QUANTA Lite TM Chromatin ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite TM Chromatin è un test immunoenzimatico per la ricerca semi-quantitativa di anticorpi anticromatina nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-cromatina può essere usata, insieme al quadro clinico del paziente ed al risultato degli altri test di laboratorio eseguiti, come aiuto nella diagnosi di lupus indotto da farmaci (DIL) e lupus eritematoso sistemico (LES). Riassunto e Spiegazione del test La cromatina si trova in natura nel nucleo delle cellule. E costituita da DNA nativo avvolto attorno agli istoni ottameri (H2A-H2B-H3-H4) 2, con associati anche l istone H1 ed alcune proteine non istoniche. Gli autoanticorpi anti-cromatina sono stati rilevati mediante una serie di tecniche comprendenti il test su cellule LE 1, immunoprecipitazione 2, immunofluorescenza su cellule con istoni estratti con acido e ricostituiti 3, ed ELISA. 4,5 Gli anticorpi anti-cromatina sono stati trovati soprattutto in soggetti affetti da LES, 3,6,7,8 DIL, 9,10 ed in alcuni casi in pazienti affetti da altre patologie. 11 Gli anticorpi anti-cromatina sono conosciuti anche come anticorpi anti-nucleosomi 5,8,11, anti-(h2a-h2b) DNA 9,13, anti-dnp 3,4, e fattore cellula-le 1,11. Uno dei principali scopi di questo test è la diagnosi del DIL. La presenza di anticorpi diretti sia contro gli istoni sia contro la cromatina è stata rilevata nei pazienti con lupus indotto da procainamide. 9,12,13 Tuttavia, anticorpi anti-istone sono presenti anche nei pazienti in trattamento con procainamide ma senza sintomi clinici riferibili a lupus. 9,13 Per contro, gli anticorpi anti-cromatina vengono trovati con frequenza molto minore ed a titoli più bassi in questi pazienti asintomatici. 9,13 Inoltre, i pazienti con lupus indotto da farmaci quali quinidina, penicillamina, metildopa ed acebutalolo risultano positivi per anticorpi anti-cromatina ma non per anticorpi anti-istone. 9,10 Pertanto, secondo i dati di questi studi pubblicati, gli anticorpi anti-cromatina rappresentano un marker più sensibile e più specifico per la diagnosi di lupus indotto da farmaci rispetto agli anticorpi anti-istone. E interessante notare che gli anticorpi anti-cromatina sono stati rilevati in pazienti che assumevano procainamide leggermente prima della comparsa dei sintomi clinici riferibili a lupus. 13 Alcuni studi eseguiti mediante test ELISA per gli anticorpi anti-cromatina hanno dimostrato che una percentuale compresa tra il 50% ed il 90% dei pazienti affetti da LES risulta positivo per la presenza di anticorpi anti-cromatina. 6,7,8 Questa è la stessa percentuale di positività rilevata con il test su cellule LE. 14 In generale, una percentuale maggiore di pazienti con LES risulta positiva per anticorpi anti-cromatina rispetto a quella che risulta positiva per anticorpi anti-istone o anti-dna. 6,7,8,11,14 La presenza di anticorpi anticromatina nei pazienti affetti da LES è stata inoltre associata a proteinuria. 1 Gli anticorpi anti-cromatina sono diretti contro epitopi comprendenti il complesso istoni nativi-dna, il DNA nativo e le regioni degli istoni che risultano esposte nella cromatina. 7,9,11 Pertanto, gli anticorpi anti-ndna sono una parte degli anticorpi anti-cromatina. Tuttavia, alcuni anticorpi anti-istone sono diretti contro epitopi degli istoni denaturati che non sono esposti nella cromatina. 11 Principio della Metodica La cromatina di timo di vitello altamente purificata formata da DNA avvolto attorno al core di istoni ottameri (H2A-H2B-H3-H4) 2 è adsorbita sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter (l istone H1 e le proteine non istoniche sono state rimosse dalla cromatina durante il processo di purificazione). I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anticromatina eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene cromatina purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani anti-cromatina, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per cromatina, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-cromatina, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per cromatina, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-cromatina, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 1

2 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo cromatina, ELISA debolmente positivo cromatina ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. 2

3 Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA cromatina (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo cromatina prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo cromatina prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo cromatina, Controllo ELISA fortemente positivo cromatina ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di cromatina usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo cromatina, ELISA fortemente positivo cromatina ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 3

4 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo cromatina, ELISA fortemente positivo cromatina ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo cromatina, ELISA fortemente positivo cromatina ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo cromatina prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo cromatina prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo cromatina prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo cromatina deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo cromatina servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo cromatina non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo cromatina e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo cromatina, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo cromatina (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo cromatina La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, moderatamente o fortemente positivo in base alla seguente tabella. Unità Negativo <20 Moderatamente Positivo Fortemente Positivo >60 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro cromatina e suggerisce la possibilità della malattia lupus indotto da farmaci (DIL) e lupus eritematoso sistemico (LES). 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi diretti contro cromatina anticorpi oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM della INOVA. I valori cromatina ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. 4

5 Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Non tutti i pazienti affetti da LES o con sintomatologia riferibile a lupus indotto da farmaci sono positivi per antibodies anti-cromatina. 3. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 4. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Range normale Sono stati testati 210 campioni appartenenti a volontari sani. La popolazione normale era costituita per il 68% circa da femmine con un età media di 38 anni. Il range di età andava da 18 a 75 anni. Inoltre, sono stati testati 29 pazienti cardiologici non in terapia con procainamide, abbinati come età e sesso a pazienti trattati con procainamide. Duecentootto campioni su 210 risultavano negativi con il test QUANTA Lite Chromatin ELISA, con una specificità pari al 99%. I due campioni normali risultati positivi avevano valori pari a 24 e 22 unità. Il valore soglia per la positività era < 20 unità. Il 90% dei sieri del pannello normale presentava valori uguali o inferiori a 10 Unità. Tutti i pazienti cardiologici risultavano negativi. Sensibilità e specificità relative Valutazione comparativa con il test Histone ELISA Nel test Histone ELISA, i singoli istoni denaturati (cioè. H1, H2A, H2B, H3 e H4) sono adsorbiti sulla parete dei pozzetti della piastra ELISA. Nel test, la cromatina legata all istone H1 (cioè l istone ottamero nativo (H2A-H2B-H3-H4) 2 avvolto con 145 paia di basi di DNA è adsorbita sulla parete dei pozzetti della piastra ELISA. Una dettagliata valutazione comparativa dei test ELISA per istone e per cromatina è contenuta nella voce bibliografica n.11. In breve, i due antigeni condividono alcuni epitopi importanti. In particolare, le code sensibii alla tripsina degli istoni, che sono esposte sian nella cromatina che negli istoni denaturati, sono in grado di legare gli anticorpi presenti sia nei pazienti affetti da LES sia in quelli con DIL. Tuttavia, gli epitopi compresi nel dimero nativo H2A-H2B o nel complesso (H2A-H2B)-DNA sono presenti solo nella cromatina e non negli istoni denaturati. Gli anticorpi presenti sia nei pazienti affetti da LES sia in quelli con DIL sono in grado di riconoscere questi epitopi. Per contro, alcuni epitopi che sono esposti negli istoni denaturati sono mascherati nella cromatina. Questi epitopi vengono riconosciuti dai pazienti in terapia con procainamide ma senza sintomi di lupus indotto da farmaci, rendendo più difficile l utilizzo del test Histone ELISA rispetto al per la diagnosi del DIL. La presenza di DNA nella cromatina fa sì che gli anticorpi presenti nei pazienti affetti da LES riconoscano più prontamente la cromatina rispetto agli istoni. Tuttavia, poichè gli anticorpi anti-dna sono rari nei soggetti non affetti da LES, virtualmente non ci sono risultati falsi positivi con la cromatina dovuti alla presenza di anticorpi anti-dna. Come descritto nelle due tabelle successive, il test è più sensibile e specifico rispetto al test Histone ELISA per la differenziazione dei pazienti sintomatici da quelli asintomatici in terapia con procainamide. Nei pazienti con sintomi riferibili a lupus, il test è risultato positivo in 20 of 26 casi mentre il test Histone ELISA risultava positivo solo in 19 casi. Un certo numero di questi campioni si dimostrava più reattivo con il test rispetto al test Histone ELISA. Nei pazienti trattati con procainamide ma asintomatici per sintomi riferibili a lupus, 17 campioni su 67 erano positivi con il test, e solo 4 erano fortemente positivi. Tuttavia, 34 risultavano positivi con il test Histone ELISA, e 21 di essi erano fortemente positivi. Pertanto, gli anticorpi anti-cromatina sono più utili rispetto agli anticorpi anti-istone per la differenziazione tra pazienti sintomatici ed asintomatici. 9,10,13 Valutazione comparativa dei pazienti sintomatici in terapia con procainamide con i test INOVA ed INOVA Histone ELISA. Pz. sintomatici n=26 Negativi Mod. Pos. Fort. Pos Histone ELISA Negativi Mod. Pos Fort. Pos Valutazione comparativa dei pazienti asintomatici in terapia con procainamide con i test INOVA ed INOVA Histone ELISA. Pz. asintomatici n=67 Negativi Mod. Pos. Fort. Pos Histone ELISA Negativi Mod. Pos Fort. Pos Il test si è dimostrato più sensibile rispetto al test Histone ELISA anche per la ricerca di pazienti affetti da LES. Una percentuale maggiore risultava positiva con il kit, e molti di questi pazienti presentavano una reattività maggiore. Questi risultati erano attesi in base ai risultati di alcuni studi pubblicati in letteratura. 6,7,8 Questi dati sono riassunti nella tabella successiva. 5

6 Valutazione comparativa dei pazienti affetti da LES con i test INOVA ed INOVA Histone ELISA. LES n=45 Negativi Mod. Pos. Fort. Pos Histone ELISA Negativi Mod. Pos Fort. Pos Sommando i dati contenuti nelle precedenti tabelle con quelli ottenuti con il pannello di sieri normali e con i controlli cardiologici si ottengono i valori di sensibilità e di specificità relativa del test paragonato al test Histone ELISA. Campioni totali Negativi Positivi Histone ELISA Negativi Positivi 28* 67 Sensibilità relativa = 70%. Specificità relativa = 98%. *Dei 28 campioni positivi con il test Histone ELISA ma negativi con il kit, 18 appartenevano a pazienti asintomatici in terapia con procainamide, 8 a volontari sani ed 1 ad un controllo cardiologico. Sensibilità e specificità clinica Cromatina Positivi Gruppo di pazienti Numero totale N. % Volontari sani % Lupus sintomatico indotto da procainamide % Pazienti asintomatici in terapia con procainamide % Pazienti cardiologici abbinati per età e sesso % LES % Sulla base di questo studio, la sensibilità clinica del test per DIL e per SLE è pari al 72% con una specificità clinica del 94%. Questi valori concordano con quelli segnalati in letteratura. 11 Precisione e riproducibilità Intra-test Per valutare la precisione intra-test del kit QUANTA Lite, 5 campioni sono stati testati 18 volte ciascuno su una singola piastra ELISA. Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 Media 61 U 49 U 91 U 75 U 133 U DS 2,9 U 2,7 U 4,1 U 5,2 U 5,1 U CV 4,8% 5,6% 4,5% 7,0% 3,9% Per valutare la precisione intra-test per i valori prossimi al valore soglia del test, 5 campioni sono stati testati 14 volte ciascuno su una singola piastra ELISA. Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 Media 22 U 26 U 30 U 22 U 21 U DS 0,9 U 1,4 U 1,4 U 0,9 U 0,9 U CV 4,3% 5,3% 4,5% 3,9% 4,4% Inter-test Per valutare la precisione inter-test, 5 campioni positivi sono stati testati una volta al giorno per 5 giorni diversi. Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 Media 67 U 57 U 110 U 84 U 167 U DS 4,3 U 4,1 U 8,6 U 4,7 U 10,2 U CV 6,4% 7,1% 7,8% 5,6% 6,1% 6

7 Bibliografia 1. Lachman PJ: An attempt to characterize the lupus erythematosus cell antigen. Immunology 4: , Robitaille P, et al.: Relationship between deoxyribonucleo-protein and deoxyribonucleic acid antibodies in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 52: , Fritzler MJ and Tan EM: Antibodies to histones in drug-induced and idiopathic lupus. J Clin Invest 62: , Halbert SP, et al.: Studies on autoantibodies to deoxyribonucleic acid and deoxyribonucleoprotein with enzyme immunoassay (ELISA). J Lab Clin Med 97: , Burlingame RW and Rubin RL: Subnucleosome structures as substrates in enzyme-linked immunosorbent assays. J Immunol Methods 134: , Karsh J, et al.: Anti-DNA, anti-deoxyribonucleoprotein and rheumatoid factor in patients with systemic lupus erythematosus, Sjogren s syndrome and rheumatoid arthritis. Int Arch Allergy Appl Immunol 68: 60-69, Burlingame RW, et al.: The central role of chromatin in the autoimmune responses to histones and DNA in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 94: , Chabre H, et al.: Presence of nucleosome-restricted antibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 38: , Burlingame RW and Rubin RL: Drug-induced anti-histone autoantibodies display two patterns of reactivity with substructures of chromatin. J Clin Invest 88: , Rubin RL, et al.: Autoantibodies associated with lupus induced by diverse drugs target a similar epitope in the (H2A-H2B)-DNA complex. J Clin Invest 90: , Burlingame RW: The clinical utility of antihistone antibodies: Autoantibodies reactive with chromatin in systemic lupus erythematosus and drug-induced lupus. Clin Lab Med 17: , Rubin RL: Autoantibody specificity in drug-induced lupus and neutrophil-mediated metabolism of lupus-inducing drugs. Clin Biochem 25: , Rubin RL, et al.: IgG but not other classes of anti[(h2a-h2)-dna] is an early sign of procainamideinduced lupus. J Immunol 154: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA September 2009 Revision 5 7