori ottimali e riproducibili si otterranno solo eseguendo attentamente la procedura,dopo aver letto attentamente le istruzioni per l uso.. La procedura dei lavaggi è critica. Un lavaggio insufficiente può causare una scarsa precisione e letture falsamente positive di assorbanza. 3. Non devono essere usati per questo dosaggio sieri che mostrano elevata lipemia,notevole emolisi o torbidità. 4. I risultati ottenuti con questo kit devono essere utilizzati in aggiunta ad altri test diagnostici e ad altre informazioni disponibili per il laboratorista SMALTIMENTO RIFIUTI Il prodotto deve essere smaltito secondo le locali normative in materia di gestione dei rifiuti 9 Nicholson, S., Richard, J., Sainsbury, C., et al., Epidermal growth factor receptor (EGFr); results of a 6 year follow-up study in operable breast cancer with emphasis on the node negative subgroup. Br. J. Cancer, 99; 63: 46-.Clin. Pathol., 99; 4: 6-. Veronese, S.M., Gambacorta, M., Detection of Ki-67 proliferation rate in breast cancer. Am. J. Clin. Pathol. 99; 9: Lotzniker, M., Pavesi, F., Scarabelli, M., Tumor associated antigens CA-3 and CA in ovarian cancer. Int. J. Biol. Markers, 99; 6: -. Attenzione,consultar e le istruzioni per l uso Solo per uso diagnostico in vitro Conservare a -8 C Indice dei Simboli N determinaz ioni per kit Usare entro Numero del lotto Fabbricante Rischio biologico REF Codice # NOTE BIBLIOGRAFICHE Aziz, D.C., Quantitation of estrogen and progesterone receptors by immunocytochemical and image analyses. Am. J. Clin. Pathol., 99; 98: -. Hilkens, J., Chapter : CA -3 Assay for the detection of episialin. In: Sell, S., ed. Serological Cancer Markers. Totowa, N.J.: The Humana Press; 99: Clark, G.M., Dressler, L.G., Owens, M.A., et al., Prediction of relapse or survival in patients with nodenegative breast cancer by DNA flow cytometry. N. Engl. J. Med., 989; 3: Elledge, R.M., McGuire, W.L., Prognostic factors and therapeutic decisions in axillary node-negative breast cancer. Annu. Rev. Med., 993; 44: -. Foekens, J.A., Rio, M-C., Seguin, P., et al., Prediction of relapse and survival in breast cancer patients by ps protein status. Cancer Research, 99; : Isola, J., Visakorpi, T., Holli, K., Kallioniemi, O-P., Association of p3 expression with other prognostic factors and long-term survival in node-negative breast cancer. J. Cell Biochem., 99; Suppl. 6D:. 7 Kute, T.E., Shao, Z-M., Sugg, N.K., et al., Cathepsin D as a prognostic indicator for node-negative breast cancer patients using both immunoassays and enzymatic assays. Cancer Research, 99; : McGuire, W.L., Tandon, A.K., Allred D.C., et al., How to use prognostic factors in axillary nodenegative breast cancer patients. J. Natl. Cancer Inst., 99; 8: 6-. Prodotto conforme alla direttiva 98/79 CE Rev. 7/4 Delta Chemie Biotechnology SaS Via Nuova Poggioreale, NA TEL/FAX: info@deltachemie.it IE4
CA 125 METODO IMMUNOENZIMATICO
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